Atmosferik basınç Moleküler Görüntüleme LAESI Kütle Spektrometresi Biyolojik Dokular ve Biyofilmler

Özet

Lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) kütle spektrometresi bir atmosferik basınçlı iyon kaynağı. Görüntüleme modunda, orta-kızılötesi lazer probları bir doku bölüm veya bir biyofilm boyunca moleküllerin dağılımları. Bu teknik, doğal deneysel koşullar altında yürütülen çeşitli biyoanalitik çalışmalar için yeni bir yaklaşım sunuyor.

Özet

Kütle spektrometresi Ortam iyonizasyon yöntemleri analitik incelemeler anadili gibi deneysel koşullar altında bir doku ya da biyofilm doğrudan yapılmasına izin verir. Lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) böyle bir gelişme ve özellikle su içeren örneklerin soruşturma için çok uygundur. LAESI numune su moleküllerini harekete geçirerek bir orta-kızılötesi lazer ışını (2.94 mikron dalga boyu) kullanır. Ablasyon fluens eşik aşıldığında, örnek malzeme, partiküler madde şeklinde ihraç ve bu mermiler milimetre onlarca örnek yüzey üzerinde yolculuk. LAESI, bu ablasyon tüy çıkarılır örnek malzemenin bir kısmını yakalama ve gaz faz iyonları içine kimyasal maddelerin dönüştürmek için yüksek ücret damlacıkları tarafından durdurulur. Atmosferik bir iyon kaynağı arayüzü ile donatılmış bir kütle spektrometresi örnek probed alanı (piksel) kaynaklanan serbest iyonların kompozisyon analiz ve kayıt için kullanılmaktadır. Piksel bir dizi üzerinden sistematik bir sorgulama mikroprobu analiz modunda moleküler görüntüleme için bir yol açılır. LAESI kitle spektrometrik görüntüleme benzersiz bir yönü, lateral görüntüleme ile birlikte, üç boyutlu (3D) moleküler görüntüleme sağlayan, derinlik profil. ~ 100 mikron ve sırasıyla ~ 40 mm, lateral ve derinlik kararları, LAESI kitle spektrometrik görüntüleme, moleküler biyolojik dokuların yapısını keşfetmek için yardımcı olur. Burada, bir LAESI sistemin en önemli unsurları gözden geçirmek ve başarılı bir görüntüleme deney için yönergeler sağlamak.

Protokol

Aşağıdaki protokol lazer ablasyon elektrosprey iyonizasyon (LAESI) deneyi en önemli adımları açıklar ve hayvan ve bitki doku örnekleri için lateral ve üç boyutlu (3B) görüntüleme için temsilcisi örnekler sunar. Ek deneysel ve teknik detayları başka bir yerden temin edilebilir. ^1-6

1. Doku Hazırlık ve Montaj

1. Kesit gerekiyorsa, doku -20 -10 10-100 mikron kalınlığında dilimler halinde bölümüne cryomicrotome kullanmak ° C aksi takdirde belirli bir doku tipi için önerilir sürece.
2. Bölümleri kimyasal değiştiriciler olmadan doğrudan düz bir yüzeye (örneğin, kimyasal olarak önceden temizlenmiş cam slayt) üzerine monte edin. Kesitli dokular için, çözülme montaj, her zaman dondurulmuş doku analizi sırasında tutmak için üzerine bölümlerde çözülme-montaj ve hemen Peltier soğutma aşamasında numune tutucu güvenli. Bu adım bölümünde moleküler göçü en aza indirmek / önlemek için gereklidir.
3. Gerekirse, doku dondurulmuş korumak için Peltier aşamalı ısı kaldırılmasını kolaylaştırmak için düşük bir güç fan ile donatılmış bir ısı emici kullanın.
4. Süre (1-2 saat) uzun bir süre nemli bir ortamda, su veya doku yüzeyinin buz yoğuşma için kontrol edin. Doku üzerinde su yoğuşması detrimentally LAESI deneyler, görüntüleme performansını ^etkiler. 1
5. Gerekirse, bir oda nem alıcı veya yoğuşmayı önlemek için, bir inert gaz (örneğin, kuru azot gazı) ile dolu bir çevre odasında soğutmalı örnek bir ^yer. 1

2. LAESI İyon Kaynak optimizasyonu

LAESI iyon kaynağı, orta-kızılötesi lazer, ışık direksiyon optik elemanlar bir dizi ve odaklama yanı sıra ek örnek sahipleri, soğutma bileşenler, çeviri aşamaları ve çözücü bir dağıtım sistemi oluşur. Şekil 1, bu unsurların, bir kütle spektrometre atmosferik basınçlı iyon kaynağı girişinde açısından tipik bir düzenleme göstermektedir.

1. Şekil 1, konumu, kütle spektrometresi örnekleme konisi _{(d OR-FP)} orifis aşağıdaki örnek 15-20 mm gösterildiği gibi .
2. 2.94 mikron dalga boyu ve 10 Hz tekrarlama oranı orta-kızılötesi lazer çalıştırın. ~ 100 μJ / pulse enerji lazer çıktı zayıflatır.
3. Çift, normal insidansı numunenin içine lazer darbe enerjisi (örnek yüzeyine göre doğru insidansı açısını görmek için lazer dalga boyu (örneğin, bir yüzü düz diğeri dışbükey CaF ₂ veya ZnSe lens) saydam altın aynalar ve odaklama lens kombinasyonunu kullanın Şekil 1).
4. Kütle spektrometresi örnekleme koni delikli ön orta-kızılötesi ışın ekseni 5-8 mm yerleştirin.
5. Odaklı lens pozisyonu ve odak noktası doku çıkarılması elde etmek için lazer ışınının darbe enerji ayarlayın. Ablasyon hacim ölçüleri görüntüleme uygulaması için (ya da üç boyutlu görüntüleme voksel) piksel boyutunu belirlemek.
6. Nanospray yayıcı bir kütle spektrometresi giriş ekseni doğrultusunda ve yaklaşık 10 mm'lik bir delik-emiter ucu mesafesi (bkz. Şekil 1) yerleştirin.
7. Elektrosprey için, sırasıyla,% 0.1 asetik asit veya% 0.1 pozitif ya da negatif iyon modu için amonyum asetat katkı,% 50 metanol çözeltisi hazırlamak. Asetonitril, isopropanol, vb gibi diğer organik çözücüler, örnek bağlı olarak, analitik bir görev için uygun konsantrasyonlarda metanol yerini alabilir. Elektrosprey istikrar başarılı görüntüleme için çok önemlidir. Solvent seçimi bağlı olarak, akış hızı ve püskürtme voltaj istikrarlı sprey ulaşmak için ayarlanması gerekir.
8. Reaktif LAESI ⁶ için görüntüleme uygulamaları, electrosprayed çözüm reaktanları içerebilir.
9. ~ 300 nL / dak akış hızında elektrosprey yayıcı ile elektrosprey çözüm sunmak için bir şırınga pompası kullanın.
10. Eğer kütle spektrometresi orifis düşük voltaj (<500 V zemin karşı ölçülen) tutulur, yüksek voltaj uygulayarak elektrosprey emitör (örneğin, 3000 V) doğrudan ya da metal bir sendika aracılığıyla elektrosprey oluşturur. Aksi takdirde, elektrosprey kurmak için doğrudan elektrosprey yayıcı veya metal sendikası aracılığıyla zemin.
11. Koni jet elektrosprey kaynak LAESI tarafından en verimli iyon üretimi için püskürtme modunda çalıştırın. Kütle spektrumları püskürtme modları ve etkileri işletim değişkenlerin etkisi, başka yerde tartışmalar görüyorum. ^5,7,8
12. Dikkatle LAESI iyon verim için optimize etmek için, lazer ışını, yayıcı ve delik eksenleri aynı düzlemde tutarken LAESI kurulum izafi mesafeleri ayarlayın. Başka bir yerde ayrıntılı talimatlar bulabilirsiniz. ⁵
13. Optik bir mikroskop ile, örnek ablasyon kraterin lateral boyutlarını belirlemek.
14. LAESI üç boyutlu görüntüleme deneyleri için, bireysel darbeleri ile ablasyon gerçekleştirmek ve örneğin kullanarak voksel derinliğini belirler, optik mikroskop z yığın modu ³

3. Moleküler Görüntüleme ve Veri Analizi

Görüntüleme deneyde, doku örneği lazer ablasyon spot boyutları eşit veya daha büyük adım boyutları ile X ve Y yönlerinde odak düzlemli taşınır. Mekansal çözünürlükte olay lazer ışını odaklanarak sınırlıdır.

1. Numune yüzeyinden ilgi alanı seçin ve (X, Y) ilgili sınırların koordinatları elde edilir.
2. Görüntülenecek alana her pikselin bekleme süresi seçilen örnek yüzey tarama ile gridding algoritma (örneğin, adaptif ızgara, seçili bölgeyi görüntüleme, dikdörtgen bir ızgara, spiral desen, Z tarama, vb.) Seçti.
3. Üç eksenli bir çeviri aşamasında ve önceden belirlenmiş ızgaraya göre örnek rastering yeteneğine sahip bir yazılım kullanın.
4. Görüntüleme için gerekli olan toplam süreyi hesaplayın.
5. Kütle spektrometresi veri toplama zaman sınırı devre dışı bırakın. Bu mümkün değilse, veri toplama zaman sınırı hesaplanan görüntüleme zaman değeri ayarlayın.
6. LAESI lateral görüntüleme deney gerçekleştirmek için her piksel, bekleme süresi içinde kütle spektrumu yeterli sinyal-gürültü oranı üretmek için uygun bir tekrarlama oranı orta-kızılötesi lazer kaynağı başlayın. 3 boyutlu moleküler görüntüleme için, başarılı bir şekilde tek bir lazer darbe içinde üretilen iyonlar kütlelerine analiz etmek için lazer kaynağı tekrarlama oranı daha yüksek bir spektrum alma hızı kullanın. Ablasyon dizisi başlatmak için START sinyali bekleyin.
7. Elektrosprey kaynağı açın. Görüntüleme için gerekli olan tam zamanlı için yeterli bir çözüm olduğundan emin olun.
8. Aynı zamanda kitle spektrumlarının satın alma, orta-IR lazer ablasyon, ve yüzey tarama BAŞLAT.
9. Görüntüleme çalışması tamamlandığında, STOP yüzey tarama, orta-IR lazer uygulaması ve veri toplama.
10. Lazer kaynağı devre dışı bırakın.
11. Yüksek gerilim kapatın.
12. Şırınga pompası kapatın.
13. STANDBY kütle spektrometresi ayarlayın.
14. Peltier soğutma elektroniği kapatın.
15. Kullanılan inert gaz akışı kapatın.
16. Ilgili spektrumları ile 3D analiz lateral görüntüleme veya vokseller piksel mutlak koordinatları ilişkilendirmek için bir yazılım kullanın.
17. Lateral ve 3 boyutlu moleküler görüntüler elde etmek için analiz mutlak koordinatları karşı seçilen m / z değeri için iyon yoğunluğu sinyal çizilir .

4. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 2, bazı önemli doku tipleri ve görüntüleme yöntemleri için temsili sonuçlar verir. Panel A, deney sırasında su kaybını önlemek için dondurulmuş hayvan doku bölümü için bir durumda gösteriyor. Buna ek ^olarak 1, örnek numune yüzeyinden yoğuşmasız ortam su buharları önlemek için kuru azot gazı ortamında yer oldu . Sıçan beyin 100 mikron kalınlığında koronal bölümünde (Rattus norvegicus) yanal LAESI ile görüntülendi. Anatomik bölgelerde (beyin panelinde optik görüntü A) moleküler plasmalogens PC için elde edilen görüntü (O-33: 3) ile iyi bir korelasyon gösterir ve / veya PE (O-36: 3) m / z 728,559 .

B Paneli Zebra bitki (Aphelandra squarrosa) yaprak doku 3D LAESI görüntüleme gösterir. Yaprakları dehidratasyon karşı doğal bir savunma mekanizmasına sahip oldukları için, örnek ortamda sorgulanabilir. ³ elde edilen 3 boyutlu moleküler görüntüleri, birincil ve ikincil metabolitleri bir dağıtım desen çeşitliliği ortaya . Diğerlerinin arasında, m / z 285,076 acacetin diğerleri homojen bir dağılım ile ikinci ve üçüncü katlar sarı sektörlerde yüksek iyon sayıları tespit edildi. Bu dağılım deseni ile optik görüntü görülen renklilikte kabul etti.

Şekil 1. LAESI sistemi şematik (ES, elektrosprey emiter ucu; OR, kütle spektrometresi örnekleme koni orifis; FL, objektif odaklama, FP, odak noktası; P, Peltier soğutma aşamasında; HS, soğutucu). Örnek moleküller ve iyonlar (yeşil noktalar) numaralı seribaşı yüklü damlacıklar verim elektrosprey ile orta-IR ablasyon (kırmızı nokta) pekişen sırasında sınırdışı partikül madde bir kısmı. Bu damlacıklar serbest iyonlar kütle spektrometresi ile analiz edilir ve kaydedilir.

Şekil 2. Lateral ve 3D hayal gücüyle Temsilcisi sonuçlarya da PE (O-36 ve / ng LAESI kütle spektrometresi ile (A) üst panelde sıçan beyin (Rattus norvegicus) koronal bölümünde ve plasmalogens PC için elde edilen moleküler görüntü optik görüntü gösteriyor (3 O-33) : 3) m / z 728,559. 1 mm beyaz ölçek çubuğu için karşılık gelir. (Referans ¹⁾ izni ile uyarlanmıştır. Copyright 2010 American Chemical Society. (B) alt panel, rengârenk Zebra bitki (Aphelandra squarrosa) bir yaprak 3D görüntüleme gösterir . M / z 285,076 Acacetin diğerleri homojen bir dağılım ile ikinci ve üçüncü katlar sarı sektörlerde yüksek iyon sayıları tespit edildi. (Referans ³⁾ izni ile yayımlanmaktadır. Copyright 2009 American Chemical Society.

Tartışmalar

Farklı doku tiplerinin bu etkileri azaltmak için, sırayla, numunelerin ablasyon özellikleri etkileyebilir su içeriği ve çekme ^gücü, 9 farklı sergi, lazer akıcılık, numune işleme ve analiz protokolleri arasında değişen yaparken revize edilmesi istenen büyük doku tiplerinin.

¹⁰ seçili hücrelerin doku yakınlığı içinde, fiber ucunun konumlandırma, tek bir hücre ya da daha yüksek çözünürlüklü incelemeler için, orta-kızılötesi ışık yerine odaklama lens ucu sivriltilmiş bir fiber optik içine birleştiğinde olabilir. LAESI analiz yapılabilir . bir tek hücre düzeyinde.

Ortam iyonizasyon kütle spektrometresi için bir etiket-iyon kaynağı olarak, ¹¹ LAESI dokularda biyokimyasal süreçlerin incelenmesi için büyük bir potansiyel göstermiştir. LAESI katma faydaları ile doğrudan analizi, yan ve 3D görüntüleme, profil yanı sıra görüntüleme uygulamaları için gelişmekte olan bir biyoanalitik araçtır.

Malzemeler

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mass spectrometer		Waters Co. (Milford, MA)	Q-TOF Premier
Mid-IR laser		Opotek Inc. (Carlsbad, CA)	Vibrant IR