A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
ويمكن تقييم الاتجار الجزيئات بين الخلايا النباتية بالإعراب عابر بروتين fluorescently الموسومة المصالح وتحليل توزيعه داخل وبين الخلايا بواسطة المجهر مبائر.
هنا ، نطرح على بروتوكول بسيط وسريع لكشف وتقييم مدى الخلية الى خلية النقل الجزيئات في بلانتا. في هذا البروتوكول ، وأعرب عن عابر a fluorescently الموسومة البروتين من الاهتمام في الأنسجة النباتية بعد الولادة biolistic من الحمض النووي لبناء الترميز. ثم يتم تحليل التوزيع داخل وبين الخلايا من البروتين الموسومة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. وصفنا هذه التكنولوجيا بالتفصيل ، وتوفير خطوة بخطوة لبروتوكولات الفحص وتقييم مدى النقل بروتين متحد الجبلة في الأنواع النباتية ثلاثة thaliana Arabidopsis ، ونيكوتيانا benthamiana N. تبغ (التبغ).
خلفية
متحد الجبلة النقل الجزيئات من خلال الاتصالات بين الخلايا النباتية ، ورابطات هيولية ، هو موضع اهتمام العديد من الأطباء وعلماء الأحياء النباتية. على سبيل المثال ، لا يعرف العديد من البروتينات الفيروسية لتنظيم plasmodesmal حدود حجم الاستبعاد لتمكين الحركة الفيروسية 1-3. كذلك ، يفترض بعض البروتينات المحلية ، ومن بينها منظمات تنموية هامة ، للانتقال من خلية إلى أخرى ، ويفترض من خلال رابطات هيولية ، إلى وظيفة غير خلية مستقلة 4. وهكذا ، منهجية يمكن الاعتماد عليها لتحديد ووضع تصور لنقل الجزيئات بين الخلايا النباتية بكثير في الطلب.
1) زراعة النباتات المستهدفة
لكفاءة عالية التحول ، يجب استخدام صحي ، ومحطات قوية.
النباتات Arabidopsis 1.
تنمو في مصنع واحد Arabidopsis الموالية للBX ميكس في وعاء (10 سم x 10 سم x 10 سم) في غرفة البيئة التي تسيطر عليها مع الإضاءة قصيرة (8 ساعات من ضوء 130-150 م -2 -1 μE s في 23 ° C/16 ساعة مظلمة عند 20 درجة مئوية) والرطوبة النسبية 40-65 ٪ لمدة 6 إلى 8 أسابيع 5. تسميد منهم أحيانا مع المنتجات المتاحة تجاريا كما هو موضح 5. ويتم اختيار الأوراق مع حجم أكبر من 15 ملم × 35 ملم (قياس طول يشمل سويقات) للتجارب.
2. ن. benthamiana ونون تبغ
تنمو في مصنع واحد الموالية للBX ميكس في وعاء (20 سم x 20 سم x 20 سم) في غرفة البيئة التي تسيطر عليها مع الإضاءة الطويلة (16 ساعة من 130-150 متر μE -2 -1 ضوء s في 23 درجة مئوية 8 / ساعة مظلمة عند 20 درجة مئوية) والرطوبة النسبية 40-65 ٪ لمدة 7 إلى 10 أسابيع. تسميد منهم أحيانا مع المنتجات المتاحة تجاريا باسم وصفها. يترك مع حجم أكبر من 50 ملم 70 ملم x لN. benthamiana أو 100 ملم x 125 ملم لN. تبغ (هذه القياسات لا تشمل طول سويقات) هي المحدد للتجارب.
2) إعداد جين خرطوشة بندقية مع الحمض النووي الذهب المطلي المجهرية الدقيقة
وقد وصفت في بروتوكول لهذه الخطوة التجريبية بالتفصيل سابقا 6. من المهم جدا لاستخدام الحمض النووي البلازميد المنقى جيدا في تركيزات عالية (~ 1 ميكروغرام / ميكرولتر) للحصول على أعلى كفاءة التحويل لسهولة التحليل المجهري مبائر خلال مراحل لاحقة من التجربة.
لهذا الاختبار ، فمن المهم التأكد من أن لا أعد خرطوشة تحويل اثنين أو أكثر من الخلايا المجاورة في نفس الوقت في التردد العالي ، لأنه يتم استخدام عدد من الخلايا ربط مع كتلة إشارة الفلورسنت كمؤشر لمدى النقل متحد الجبلة (أي ، خلية واحدة تحتوي على أي إشارة إلى حركة ، في حين أن كتلة حركة يشير إشارة multicell). يمكن التحقق من جودة كل خرطوشة من خلال تحليل التعبير عن بروتين 16-20 قصف آخر ساعة. بروتوكول لدينا 6 خراطيش تنتج مجموعات التعبير التي تدر multicell فقط في 3 ٪ <لجميع الأحداث التعبير في هذا الإطار الزمني ، وبالتالي مناسبة لهذه التجربة.
3) تسليم Biolistic من الحمض النووي المغلفة المجهرية الدقيقة
4) التصوير التعبير البروتين
إشارة من البروتينات الفلورية أعرب عابر المفتاحية هي التي تصور المجهري متحد البؤر. وينبغي الحرص على إيجاد أفضل الإعدادات المجهري للكشف عن البروتين في كل اختبار. على سبيل المثال ، والبروتينات داخل الخلايا التي تظهر تراكم محدودة مع شدة إشارة ضعيفة ، مثل توطين plasmodesmal من البروتين فسيفساء التبغ حركة فيروس (TMV MP) 1-3،6 يراعى تحت عدسة الهدف 40X ، مما يتيح دقة أعلى و الحساسية ، في حين يمكن أن البروتينات التي تظهر توزيع هيولي مع شدة إشارة قوية ، مثل YFP الحرة ، يمكن تصور تحت عدسة الهدف 10X مع وظيفة التكبير والتصغير مبائر لسرعة التصوير (انظر الشكل 1).
يستدل متحد الجبلة النقل من ظهور كتل multicell التي تحتوي على إشارة الفلورسنت. عدد الكتل وعدد من مثل هذه الخلايا في كل مجموعة مما يدل على مدى الخلية الى خلية النقل. للحصول على بيانات موثوق بها ، يجب أن تسجل مجموعات التعبير لا يقل عن 100 في كل نظام التجريبية. على سبيل المثال ، يجب أن تسجل إذا قورن حركة الخلية الى خلية من البروتين في الخلفيات two الجينية المختلفة (على سبيل المثال ، اكتب البرية والنباتات المعدلة وراثيا) ، من مجموع كتل التعبير 200. الأهم ، والتجارب ، ينبغي القيام نتائج التي يمكن مقارنتها مع بعضها البعض ، في وقت واحد.
5. ممثل النتائج
الشكل أدناه يوضح التجارب ممثل للكشف عن النقل متحد الجبلة من البروتينات الموسومة fluorescently. لوحات ألف وباء عرض الصور النمطية التي يتم الحصول عليها مبائر microbombardment التالية من N. benthamiana نبات مع TMV MP - YFP - معربا عن بناء. في لوحة ويلاحظ وجود الحركة ، ومتحد الجبلة من YFP النائب TMV استنادا إلى ظهور كتل multicell الإشارة YFP. ليس كل TMV أعرب عابر MP - YFP غير قادرة على التحرك كما يدل على ذلك إشارة وحيدة الخلية في بعض microbombardments (لوحة باء). إحصائيا ، في <40 ٪ من التجمعات اشارة عدها ، TMV MP - YFP غير قادر على التنقل بين الخلايا في حين أنه في> 60 ٪ للمجموعات ، وينتقل البروتين بين 2-5 خلايا ، مع انتشار الخلايا اثنين كونها الأكثر شيوعا (حوالي 50 ٪ من الحالات ~) (الشكل 1C).
يمكن للبروتينات مع حجم الجزيئات الصغيرة نسبيا دون حركة النشاط الفطري المنتشر من خلال التطوير المهني للانتقال من خلية إلى خلية. على سبيل المثال ، YFP مجانا أو 1xYFP (حوالي 27 كيلو دالتون ، لوحة D) ، وينتشر بين عدة خلايا في 30 ٪ من المجموعات تحسب (لوحات C). هذا الانتشار غير محددة لا يحدث عن باهتة YFP متعدية ، أو 2xYFP (54 كيلو دالتون ، E لوحة) ، والذي يماثل في الحجم لبروتين TMV الانصهار MP - YFP (57 كيلو دالتون) ، والذي هو حكم ذاتي كامل الخلية (الشكل 1C).
الشكل 1. النتائج النموذجية التي تم الحصول عليها من مقايسة النقل متحد الجبلة في N. benthamiana أنسجة نبات. (A ، B) من التصور TMV MP - YFP. (C) الكميات من كتل الإشارة. و1xYFP 2xYFP ، حرر YFP ومتعدية YFP ديمر ، على التوالي. (د) من 1xYFP التصور. (E) من 2xYFP التصور. في micrographs ، لوحات اليسار تظهر إشارة YFP والحق لوحات تظهر الصور المدمجة من YFP (باللون الأخضر) ، وتألق ذاتي بلاستيدات الخضراء (بيضاء) الاشارات. الصور هي أقسام مبائر واحد. النجمية في micrographs تظهر خلايا البشرة تظهر YFP الإشارة. قضبان = 50 ميكرومتر.
المفتاح لنجاح تجربة النقل متحد الجبلة هو الحصول على كفاءة عالية التحول ، الذي يسمح للإنتاج مجموعات إشارة ذات دلالة إحصائية واكتشافها بسهولة. ويمكن تحقيق ذلك باستخدام أوراق تحصد من النباتات وصحية قوية ، وإعداد جزيئات الذهب المطلي بواسطة الحمض النووي إعداد نقية ومرك?...
ويدعم عملنا من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة / NIGMS ، جبهة الخلاص الوطني ، وزارة الزراعة / NIFA وBARD إلى VC.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Gold microparticles, 1.0 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2262 | |
Gold microparticles, 0.6 μm in diameter | Bio-Rad | 165-2263 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
Tefzel tubing | Bio-Rad | 165-2441 | |
Helios cartridge preparatory station | Bio-Rad | 165-2420 | |
Tubing cutter | Bio-Rad | 165-2422 | |
Helios gene gun | Bio-Rad | 165-2432 | |
Helium gas regulator | Bio-Rad | 165-2413 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved