-Cell Hücre makromoleküler Ulaştırma Testi Planta Biyolistik Bombardıman kullanımı

Özet

Bitki hücreleri arasındaki makromoleküler ticareti, geçici bir ilgi floresan etiketli protein ifade ve konfokal mikroskobu ile içi ve hücreler arası dağılımı analiz değerlendirilebilir.

Özet

Burada, planta içinde hücre-hücre makromoleküler taşıma kapsamını tespit etmek ve değerlendirmek için basit ve hızlı bir protokol mevcut. Bu protokol, geçici bir ilgi floresan etiketli protein kodlama DNA Biyolistik teslim inşa aşağıdaki bitki doku ifade edilir. Etiketli protein içi ve hücreler arası dağılımı sonra konfokal mikroskobu ile analiz edilir. Biz detaylı olarak tahlil için adım adım protokoller sağlayarak, bu teknoloji tanımlayan ve üç bitki türlerinin symplastic protein taşıma ölçüde, Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana ve N. değerlendirmek tabacum (tütün).

Protokol

Arkaplan

Bitki hücrelerarası bağlantıları aracılığıyla makromoleküllerin Symplastic ulaşım, plasmodesmata, birçok bitki patologlar ve biyologlar ilgi. Örneğin, bazı viral proteinler, viral ^hareketi 1-3 etkinleştirmek için plasmodesmal boyut dışlama sınırlarını düzenlemek için bilinmektedir . Ayrıca, önemli gelişim düzenleyiciler arasında bazı endojen proteinler, ^4-hücreli olmayan-özerk çalışması için, muhtemelen plasmodesmata aracılığıyla hücreden hücreye geçmek için varsayılır. Bu nedenle, bitki hücreleri arasındaki makromoleküler taşımacılığı tanımlamak ve görselleştirmek için güvenilir bir yöntem çok talep.

1) Hedef bitkiler büyümek

Dönüşüm verimliliği yüksek, sağlıklı, sağlam bitkiler kullanılmalıdır.

1. Arabidopsis bitkiler

Çevre kontrollü bir odasında kısa bir fotoperiyodun (130-150 μE m ^{-2 s} -1 ışık 8 saat 23 ° Grow bir tencerede Pro-Mix BX bir Arabidopsis bitkisi (10 cm x 10 cm x 10 cm ) C/16 saat karanlık 20 ° C) ve 6 ila 8 hafta ⁵ için% 40-65 bağıl nem. ⁵ açıklandığı gibi piyasada bulunan ürünleri ile zaman zaman onları Gübreleme . 15 mm x 35 mm (uzunluk ölçümü sapı dahil olmak üzere) daha büyük boyutu ile Yapraklar deneyler için seçilir.

2. N. benthamiana ve N. tabacum

Pro-Mix BX bir bitki yetiştirmek uzun bir fotoperiyodun (23 ° C'de 16 saat 130-150 μE m ^-2 s ^-1 ışık çevre kontrollü bir odasında bir pot (20 cm x 20 cm x 20 cm ) / 8 karanlık saat 20 ° C) ve 7 ila 10 hafta boyunca% 40-65 bağıl nem. Tarif olarak piyasada bulunan ürünleri ile zaman zaman onları gübreleyin. N. boyutu 50 mm daha büyük x 70 mm ile yaprak N. benthamiana, ya da 100 mm x 125 mm tabacum (bu uzunluk ölçümleri sapı dahil değildir) deneyler için seçilir.

2), DNA-kaplı Altın Gen Tabancası Kartuşu Hazırlık Mikroküreler

Bu deneysel bir adım için protokol daha ^önce 6 ayrıntılı olarak tarif edilmiştir . Yüksek konsantrasyonlarda (~ 1 mcg / ml) Deneyin sonraki aşamalarında konfokal mikroskopi analiz kolaylığı açısından en yüksek dönüşüm verimi elde etmek için iyi arıtılmış plazmid DNA kullanımı çok önemlidir.

Bu testte için, floresan sinyal kümesi ile ilişkilendirerek hücrelerinin sayıları symplastic taşıma ölçüde (yani bir göstergesi olarak kullanılması nedeniyle, hazırlanan kartuş, yüksek frekansta aynı anda iki veya daha fazla bitişik hücre dönüşümü yaptığı tespit etmek önemlidir. , çok hücreli sinyal kümesi) hareketi gösterir iken sinyal içeren tek bir hücre, herhangi bir hareketi gösterir. Her bir kartuş kaliteli protein 16-20 saat bombardımanı ifade analiz ederek kontrol edilebilir. Bizim protokol ⁶ sadece böylece bu deney için uygun olan bu zaman dilimi içinde bütün ifade olaylar <% 3, çok hücreli ifade kümeleri kapasiteli kartuşlar üretir .

3) DNA kaplı Mikroküreler Biyolistik Teslimat

1. Keskin bir jilet ile aynı gelişim aşamasında (yani aynı boyutta ve aynı yaş, adım 1) yaprakları çıkarın ve hemen eksen dışı tarafı yukarı bakacak şekilde, düz bir strafor yüzeye koyun. Yaprak eksen dışı tarafında nispeten küçük boyutu nedeniyle Arabidopsis yaprakları, pencere perde mesh bir parça ile kaplanmış olmalıdır. Alt trikom yoğunluğu ve ince kütikül nedeniyle bombardımanı için daha iyi bir substrat temsil eder ve sonra mesh pushpins ile güvence strafor yüzey. Bakımı düz parçacık teslim verimliliği artırır ve microbombardment sırasında doku hasarı en aza indirir bırakır.
2. Tabanca içine DNA kaplı mikro (adım 1 hazırlanan) kartuşu takın. Arabidopsis, çekim, 0.6 mikron mikro 1 mikron mikro ve 140-160 psi için 80-110 psi basınçta yapılır . N. benthamiana ve tütün 0.6 mikron mikro için, çekim 1 mikron mikro ve 160-180 psi 100-120 psi basınçta yapılır. Arabidopsis için her yaprak sadece bir atış mikro 10-12 mm çapında bir alana yayılır için yeterli yüzey alanına sahip olduğundan, genellikle, yaprak başına tek bir kartuş kullanmaktadır. Büyük N. ile benthamiana ve tütün yaprakları, aynı yaprak birden fazla bombardımanları mümkündür, ancak, onlar (Tartışma), aynı gelişimsel aşamada yaprak alanları hedef orta kaburga her iki tarafta simetrik pozisyonlarda yapılması gerekir .
3. Strafor yüzey yaprakları çıkarın ve onları i yerdeıslak Whatman filtre kağıdı 3 kat üzerinde bir Petri kabı, Parafilm Petri kabı mühür ve protein ürünleri teslim transgenlerin ve hücre-hücre hareketi potansiyel ifade izin oda sıcaklığında 36-48 saat süreyle inkübe .

4) Görüntüleme Protein Ekspresyonu

Geçici olarak ifade etiketli proteinlerin floresan sinyal konfokal mikroskobu ile görüntülenmiştir. Bakım her test protein tespiti için en uygun mikroskopi ayarları bulmak için alınmalıdır. Örneğin, proteinler, Tütün mozaik virüsü hareket protein (TMV MP) ^1-3,6 plasmodesmal yerelleştirme gibi zayıf sinyal intensitesi ile sınırlı intrasellüler birikimi, yüksek çözünürlük ve tanıyor 40X objektif lens altında gözlenen olmalıdır hassasiyet, oysa ücretsiz YFP gibi güçlü bir sinyal yoğunlukları, sitoplazmik dağılım gösterir proteinler daha hızlı görüntüleme için konfokal zoom fonksiyonu ile 10X objektif lens (bkz. Şekil 1) altında görüntülenmiştir olabilir.

Symplastic ulaşım, floresan sinyal içeren çok hücreli kümeleri görünümünü anlaşılmaktadır. Her küme, kümeler ve hücrelerin sayısı sayısı, hücre-hücre taşıma ölçüde göstergesidir. Güvenilir veri elde etmek için, her bir deneysel sistem başına en az 100 ekspresyonu kümeleri kayıt altına alınmalıdır. Örneğin, bir proteinin hücre-hücre hareketi toplam 200 ifade kümeleri iki farklı genetik geçmişleri (örneğin, vahşi tip ve transgenik bitkiler), karşılaştırıldığında ise kayıt altına alınmalıdır. Önemlisi, deneyler,, birbirlerine göre hangi sonuçları eşzamanlı olarak yürütülen olmalıdır.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Aşağıdaki şekil, floresan etiketli proteinlerin symplastic ulaşım tespiti için temsili deneyler göstermektedir. Paneller A ve B bir N. aşağıdaki microbombardment elde edilen tipik konfokal resimleri gösterir. TMV MP-YFP-ifade benthamiana yaprak oluşturun. Panelinde TMV MP-YFP symplastic hareket YFP sinyal çok hücreli kümeleri görünümünü dayalı görülmektedir. Tüm geçici olarak ifade TMV MP-YFP bazı microbombardments (panel B) tek hücreli sinyal kanıtladığı gibi hareket etmek mümkün değildir. İstatistiksel olarak, içinde <% 40 sayılır sinyal kümeleri, TMV MP-YFP ise hücreler arasında hareket edemez> kümelerin% 60, protein, iki hücre yayılmasını en sık olmak üzere, 2-5 hücreler arasında hareket eder (yaklaşık ~ 50 Olguların%) (Şekil 1C).

Doğuştan hareket aktivite olmadan, nispeten küçük moleküler boyutu ile proteinlerin hücre-hücre taşımak için PD yoluyla diffüz. Örneğin, ücretsiz YFP veya 1xYFP (yaklaşık 27 kDa, panel D) sayılır kümeleri (panel C)% 30 çeşitli hücreler arasında yayılır. Bu non-spesifik difüzyon TMV MP-YFP füzyon proteini (57 kDa) boyutu karşılaştırılabilir ve tamamen hücre özerk olduğu bir translasyonel YFP sönük veya 2xYFP (54 kDa, panel E) oluşmaz (Şekil 1C).

N. symplastic taşıma testte elde edilen Şekil 1. Tipik sonuçlar benthamiana yaprak dokuları. (A, B) Görselleştirme TMV MP-YFP. (C) sinyal kümeleri kantitasyonu. 1xYFP ve 2xYFP, ücretsiz YFP ve sırasıyla translasyonel YFP dimer. (D) 1xYFP Görselleştirme. (E) 2xYFP Görselleştirme. Mikrograflar, sol paneller YFP sinyal göstermiyor ve sağ panelleri birleştirilmiş YFP görüntüleri (yeşil) ve kloroplast otofloresans (beyaz) sinyalleri gösteriyor. Görüntüler tek konfokal bölümleridir. Mikrograflar Asteriskler YFP sinyali gösteren epidermal hücreler göstermektedir. Barlar = 50 mm.

Tartışmalar

Symplastic taşıma testinin başarı için anahtar, yüksek dönüşüm verimliliği, istatistiksel olarak anlamlı ve kolayca detectible sinyal kümeleri üretimini sağlar elde etmektir. Bu, sağlıklı, sağlam bitkiler hasat yapraklar kullanılarak, saf ve yoğun bir DNA hazırlığı ile kaplı altın parçacıkları hazırlanması sağlanabilir.

Aynı büyüme aşamasında yaprakları kullanarak da testin güvenilirliği için hayati önem taşımaktadır. Plasmodesmal diyafram farkl?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Gold microparticles, 1.0 μm in diameter	Bio-Rad	165-2262
Gold microparticles, 0.6 μm in diameter	Bio-Rad	165-2263
Spermidine	Sigma-Aldrich	S0266-1G
Tefzel tubing	Bio-Rad	165-2441
Helios cartridge preparatory station	Bio-Rad	165-2420
Tubing cutter	Bio-Rad	165-2422
Helios gene gun	Bio-Rad	165-2432
Helium gas regulator	Bio-Rad	165-2413