常压LAESI质谱生物组织和生物膜的分子成像

摘要

激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）大气压离子源质谱。在成像模式下，中红外激光探测跨组织切片或生物膜的分子分布。这种技术提供了一个原生的实验条件下进行的各种生物分析研究的新方法。

摘要

环境电离质谱方法允许直接组织或母语一样的实验条件下的生物膜进行分析调查。激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）就是这样的发展，特别是水含标本调查非常适合。 LAESI采用了中红外激光束（波长为2.94微米），以激发样品中的水分子。的消融能量密度超过临界值时，样品材料中的颗粒物的形式被驱逐，这些弹丸旅行到几十毫米以上的样品表面。 LAESI，这消融羽被拦截高度带电液滴捕捉到弹出的样品材料的一小部分，并将其转换成气相离子化学成分。一个大气压离子源接口配备一个质谱仪分析和记录离子的释放，来自探测样品的面积（像素）组成。超过一个像素阵列系统的审讯打开分子成像探针分析模式的一种方式。 LAESI质谱成像的一个独特之处在于深入剖析，在与横向成像相结合，使三维（3D）分子成像。 〜100微米〜40微米，分别与当前的横向和深度决议，LAESI质谱成像有助于探索生物组织的分子结构。在这里，我们审查了LAESI系统的主要元素，并提供一个成功的成像实验的指导方针。

研究方案

以下协议描述激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）实验的主要步骤，并提供了横向和三维（3D）成像的动物和植物组织样本有代表性的例子。附加的实验和技术细节，可以从其他地方获得^。 1-6

1。组织准备和安装

1. 如果需要切片，使用第一个cryomicrotome组织为10-100微米厚的切片在-10 -20 ° C，除非另有一个特定的组织类型的建议。
2. 装载到一个平坦的表面化学改性剂的情况下直接（例如，化学预清洁玻片上）的部分。切片组织，解冻的部分安装和安全的样品架，立即到佩尔蒂埃冷却阶段后解冻安装保留在任何时候都冻结在分析过程中的组织。这一步是需要尽量减少/防止分子中的部分迁移。
3. 如果需要，使用散热器配备了一个低功率的风扇，以方便散热佩尔蒂埃阶段保持组织冷冻。
4. 在潮湿的环境下超过延长期的时间（1-2小时），检查组织表面上凝结的水或冰。组织上的冷凝水产生不利影响LAESI实验成像性能。
5. 如果需要，使用一个房间除湿机或冷却样品放置在充满惰性气体（例如，干燥的氮气），以防止结露的环境室¹ 。

2。 LAESI离子源的优化

LAESI离子源包括一个中红外激光，一系列光学元件光转向和重点，以及额外的样品架，散热元件，翻译阶段和溶剂输送系统。图1展示了这些元素的典型安排大气压离子源的质谱仪入口。

1. 所示在图1位置质谱仪采样锥（D _{或- FP）}口下面的示例15-20毫米。
2. 操作在中红外激光波长2​​.94微米和10 Hz重复率。衰减〜100μJ/脉冲能量的激光输出。
3. 使用透明的激光波长（例如，一个平凸_氟化钙或硒化锌透镜）金镜和聚焦透镜组合进样在正常发病率的激光脉冲能量（见右入射角与样品表面的情侣在图1）。
4. 质谱仪采样锥孔前中期红外光束轴5-8毫米的位置。
5. 调整对焦镜头位置和脉冲能量的激光束实现焦斑组织切除。消融量的尺寸决定了成像应用的像素（或三维成像体素）的大小。
6. 在质谱仪的入口轴和纳流喷雾发射器的距离（见图1）〜10毫米的孔到发射极的尖端位置。
7. 电，准备用50％甲醇溶液，分别用0.1％醋酸或0.1％醋酸铵积极或消极的离子模式添加剂。根据样品，等有机溶剂，如乙腈，异丙醇等，可能会取代在适当浓度的分析任务甲醇。电稳定是成功的成像的关键。根据溶剂的选择，流量和喷涂电压需要进行调整，以实现稳定的喷涂。
8. 成像应用，无功LAESI ⁶ electrosprayed解决方案可能包含反应物。
9. 使用注射泵通过电发射器提供一个〜300 NL / min的流速电的解决方案。
10. 如果质谱仪口保持在低电压（<500 V的对地测量），通过施加高电压电发射器（例如，3000伏）直接或通过一个金属工会产生电。否则，地面直接电发射器或通过金属工会建立电。
11. LAESI喷洒最有效的离子生成模式操作锥形喷射电源。对于操作变量喷洒模式和质谱其效果的影响，其他地方看到^讨论 。5,7,8
12. 仔细的LAESI设置调整优化，同时保持在同一平面上的激光束，发射器，和孔轴LAESI离子产量的相对距离。请其他地方找到详细说明。
13. 用光学显微镜，确定消融火山口的横向尺寸的样品。
14. 立体LAESI成像实验，执行与个别脉冲的消融，并确定使用体素的深度，例如，在光学显微镜的Z - Stack的模式。

3。分子成像和数据分析

在成像实验，移动组织样本中的一步尺寸大于或等于消融点的尺寸的X和Y方向的激光焦平面。空间分辨率是有限的，由入射激光束聚焦。

1. 选择在样品表面的兴趣领域，并取得相应的边界坐标（X，Y，）。
2. 选择一个网格算法（例如，自适应网格，选定区域成像，矩形网格，螺旋纹，Z轴扫描等）与光栅样品表面与选择住在每个像素在成像领域的时间。
3. 使用三轴​​的翻译阶段，软件，光栅样品，按照预定的电网。
4. 计算成像所需的总时间。
5. 禁用质谱仪数据采集的时间限制。如果这是不可能的，集数据采集，计算成像时间值的时间限制。
6. 开始在一个适当的重复率的中红外激光源产生足够的信号噪声比质谱，在每个像素内的停留时间，执行LAESI横向成像实验。三维分子成像技术，使用一个比激光源的重复率，成功地大规模分析在一个单一的激光脉冲产生的离子光谱采集率更高。等待START信号启动消融序列。
7. 开启的电源。确保有足够的解决方案是成像所需的全部时间。
8. 同时启动收购质谱，中红外激光烧蚀，表面扫描。
9. 当成像运行完成后，停止表面扫描，中红外激光，和数据采集。
10. 禁用激光源。
11. 关闭高电压。
12. 关闭注射泵。
13. 质谱仪设置到待机模式。
14. 关闭帕尔帖冷却电子。
15. 关闭如果使用惰性气体的气流。
16. 使用软件关联在外侧成像或体素的像素的三维分析中的绝对坐标与相应的光谱。
17. 为选定的m / z对获得横向和三维的分子图像分析的绝对坐标值绘制的离子强度信号。

4。代表性的成果

图2给出了一些主要的组织类型和成像代表性的结果。 A组描绘了一个已冻结在实验过程中，以防止脱水的动物组织切片的情况下^，1此外，设在干燥的氮气环境样品，以避免周围的水蒸汽凝结在样品表面。一个100微米厚的大鼠脑冠状断面（ 褐家鼠 ）横向成像LAESI。光学图像的大脑解剖区域（见面板）显示的plasmalogens PC获得的分子图像（O - 33:3）良好的相关性和/或PE（O - 36:3）m / z为 728.559。

B组LAESI斑马的植物（Aphelandra子草 ）叶组织的三维成像。由于叶片具有自然防御机制防止脱水，样品可以在周围环境中^的审问，3所获得的分子三维图像揭示了各种初级和次生代谢产物的分布格局。其中，金合欢素的m / z 285.076是从均匀分布在其他顶部的第二和第三层的黄色行业更高的离子计数检测。同意这种分配格局与光学图像中看到的花斑。

图1。 LAESI系统原理图（ES，电发射端，或质谱仪采样锥孔;佛罗里达州，聚焦镜头;计划生育，联络点，P，Peltier冷却阶段;房协，散热器） 。一个颗粒物的一部分，在中红外消融（红点）的电产生带电液滴与样品的分子和离子（绿色圆点）种子coalesces开除。从这些水滴释放的离子质谱仪分析和记录。

图2。横向和3D意马代表结果与吴LAESI质量法（ 一 ）顶部面板描绘老鼠大脑（ 褐家鼠 ）冠状切面的分子图像，为plasmalogens PC获得光学图像（O - 33:3）和/或PE（O - 36 :3）m / z为 728.559。白色比例尺对应到1毫米。适应许可（参考文献^1）。 2010年美国化学学会版权所有。 （二）底部面板上显示了一个从杂色斑马植物的叶（Aphelandra子草）的三维成像。 m / z为 285.076，刺槐素是从均匀分布在其他顶部的第二和第三层的黄色行业更高的离子计数检测。重印许可（参考文献^3）。版权所有2009美国化学学会。

讨论

不同组织类型表现出不同的水含量和拉伸强度，这反过来，可能会影响样本的消融特点^。9，以减轻这些影响，它是理想的激光能量，样品处理和分析的协议进行修订更改时主要的组织类型。

对于单细胞或更高的分辨率的调查，中红外光可耦合成一个削尖的，而不是一个聚焦透镜的光纤定位接近选定的单元格在一个组织内^的纤维尖端10，LAESI分析，可以对一种单细胞的水平。

作为一个无标签环境电离质谱的离子源^，11 LAESI组织中的生化过程的调查显示巨大潜力。 LAESI直接分析，横向和三维成像的增值收益，是一个新兴的生物分析工具，分析以及成像应用。

材料

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mass spectrometer		Waters Co. (Milford, MA)	Q-TOF Premier
Mid-IR laser		Opotek Inc. (Carlsbad, CA)	Vibrant IR