Presión atmosférica de Imagen Molecular de los tejidos biológicos y biopelículas por LAESI Espectrometría de Masas

Resumen

La ablación con láser de ionización electrospray (LAESI) es una fuente de iones a presión atmosférica para la espectrometría de masas. En el modo de imagen, una sonda láser en el infrarrojo medio de la distribución de moléculas a través de una sección de tejido o biofilm uno. Esta técnica presenta un nuevo enfoque para los diversos estudios bioanalíticos realizado bajo condiciones experimentales nativos.

Resumen

Métodos de ionización del ambiente en la espectrometría de masas permiten a las investigaciones de análisis que se realiza directamente en un tejido o biofilm bajo nativos-como condiciones experimentales. La ablación con láser de ionización electrospray (LAESI) es un desarrollo, y es especialmente adecuado para la investigación de las muestras que contienen agua. LAESI utiliza un rayo láser en el infrarrojo medio (2,94 m de longitud de onda) para excitar las moléculas de agua de la muestra. Cuando el umbral de fluencia de la ablación es excedido, el material de la muestra es expulsado en forma de partículas y los proyectiles de viajar a decenas de milímetros por encima de la superficie de la muestra. En LAESI, esta pluma de ablación es interceptada por las gotas de gran carga para capturar una fracción de la muestra de material expulsado y convertir sus componentes químicos en iones en fase gaseosa. Un espectrómetro de masas equipados con una interfaz de iones de presión atmosférica de origen se emplea para analizar y registrar la composición de los iones liberados procedentes de la zona sondeado (píxel) de la muestra. Un interrogatorio sistemático a través de una matriz de píxeles abre un camino para la imagen molecular en el modo de análisis de microsonda. Un aspecto único de la imagen de masas LAESI espectrométrica perfiles de profundidad que, en combinación con la imagen lateral, permite en tres dimensiones (3D) de imágenes moleculares. Con las actuales resoluciones de la lateral y la profundidad de ~ 100 ~ micras y 40 micras, respectivamente, imágenes LAESI de espectrometría de masas ayuda a explorar la estructura molecular de los tejidos biológicos. En este documento, se revisan los principales elementos de un sistema de LAESI y proporcionar directrices para un experimento de imágenes exitosa.

Protocolo

El siguiente protocolo describe los pasos principales de la ionización electrospray láser de ablación (LAESI) experimento y proporciona ejemplos representativos de lateral y en tres dimensiones (3D) de imágenes de animales y muestras de tejidos vegetales. Otros detalles experimentales y técnicas se pueden obtener de otros lugares. ^6.1

1. Preparación y montaje del tejido

1. Si el corte es necesario, utilice un criomicrotomo a la sección de tejido en rodajas gruesas 10-100 micras de -10 a -20 ° C a menos que se recomienda para un tipo de tejido en particular.
2. Monte secciones sobre una superficie plana (por ejemplo, químico previo limpiar portaobjetos de vidrio) directamente sin modificadores químicos. Para cortes de tejidos, deshielo de montaje en los sectores y asegurar el soporte de la muestra a una etapa de enfriamiento Peltier-inmediatamente después de la descongelación de montaje para mantener el tejido congelado en todo momento durante el análisis. Este paso es necesario para minimizar / evitar la migración molecular en la sección.
3. Si es necesario, utilice un disipador de calor equipadas con un ventilador de baja potencia-para facilitar la extracción de calor de la etapa de Peltier para mantener el tejido congelado.
4. En un ambiente húmedo durante un período prolongado de tiempo (1-2 horas), para inspeccionar la condensación de agua o hielo en la superficie del tejido. Condensación de agua en el tejido negativamente afecta al rendimiento de imagen en los experimentos LAESI ^1.
5. Si es necesario, utilice un deshumidificador habitación o lugar de la muestra enfriada en una cámara llena de un gas inerte (por ejemplo, gas, nitrógeno seco) para evitar la condensación. ¹

2. Optimización de la fuente de iones LAESI

La fuente de iones LAESI consta de un láser en el infrarrojo medio, una serie de elementos ópticos para dirigir la luz y el enfoque, así como los titulares adicionales de la muestra, los componentes de enfriamiento, las etapas de traducción, y un sistema de distribución del disolvente. La Figura 1 muestra la disposición típica de estos elementos con respecto a la entrada de la fuente de iones de presión atmosférica de un espectrómetro de masas.

1. Como se ilustra en la Figura 1, la posición de la muestra de 15 a 20 mm por debajo del orificio del cono de masa de muestreo espectrómetro (d _{O FP-).}
2. Operar un láser infrarrojo medio en longitud de onda de 2.94 micras y 10 Hz frecuencia de repetición. Atenuar la salida del láser de ~ 100 μJ / pulso de energía.
3. Use una combinación de espejos de oro y una lente de enfoque transparente a la longitud de onda de láser (por ejemplo, una cafetería plano-convexo ₂ o lentes de ZnSe) para acoplar la energía del pulso láser en la muestra en incidencia normal (ver el ángulo de incidencia con respecto al derecho de superficie de la muestra en la Figura 1).
4. La posición del infrarrojo medio eje del haz 8.5 mm por delante del orificio del cono de masa de muestreo del espectrómetro.
5. Ajustar la posición de la lente de enfoque y la energía del pulso del haz de láser para lograr la eliminación de tejido en el punto focal. Las dimensiones del volumen de ablación determinar el píxel (o voxel en imágenes tridimensionales) de tamaño de la aplicación de imágenes.
6. La posición de un emisor nanospray en línea con el eje de entrada del espectrómetro de masas y en una distancia boquilla con orificio-emisor de ~ 10 mm (ver Figura 1).
7. Para el electrospray, prepare solución al 50% de metanol con 0,1% de ácido acético o el 0,1% de aditivo de acetato de amonio para el modo de iones positivos o negativos, respectivamente. Dependiendo de la muestra, otros disolventes orgánicos, tales como acetonitrilo, isopropanol, etc, pueden sustituir el metanol en concentraciones apropiadas para la tarea analítica. La estabilidad de la electrospray es crucial para el éxito de imagen. Dependiendo de la selección del disolvente, el caudal y la tensión de fumigación deben ser ajustados para lograr spray estable.
8. De reactivos LAESI ⁶ en aplicaciones de imagen, la solución electrosprayed puede contener reactivos.
9. Use una bomba de una jeringa para aplicar la solución de electrospray a través del emisor de electrospray con un caudal de alrededor de 300 nL / min.
10. Si el orificio espectrómetro de masas se mantiene a baja tensión (<500 V medido contra el suelo), generar electrospray mediante la aplicación de alta tensión directamente al emisor electrospray (por ejemplo, 3000 V) oa través de una unión de metal. De lo contrario, baja directamente del emisor electrospray o mediante la unión de metal para establecer electrospray.
11. Operar la fuente de electrospray en el cono de chorro de pulverización para la generación de iones de modo más eficiente por LAESI. Para el efecto de las variables que operan en los modos de fumigación y su efecto en los espectros de masas, ver las discusiones en otros lugares. ^5,7,8
12. Ajuste cuidadosamente las distancias relativas de la configuración LAESI para optimizar el rendimiento de iones LAESI mientras se mantiene el rayo láser, el emisor, y los ejes de orificios en el mismo plano. Por favor, encontrará las instrucciones detalladas en otros lugares. ⁵
13. Con un microscopio óptico, determinar las dimensiones laterales del cráter de ablación en la muestra.
14. Durante tres dimensiones los experimentos de imagen LAESI, realizar la ablación con pulsos individuales y determinar la profundidad de un voxel utilizando, por ejemplo, el modo de z-stack en microscopía óptica. ³

3. Imagen Molecular y Análisis de Datos

En el experimento de imágenes, la muestra de tejido se mueve en el plano focal del láser en las direcciones X e Y, con tamaños de paso mayor o igual a las dimensiones de la mancha de ablación. La resolución espacial es limitada por el enfoque del rayo láser incidente.

1. Seleccione el área de interés en la superficie de la muestra y obtener el (X, Y) las coordenadas de los límites correspondientes.
2. Elija un algoritmo de grillado (por ejemplo, la red de adaptación, las imágenes seleccionadas región, rejilla rectangular, espiral, Z escaneo, etc) con el que trama la superficie de la muestra con una selección de tiempo de permanencia en cada píxel en el área a explorar.
3. Utilice una etapa de traducción de tres ejes y un software que es capaz de barrido de la muestra de acuerdo a la red predeterminado.
4. Calcular el tiempo total requerido para obtener imágenes.
5. Desactivar la adquisición de datos de plazo del espectrómetro de masas. Si esto no es posible, establecer el límite de tiempo de adquisición de datos para el valor de imágenes en tiempo calculado.
6. Iniciar la fuente de láser en el infrarrojo medio a una tasa de repetición adecuada para producir suficiente relación señal-ruido en el espectro de masas en el tiempo de permanencia en cada píxel para llevar a cabo un experimento LAESI imagen lateral. De imagen molecular en 3D, utilice una velocidad de adquisición de espectro más alta que la tasa de repetición fuente láser de éxito masivo analizar los iones generados en un pulso de láser. Espere a que la señal de arranque para iniciar la secuencia de la ablación.
7. Encienda la fuente de electrospray. Asegúrese de que no es solución suficiente para el tiempo total requerido para obtener imágenes.
8. Al mismo tiempo iniciar la adquisición de espectros de masa, la ablación por láser infrarrojo medio, y la exploración de la superficie.
9. Cuando la carrera de imagen ha terminado, ¡ALTO a la exploración de la superficie, el láser infrarrojo medio, y la adquisición de datos.
10. Desactivar la fuente de láser.
11. Apague el alto voltaje.
12. Apague la bomba de jeringa.
13. Ajuste el espectrómetro de masas para el modo STANDBY.
14. Apague el sistema electrónico de refrigeración Peltier.
15. Cerrar el flujo de gas inerte, si se utiliza.
16. Utilice un software para correlacionar las coordenadas absolutas de los píxeles en las imágenes laterales o en el análisis de los voxels en 3D con los espectros correspondientes.
17. Trace la intensidad de la señal de iones seleccionados para un m / z valor frente a las coordenadas absolutas de análisis para la obtención de imágenes moleculares lateral y 3D.

4. Resultados representante

La figura 2 muestra resultados representativos para algunos tipos de tejidos principales y las modalidades de imagen. El panel A muestra un caso de una sección de tejido animal que ha sido congelado durante el experimento, para evitar la deshidratación. ¹ Además, la muestra se encuentra en un entorno de gas nitrógeno seco para evitar los vapores de agua ambiental se condense en la superficie de la muestra. Una sección de la corona de 100 micras de espesor de un cerebro de rata (Rattus norvegicus) fue fotografiada lateralmente con LAESI. Las regiones anatómicas del cerebro (véase la imagen óptica en el panel A) muestra una buena correlación con la imagen molecular obtenido para la PC plasmalógenos (O-33: 3) y / o PE (O-36: 3) con m / z 728,559.

El panel B muestra la imagen en 3D LAESI de una planta de Zebra (Aphelandra squarrosa) tejido de la hoja. Debido a que las hojas poseen un mecanismo de defensa natural contra la deshidratación, la muestra podría ser interrogado en el medio ambiente. ³ El obtuvieron imágenes en 3D molecular reveló una variedad de patrones de distribución de metabolitos primarios y secundarios. Entre otros, acacetin con m / z 285,076 se detectó a cuenta de iones mayores en los sectores de color amarillo de la segunda y tercera capa de la parte superior con una distribución homogénea en los demás. Esta distribución de acuerdo con el patrón de la variegación se ve en la imagen óptica.

Figura 1. Esquema del sistema LAESI (ES, punta de electrospray emisor, o bien que los orificios de la masa del cono de muestreo espectrómetro, FL, lentes de enfoque, FP, punto focal, P, Peltier etapa de enfriamiento, SA, el disipador de calor). Una porción de las partículas expulsadas durante la mitad de la ablación IR (puntos rojos) se funde con el electrospray para producir gotitas cargadas sembrados con moléculas e iones de la muestra (puntos verdes). Los iones liberados de estas gotas son analizados y registrados por el espectrómetro de masas.

Figura 2. Los resultados representativos para el lateral y la imaginación en 3D. ng LAESI con espectrometría de masa (A) El panel superior muestra la óptica de la imagen de un cerebro de rata (Rattus norvegicus) sección coronal y la imagen molecular obtenido para la PC plasmalógenos (O-33: 3) y / o PE (O-36 : 3) con m / z 728,559. La barra de escala blanco corresponde a 1 mm. Adaptado con permiso de (Referencia ^1). Copyright 2010 American Chemical Society. (B) La imagen inferior muestra las imágenes en 3D de una hoja de una planta abigarrada Zebra (Aphelandra squarrosa). Acacetin con m / z 285,076 se detectó a cuenta de iones de alta en el sector amarillo de la segunda y tercera capa de la parte superior con una distribución homogénea en los demás. Reproducido con permiso del (Referencia ^3). Copyright 2009 Sociedad Americana de Química.

Discusión

Diferentes tipos de tejidos presentan un contenido variable de agua y resistencia a la tracción, lo que, a su vez, puede afectar las características de ablación de las muestras. ⁹ Para mitigar estos efectos, se desea que los protocolos de la fluencia del láser, el manejo de muestras y análisis se revisará cuando se cambia entre principales tipos de tejidos.

De celda o de mayor resolución de las investigaciones, a la luz del infrarrojo medio puede ser acoplado a una fibra óptica afilada en lugar de una lente de enfoque. ¹⁰ Mediante la colocación de la punta de la fibra en las proximidades de las celdas seleccionadas en un tejido, el análisis LAESI se puede realizar en un nivel de una sola célula.

Como una etiqueta sin fuente de iones para la espectrometría de masas de ionización del ambiente, ¹¹ LAESI ha mostrado un gran potencial para la investigación de los procesos bioquímicos en los tejidos. Con los beneficios añadidos de un análisis directo, las imágenes laterales y 3D, LAESI es un nuevo instrumento para la creación de perfiles de bioanálisis, así como aplicaciones de imágenes.

Materiales

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Mass spectrometer		Waters Co. (Milford, MA)	Q-TOF Premier
Mid-IR laser		Opotek Inc. (Carlsbad, CA)	Vibrant IR