Атмосферное давление молекулярной визуализации биологических тканей и биопленки на LAESI масс-спектрометрии

Резюме

Лазерной абляции электрораспылением ионизации (LAESI) является атмосферного давления источника ионов для масс-спектрометрии. В режиме отображения, средней инфракрасной лазерной зондов распределения молекул по разделу ткани или биопленки. Эта техника представляет собой новый подход для различных биоаналитических исследований, проведенных под родной экспериментальных условиях.

Аннотация

Окружающие методы ионизации в масс-спектрометрии позволяет аналитических исследований, выполняемых непосредственно на ткани или биопленки под родной подобных экспериментальных условиях. Лазерной абляции электрораспылением ионизации (LAESI) является одним из таких развития и особенно хорошо подходит для изучения водосодержащих образцов. LAESI использует середине инфракрасного лазерного луча (2,94 мкм длины волны) для возбуждения молекул воды образца. При достижении порога абляции влиянием превышения образец материала выбрасывается в виде твердых частиц, и эти снаряды путешествия до десятков миллиметров выше поверхности образца. В LAESI, это абляции шлейф, перехватывается высоко заряженных капель, чтобы захватить часть выброшенного материала образца и конвертировать его химические компоненты в газовой фазе ионов. Масс-спектрометр оснащен атмосферным давлением интерфейс источник ионов используется для анализа и записи состав выпустил ионов, происходящих из исследовали область (пиксел) образца. Систематическое допроса в течение массив точек открывает путь для молекулярной визуализации в режиме микрозондового анализа. Уникальный аспект LAESI масс-спектрометрического визуализации глубины профилирования, что, в сочетании с боковыми изображениями, дает возможность трехмерного (3D) молекулярной визуализации. При нынешних боковой и глубину резолюции ~ 100 мкм и ~ 40 мкм, соответственно, LAESI масс-спектрометрических изображений позволяет исследовать молекулярные структуры биологических тканей. Здесь мы рассмотрим основные элементы системы LAESI и разработать руководящие принципы для успешного эксперимента изображений.

протокол

Следующий протокол описывает основные шаги электрораспылением лазерной абляции ионизации (LAESI) эксперимента и дает показательные примеры для боковой и трехмерных (3D) изображений животных и образцы растительной ткани. Дополнительные экспериментальные и технические детали могут быть получены из других источников. ^1-6

1. Подготовка тканей и монтаж

1. Если секционирования необходимо, используйте cryomicrotome раздел ткани в 10-100 мкм ломтиками при температуре от -10 до -20 ° С, если иное не рекомендовано для определенного типа ткани.
2. Горы разделы на плоскую поверхность (например, химически предварительно очищенное стекло) непосредственно, без химических модификаторов. Для секционного тканей, оттепель крепления секций и безопасный держатель образца с Пельтье-охлаждением этапе сразу же после оттепели монтажа держать замороженные ткани во все времена во время анализа. Этот шаг необходим, чтобы минимизировать / предотвращения молекулярной миграции в разделе.
3. Если необходимо, используйте радиатор оснащен маломощный вентилятор для облегчения отвода тепла от Пельтье этапе для поддержания тканей заморожены.
4. В условиях повышенной влажности в течение длительного периода времени (1-2 часа), осмотрите для конденсации воды или льда на поверхности ткани. Конденсации воды на ткани пагубно влияет на производительность визуализации в экспериментах LAESI ^1.
5. Если необходимо, используйте осушитель комнату или место охлаждением образца в экологические камере, заполненной инертным газом (например, сухого газа азота) для предотвращения образования конденсата ^1.

2. Оптимизация Источник Ион LAESI

Источник LAESI ион состоит из середины инфракрасного лазера, серию оптических элементов для легкой рулевого управления и фокусировки, а также дополнительные держатели образцов, охлаждение компонентов, перевод стадии, и растворитель системы доставки. Рисунок 1 демонстрирует типичное расположение этих элементов по отношению к входу атмосферного давления ионный источник масс-спектрометра.

1. Как показано на рисунке 1, положение образца 15-20 мм ниже отверстия выборки масс-спектрометр конуса (D _ИЛИ-FP).
2. Эксплуатация среднего ИК-лазером на длине волны 2,94 мкм и 10 Гц частота повторения. Ослабления излучения лазера до ~ 100 мкДж / импульс энергии.
3. Используйте сочетание золотого зеркала и фокусирующей линзы прозрачные на длины волны лазерного излучения (например, плоско-выпуклую CaF ₂ или ZnSe объектива) для соединения энергии лазерного импульса в образце при нормальном падении (см. правый угол падения по отношению к поверхности образца на рисунке 1).
4. Позиция средней инфракрасной оси пучка 5-8 мм перед отверстием выборки конус масс-спектрометра.
5. Отрегулируйте положение фокусировки объектива и энергии импульса лазерного луча для достижения ткани удаления в фокальной точке. Размеры удаленной определить объем пикселей (или воксела в трехмерной визуализации) размер изображения приложения.
6. Позиция nanospray излучателя в соответствии с входной оси масс-спектрометра и в отверстие-эмиттер наконечник расстоянии ~ 10 мм (см. рисунок 1).
7. Для электрораспылением, готовят 50% раствор метанола с 0,1% раствором уксусной кислоты или 0,1% добавки ацетата аммония для положительного или отрицательного иона режиме, соответственно. В зависимости от образца, другие органические растворители, такие как ацетонитрил, изопропанол и т.д., может заменить метанол в концентрации подходит для аналитических задач. Стабильность электрораспылением имеет решающее значение для успешной визуализации. В зависимости от растворителя отбора, скорости потока и распыления напряжения должны быть скорректированы для достижения стабильного распыления.
8. Для реактивной LAESI ⁶ в визуализации приложений, electrosprayed раствор может содержать реагенты.
9. Используйте шприцевой насос для доставки электрораспылением раствора через электрораспылением излучателя со скоростью потока ~ 300 Нл / мин.
10. Если отверстие масс-спектрометр сохраняется на низком напряжении (<500 В сопоставлении с землей), создавать электрораспылением путем применения высокого напряжения непосредственно к электрораспылением излучателем (например, 3000 В) или через металлическое соединение. В противном случае, земля непосредственно излучатель электрораспылением или через металлическое соединение установить электрораспылением.
11. Эксплуатация электрораспылением источник в конической струи распыления режим для наиболее эффективной генерации ионов по LAESI. Для эффекта операционных переменных на распыление режимов и их влияния на масс-спектры, см. обсуждение в другом месте. ^5,7,8
12. Тщательно регулировать относительные расстояния установки LAESI для оптимизации выхода LAESI ион, сохраняя при этом лазерный луч, эмиттера, а отверстие осей в одной плоскости. Вы найдете подробные инструкции в другом месте ^5.
13. С помощью оптического микроскопа, определить поперечные размеры абляции кратер на образце.
14. Для трехмерных экспериментов LAESI изображений, выполнять абляции с отдельными импульсами и определить глубину воксела, используя, например, Z-Stack режиме в оптической микроскопии. ³

3. Молекулярной визуализации и анализа данных

В визуализации эксперимент, образец ткани перемещается в фокальной плоскости лазера в X и Y направлениях с шагом раза больше или равна размерам абляции месте. Пространственное разрешение ограничено фокусировки лазерного луча инцидента.

1. Выберите область интересов на поверхности образца и получить (X, Y) координаты соответствующих границ.
2. Выбрал гриддинга алгоритма (например, адаптивные сетки, выбранной области изображения, прямоугольной сетки, спирали, Z сканирование и т.д.), с которым в растровые поверхности образца с выбранными время задержки для каждого пикселя по области для включения в образ.
3. Используйте трехосный стадии перевода и программное обеспечение, которое способно rastering образца в соответствии с заданной сетке.
4. Рассчитать общее время, необходимое для работы с изображениями.
5. Отключить время сбора данных предел масс-спектрометра. Если это невозможно, установить время сбора данных ограничений на расчетное значение времени визуализации.
6. Начало средней инфракрасной области лазерного источника с частотой повторения надлежащего производить достаточное отношение сигнал-шум в масс-спектре в течение времени пребывания в каждом пикселе для выполнения LAESI боковой эксперимент изображений. Для 3D молекулярной визуализации, используйте скорость спектр приобретения выше, чем повторение лазерного источника ставка успешно массовый анализ ионов, генерируемых в рамках одного лазерного импульса. Дождитесь сигнала START для начала абляции последовательности.
7. Включите электрораспылением источник. Убедитесь в том, что есть достаточно решения для полного времени, необходимого для работы с изображениями.
8. Одновременно СНВ приобретения масс-спектров, среднего ИК лазерной абляции, а также сканирования поверхности.
9. При визуализации запустить закончил, STOP сканирования поверхности, среднего ИК генерации и сбора данных.
10. Отключить лазерного источника.
11. Выключите высокого напряжения.
12. Выключите шприцевой насос.
13. Установить масс-спектрометр в режим ожидания.
14. Выключите Пельтье охлаждения электроники.
15. Закрыть потоке инертного газа, если используется.
16. Использование программного обеспечения для корреляции абсолютных координат пикселей изображения в боковых или вокселей в 3D-анализа с соответствующими спектрами.
17. Участок ионный сигнал интенсивности выбранной м / з стоимости по отношению абсолютных координатах анализа для получения боковых и 3D молекулярного изображения.

4. Представитель Результаты

Рисунок 2 дает репрезентативные результаты для некоторых основных типов тканей и обработки изображений модальностей. Группа изображает дело на раздел животные ткани, которая была заморожена в ходе эксперимента, чтобы предотвратить обезвоживание. ¹ Кроме того, образец был расположен в сухой среде газообразного азота, чтобы избежать окружающей паров воды из конденсата на поверхности образца. 100-мкм толщиной корональной части мозга крысы (Rattus погуе) был сбоку, полученную с использованием LAESI. Анатомических областей мозга (см. оптического изображения в панели) показывают хорошую корреляцию с молекулярного изображения, полученные для ПК plasmalogens (O-33: 3) и / или PE (O-36: 3) с т / г 728,559.

Группа B показывает 3D изображения LAESI завода Zebra (Aphelandra squarrosa) тканей листа. Потому что листья обладают естественным механизмом защиты от обезвоживания, образец может быть допрошен в окружающей среде. ³ получены 3D молекулярного изображения показали различные схемы распределения для первичных и вторичных метаболитов. Среди прочего, acacetin с т / г 285,076 была обнаружена при более высоких ионных отсчетов в желтых секторах второго и третьего слоев сверху с равномерным распределением в других. Это распределение согласились со схемой пестрота видел в оптическое изображение.

Рисунок 1. Схема системы LAESI (ES, электрораспылением эмиттера, или, отверстие массового конус выборки спектрометра; FL, фокусирующей линзы; FP, координационный центр, Р, Пельтье стадии охлаждения; HS, радиатор). Часть твердых частиц изгнаны во время среднего ИК абляции (красные точки), сливается с электрораспылением для получения заряженных капель посеян с молекулами и ионами образца (зеленые точки). Ионы освобожден от этих капель, анализируются и регистрируются масс-спектрометра.

Рисунок 2. Представитель результаты для боковых и 3D воображение. нг с LAESI масс-спектрометрии () верхняя панель изображает оптическое изображение мозга крысы (Rattus погуе) корональных раздел и молекулярные изображения, полученные для ПК plasmalogens (O-33: 3) и / или PE (O-36 : 3) с т / г 728,559. Белая полоса шкале соответствует 1 мм. Адаптировано с разрешения (Приложение ^1). Copyright 2010 Американского химического общества. (B) Нижняя панель показывает 3D изображение листа с пестрыми Zebra завод (Aphelandra squarrosa). Acacetin с т / г 285,076 была обнаружена при более высокой ионной отсчетов в желтых секторах второго и третьего слоев сверху с равномерным распределением в других. Переизданный с разрешением от (ссылка ^3). Copyright 2009 Американского химического общества.

Обсуждение

Различные типы тканей выставку различным содержанием воды и прочность на разрыв, который, в свою очередь, может повлиять на абляции характеристики образцов. ⁹ Чтобы смягчить эти последствия, желательно, чтобы лазерной энергии, обработки проб и анализа протоколов быть пересмотрен при переходе между основные виды тканей.

Для одной ячейки или выше исследования резолюцию, в середине инфракрасного света могут быть соединены в заостренными оптическое волокно вместо фокусирующей линзы. ¹⁰ Позиционируя торца волокна в непосредственной близости от выделенных ячеек в ткани, LAESI анализ может быть проведен на одноклеточного уровня.

Как без наклеек источника ионов для масс-спектрометрии окружающей ионизации, ¹¹ LAESI показал большой потенциал для исследования биохимических процессов в тканях. С дополнительными преимуществами прямого анализа, боковые и 3D-визуализации, LAESI является новым биоаналитических инструмент для профилирования, а также визуализации приложений.

Материалы

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mass spectrometer		Waters Co. (Milford, MA)	Q-TOF Premier
Mid-IR laser		Opotek Inc. (Carlsbad, CA)	Vibrant IR