Pressão atmosférica Imagem Molecular de tecidos biológicos e Biofilmes por LAESI Espectrometria de Massa

Resumo

Laser de ionização electrospray ablação (LAESI) é uma fonte de íons na atmosfera de pressão para a espectrometria de massa. No modo de imagem, um sondas de laser infravermelho médio das distribuições de moléculas através de uma secção de tecido ou de um biofilme. Esta técnica apresenta uma nova abordagem para diversos estudos bioanalíticos realizadas sob condições experimentais nativa.

Resumo

Métodos de ionização ambiente em espectrometria de massa permitem investigações analíticas para ser realizada diretamente em um tecido ou biofilme sob nativo como condições experimentais. Laser de ionização electrospray ablação (LAESI) é um tal desenvolvimento e é particularmente adequado para a investigação de água contendo espécimes. LAESI utiliza um feixe de laser infravermelho médio (2,94 de comprimento de onda mm) para excitar as moléculas de água da amostra. Quando o limiar de influência da ablação é excedido, o material da amostra é expelido na forma de partículas e estes projéteis viajar para dezenas de milímetros acima da superfície da amostra. Em LAESI, esta pluma de ablação é interceptada por gotas altamente carregadas para capturar uma fração do material de amostra ejetado e converter seus constituintes químicos em fase gasosa íons. Um espectrômetro de massa equipados com uma interface de origem atmosférica pressão íon é empregado para analisar e registrar a composição dos íons liberados oriundos da área sondada (pixel) da amostra. A interrogação sistemática sobre uma matriz de pixels abre caminho para a imagem latente molecular no modo de análise de microssonda. Um aspecto único do LAESI imagem espectrometria de massa é de perfis de profundidade que, em combinação com a imagem lateral, permite imagens tridimensionais (3D) molecular. Com as atuais resoluções lateral e profundidade de ~ 100 mm e ~ 40 mM, respectivamente, LAESI imagem espectrometria de massa ajuda a explorar a estrutura molecular de tecidos biológicos. Aqui, revisamos os principais elementos de um sistema LAESI e fornecer orientações para uma experiência bem sucedida de imagem.

Protocolo

O protocolo a seguir descreve as principais etapas da ionização electrospray a laser de ablação (LAESI) experiência e oferece exemplos representativos de lateral e imagens tridimensionais (3D) para animais e amostras de tecidos de plantas. Detalhes adicionais experimental e técnicas podem ser obtidas em outro lugar. ^1-6

1. Preparação de tecido e de montagem

1. Se o corte é necessário, use um cryomicrotome para a secção de tecido em 1-10 mM fatias grossas de -10 a -20 ° C a menos que seja recomendado para um tipo de tecido particular.
2. Montar seções em uma superfície plana (por exemplo, quimicamente lâmina de vidro previamente limpo) diretamente sem modificadores químicos. Para os tecidos seccionados, descongele-mount as seções e segura o porta-amostras para um estágio de resfriamento Peltier, imediatamente após a descongelação de montagem para manter os tecidos congelados em todos os momentos durante a análise. Este passo é necessário para minimizar / impedir a migração molecular na seção.
3. Se necessário, use um dissipador de calor equipados com um ventilador de baixa potência para facilitar a remoção de calor do Peltier palco para manter o tecido congelado.
4. Em um ambiente úmido durante um período prolongado de tempo (1-2 horas), para inspecionar a condensação de água ou gelo sobre a superfície do tecido. Condensação de água no tecido negativamente afeta o desempenho de imagem em experimentos LAESI ^1.
5. Se necessário, use um desumidificador sala ou colocar a amostra resfriada em uma câmara ambiental preenchido com um gás inerte (por exemplo, o gás nitrogênio seco) para evitar a condensação ^1.

2. Otimização da Fonte Ion LAESI

A fonte de íons LAESI consiste de um laser infravermelho médio, uma série de elementos de óptica para direção de luz e foco, assim como porta-amostras adicionais, componentes de refrigeração, estágios de tradução, e um sistema de entrega de solvente. Figura 1 mostra o arranjo típico destes elementos com relação à entrada da fonte de íons atmosférica pressão de um espectrômetro de massa.

1. Como ilustrado na figura 1, a posição da amostra 15-20 milímetros abaixo do orifício do cone de amostragem espectrômetro de massa (d _OR-FP).
2. Operar um laser meados de IR em 2,94 mm e comprimento de onda 10 Hz taxa de repetição. Atenuar a saída do laser para ~ 100 μJ energia / pulso.
3. Use uma combinação de espelhos de ouro e uma lente com foco transparente no comprimento de onda do laser (por exemplo, um plano-convexa CaF ₂ ou ZnSe lente) para acoplar a energia pulso de laser para a amostra a incidência normal (ângulo de incidência ver direito com respeito à superfície da amostra na Figura 1).
4. Posição do feixe de infravermelho médio eixo 5-8 mm na frente do orifício do cone de amostragem espectrômetro de massa.
5. Ajustar a posição da lente com foco ea energia de pulso do feixe de laser para alcançar a remoção de tecido no ponto focal. As dimensões do volume ablated determinar o pixel (ou voxel em imagens tridimensionais) de tamanho para a aplicação de imagem.
6. Posição de um emissor nanospray em linha com o eixo de entrada do espectrômetro de massa e em uma distância da ponta de orifício para emissor de ~ 10 mm (ver Figura 1).
7. Para o electrospray, prepare solução de metanol 50% com 0,1% de ácido acético ou acetato de aditivo de amônio 0,1% para o modo de íon positivo ou negativo, respectivamente. Dependendo da amostra, outros solventes orgânicos, como acetonitrila, isopropanol, etc, pode substituir o metanol em concentrações apropriadas para a tarefa analítica. A estabilidade do electrospray é crucial para a imagem de sucesso. Dependendo da selecção do solvente, a taxa de fluxo ea tensão pulverização precisa ser ajustada para atingir pulverização estável.
8. Para reativa LAESI ⁶ em aplicações de imagem, a solução electrosprayed pode conter reagentes.
9. Use uma bomba de seringa para entregar a solução electrospray através do emissor electrospray a uma vazão de ~ 300 nL / min.
10. Se o orifício espectrômetro de massa é mantida a uma baixa tensão (<500 V medidos contra o chão), gerar electrospray através da aplicação de alta tensão diretamente para o emissor electrospray (eg, 3000 V) ou através de uma união metal. Caso contrário, terra diretamente emissor electrospray ou através da união de metal para estabelecer electrospray.
11. Operar a fonte electrospray no cone jet-pulverização modo de geração de íon mais eficiente por LAESI. Para o efeito de variáveis ​​operacionais sobre os modos de pulverização e seus efeitos sobre os espectros de massa, ver discussões em outros lugares. ^5,7,8
12. Ajustar cuidadosamente as distâncias relativas da configuração LAESI para otimizar o rendimento LAESI ion, mantendo o feixe de laser, o emissor, e os eixos orifício no mesmo plano. Por favor, encontrar instruções detalhadas em outros lugares. ⁵
13. Com um microscópio óptico, determine as dimensões laterais da cratera ablação na amostra.
14. Para tridimensional experimentos com imagens LAESI, a realização da ablação com pulsos individuais e determinar a profundidade de um voxel usando, por exemplo, o modo de z-stack em microscopia óptica. ³

3. Imagem Molecular e Análise de Dados

No experimento de imagem, a amostra de tecido é movido no plano focal do laser em X e Y direções com tamanhos de passo maior do que ou iguais às dimensões do local de ablação. A resolução espacial é limitada pela focalização do feixe de laser incidente.

1. Selecione a área de interesse na superfície da amostra e obter o (X, Y) coordenadas dos limites correspondentes.
2. Escolheu um algoritmo gridding (eg, adaptação de grade, imagem região selecionada, grade retangular, espiral, Z digitalização, etc) com o qual raster a superfície da amostra selecionada, com tempo de permanência em cada pixel sobre a área a ser trabalhada.
3. Use um estágio tradução de três eixos e software que é capaz de rastering a amostra de acordo com a grelha pré-determinado.
4. Calcule o tempo total necessário para geração de imagens.
5. Desativar os dados limite de tempo de aquisição do espectrômetro de massa. Se isso não for possível, definir o prazo de aquisição de dados com o valor calculado imagem tempo.
6. Iniciar a fonte de laser infravermelho médio uma taxa de repetição adequada para produzir a relação sinal-ruído suficiente no espectro de massa dentro do tempo de permanência em cada pixel para realizar um experimento de imagem LAESI lateral. Para a imagem latente molecular 3D, use uma taxa de aquisição de espectro maior do que a taxa de repetição do laser fonte com sucesso em massa analisar os íons gerados dentro de um único pulso de laser. Aguarde o sinal de partida para iniciar a seqüência ablação.
7. Ligue a fonte de electrospray. Certifique-se que não há solução suficiente durante todo o tempo necessário para geração de imagens.
8. Simultaneamente iniciar a aquisição de espectros de massa, a ablação a laser meados de IR, ea varredura de superfície.
9. Quando a execução de imagens terminar, parar a varredura de superfície, o lasing meados de IR, ea aquisição de dados.
10. Desabilitar a fonte laser.
11. Desligue a alta tensão.
12. Desligue a bomba de seringa.
13. Definir o espectrômetro de massa para o modo STANDBY.
14. Desligue o sistema eletrônico de refrigeração Peltier.
15. Fechar o fluxo de gás inerte, se usado.
16. Use um software para correlacionar as coordenadas absolutas dos pixels na imagem lateral ou os voxels na análise 3D com os espectros correspondentes.
17. Plotar a intensidade de sinal de íons para selecionar o valor m / z contra o coordenadas absolutas de análise para obter lateral e imagens 3D molecular.

4. Resultados representante

A Figura 2 apresenta resultados representativos para alguns tipos de tecidos importantes e modalidades de imagem. Um painel retrata um caso para uma seção de tecido animal que tenha sido congelada durante o experimento para evitar a desidratação. ¹ Além disso, a amostra foi localizado em um ambiente seco gás nitrogênio para evitar vapores de água ambientes de condensação na superfície da amostra. Uma seção de 100 m de espessura coronal de um cérebro de rato (Rattus norvegicus) foi fotografada com LAESI lateralmente. As regiões anatômicas do cérebro (veja a imagem óptica no painel A) apresentam boa correlação com a imagem molecular obtido para o PC plasmalógenos (O-33: 3) e / ou PE (O-36: 3) com m / z 728,559.

Painel B mostra a imagem LAESI 3D de uma planta Zebra (Aphelandra squarrosa) tecido foliar. Porque as folhas possuem um mecanismo natural de defesa contra a desidratação, a amostra poderia ser interrogado no ambiente ambiente. ³ As imagens 3D obtidas molecular revelou uma variedade de padrões de distribuição de metabólitos primários e secundários. Entre outros, acacetin com m / z 285,076 foi detectada na maior contagem de íons nos setores amarelo da segunda e terceira camadas de cima com uma distribuição homogênea nos outros. Esta distribuição concordou com o padrão da variegação visto na imagem óptica.

Figura 1. Esquemática do sistema LAESI (ES, electrospray ponta emissor; OR, orifício do cone espectrômetro de massa de amostragem; FL, com foco da lente; FP, ponto focal; P, Peltier estágio de resfriamento; HS, dissipador de calor). Uma parte do material particulado expelido durante meados de IR de ablação (pontos vermelhos) funde com o electrospray para produzir gotas cobrado semeado com íons e moléculas da amostra (pontos verdes). Os íons liberados essas gotículas são analisados ​​e registrados pelo espectrômetro de massa.

Figura 2. Resultados representativos para Imagi lateral e 3D. ng com LAESI espectrometria de massa (A) O painel superior mostra a imagem óptica de um cérebro de rato (Rattus norvegicus) seção coronal ea imagem molecular obtido para o PC plasmalógenos (O-33: 3) e / ou PE (O-36 : 3) com m / z 728,559. A barra de escala em branco corresponde a 1 mm. Adaptado com permissão de (referência ^1). Copyright 2010 American Chemical Society. (B) O painel inferior mostra a imagem 3D de uma folha de uma planta variegada Zebra (Aphelandra squarrosa). Acacetin com m / z 285,076 foi detectada na maior contagem de íons nos setores amarelo da segunda e terceira camadas de cima com uma distribuição homogênea nos outros. Reproduzido com permissão do (Referência ^3). Copyright 2009 da Sociedade Americana de Química.

Discussão

Diferentes tipos de tecidos apresentam diferentes teores de água e resistência à tração, que, por sua vez, pode afetar as características de ablação das amostras. ⁹ Para atenuar esses efeitos, é desejável que os protocolos a fluência do laser, a manipulação da amostra, ea análise deve ser revisto quando se muda entre principais tipos de tecido.

Única célula ou para investigações de alta resolução, a luz infravermelho médio pode ser acoplado em uma fibra óptica afiada em vez de uma lente de foco. ¹⁰ Ao posicionar a ponta de fibra nas proximidades das células selecionadas em um tecido, a análise LAESI pode ser executada em um nível de uma única célula.

Como um rótulo sem fonte de íons para a espectrometria de massa de ionização do ambiente, ¹¹ LAESI tem mostrado grande potencial para a investigação de processos bioquímicos nos tecidos. Com os benefícios adicionais de análise direta, lateral e de imagem 3D, LAESI é uma ferramenta para criação de perfis emergentes bioanalíticos, bem como aplicações de imagem.

Materiais

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mass spectrometer		Waters Co. (Milford, MA)	Q-TOF Premier
Mid-IR laser		Opotek Inc. (Carlsbad, CA)	Vibrant IR