مضان الانتعاش بعد Photobleaching (FRAP) من البروتينات المرتبطة دلاليا الإسفار في العمود الفقري شجيري الخلايا العصبية الحصين مثقف

Summary

وقد استخدمت لتحديد FRAP تنقل الإسفار البروتين الأخضر (GFP) الموسومة البروتينات في الخلايا المستزرعة. درسنا الكسور متنقلة / متحركة للGFP من خلال تحليل نسبة الانتعاش بعد photobleaching مضان. في هذه الدراسة ، تم تنفيذ FRAP في العمود الفقري من الخلايا العصبية قرن آمون.

Abstract

وقد استخدمت لتحديد FRAP تنقل GFP الموسومة البروتينات. باستخدام ليزر قوية الإثارة ، هو ابيض ومضان من البروتين GFP الموسومة في المنطقة من الفائدة. ومضان في المنطقة عندما يتعافى غير مقصور GFP الموسومة البروتين من خارج منطقة ينتشر في المنطقة من الفائدة. ثم يتم تحليل التنقل من البروتين عن طريق قياس معدل الاسترداد مضان. ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد خصائص التنقل البروتين ومعدل الدوران.

في هذه الدراسة ، فإننا نعرب عن ناقلات EGFP (بروتين الفلورية الخضراء المعززة) في الخلايا العصبية الحصين مثقف. باستخدام مجهر زايس 710 مبائر ، ونحن photobleach إشارة مضان من البروتين GFP في العمود الفقري واحدة ، ومن ثم التقاط صور الفاصل الزمني لتسجيل انتعاش بعد photobleaching مضان. وأخيرا ، فإننا نقدر أن نسبة الكسور المتنقلة وغير متحرك في GFP في العمود الفقري ، من خلال تحليل البيانات باستخدام التصوير ImageJ Graphpad والبرمجيات.

هذا البروتوكول FRAP يوضح كيفية إجراء التجربة FRAP الأساسية وكذلك كيفية تحليل البيانات.

Protocol

1. عصبون ترنسفكأيشن

1. ثقافة الفئران يوم 18 (E18) الخلايا العصبية الجنينية في قرن آمون بولي د يسين المغلفة ماتيك 35 ملم أسفل الزجاج الأطباق ^1. في الفترة من 16-18 يوما في المختبر (DIV) ، باستخدام الخلايا العصبية transfect CalPhos Clontech كيت ترنسفكأيشن الثدييات. الأولى ، يستعاض عن مستنبت مع 1.5 مل من النسر Dulbecco متوسطة التعديل (DMEM) بنسبة 35 ملم 0.5 ساعة قبل الطبق ترنسفكأيشن. حفظ المتوسطة الثقافة الأصلية في أنبوب 15 مل معقمة للاستعمال (خطوة 1.6) في وقت لاحق.
2. مزيج 10 ميكروغرام pEGFP - N1 DNA البلازميد مع العقيمة O ₂ H (Clontech) و 12.4 م 2 ميكرولتر الكالسيوم الحل (Clontech) إلى وحدة تخزين ما مجموعه 100 ميكرولتر.
3. إضافة خليط من الخطوة 1.2) إلى 100 ميكرولتر 2 × HBS قطرة قطرة بينما vortexing 2 × HBS على سرعة متوسطة.
4. السماح للخليط الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقائق ثم يضاف خليط من الخطوة النهائية 1.3) في DMEM - المحتضنة الخلايا العصبية.
5. وضع الخلايا العصبية بالعودة الى الحاضنة 37 درجة مئوية ل1-1،5 ساعات.
6. إزالة فوسفات الكالسيوم المحتوية على المتوسط ​​، ثم تغسل الخلايا التي تحتوي على ثلاث مرات DMEM. قبل أن تعود إلى الطبق الثقافة وتبادل حاضنة المتوسط ​​DMEM مع مستنبت الأصلي.

2. التجربة FRAP على العمود الفقري

1. وتستخدم الخلايا العصبية للتجربة FRAP 2-4 أيام بعد ترنسفكأيشن.
2. استبدال مستنبت من صحن الزجاج السفلي 35 ملم ، وذلك بإضافة فورا قبل حلول Tyrode تحسنت ، والذي يحتوي على (مم) كلوريد الصوديوم 145 ، بوكل 5 ، HEPES 10 ، 10 الجلوكوز ، جليكاين 0.005 ، CaCl ₂ 2.6 ، وMgCl ₂ 1.3 (7.4 درجة الحموضة تعديلها لمع هيدروكسيد الصوديوم).
3. ويستخدم مجهر 710 LSM زايس مبائر للتجربة FRAP. ويستخدم نظام TempModule زايس للتحكم في درجة الحرارة (37 درجة مئوية) ، والرطوبة ، وأول أكسيد الكربون ₂ (5 ٪) من نظام العمل. تأكد من أن يتم توصيل ₂ CO دبابات ويتم تعبئة زجاجة مياه ، والذي يستخدم لموازنة الرطوبة ، مع الماء.
4. العثور على تغصن transfected ناضجة مع الهدف × 100 (لامزيغ αplan - 100 × / 1.46 النفط). إذا كانت الخلايا transfected في صحن ومتفرق ، والبحث عن خلية المطلوب مع 40 × الهدف (خطة NEOFLUAR - 40 × 1.3 / النفط) ، ومن ثم التبديل إلى 100 × هدف لالتقاط الصور.
5. استخدام 5 × زوم بصري × 256 والقرار 256 بكسل لصورة قطعة قصيرة من تغصن مع أشواك عديدة. لالتقاط الصور ، واستخدام السرعة الاسمية 9 (بكسل يسكن الوقت μsec 3.15) والتي تأخذ 0.5 ثانية على الانتهاء من المسح الضوئي. تم تعيين الثقب إلى الحصول على 2μm مضان قوية. عند التقاط الصور ، في محاولة لاستخدام الليزر منخفض انتقال ، على سبيل المثال 1-5 ٪ ، لتجنب photobleaching الصورة بأكملها.
6. حدد العمود الفقري للاهتمام. في تجربتنا ، نختار العمود الفقري فطر بأقطار من رأس العمود الفقري من 1 ميكرون ~.
7. للقيام بتجربة FRAP ، التقاط صور السيطرة 5 قبل التبييض ، ثم التبييض العمود الفقري من 10 مرات في الفائدة الاسمية انتقال الليزر 100 ٪ [قوة ليزر الأرجون هو 30 ميغاواط ، مع 50 ٪ (15 ميغاواط) في خط ليزر 488 ، و 3-4 ميغاواط تقريبا تصل إلى مجهر من خلال خط ليزر 488] ، ثم والتقاط سلسلة من الصور مباشرة بعد التبييض. عن هذه التجربة ، ويتم التقاط الصور في كل ثانية 1 لمدة 15 ثانية بعد التبييض. وينبغي تعديل الفاصل الزمني وفقا لمختلف البروتينات التي تستهدف وتصاميم تجريبية مختلفة (الشكل 1).
8. حفظ الصور.

3. تحليل البيانات

1. فتح صور مع برنامج ImageJ.
2. محاذاة كومة من الصور باستخدام أداة محاذاة ('المداخن -- خلط' الإضافات '→ →" محاذاة الشرائح في كومة 'هيئة جامدة' الترجمة 'و / أو →) في ImageJ ، بحيث العمود الفقري للمصلحة لا تطفو وبعبارة أخرى -- فإنه يبقى في نفس الموقف على الصورة.
3. قياس كثافة مضان النسبي للعمود الفقري من الفائدة (F _ق) ، وهي منطقة transfected لكن غير مقصور (مراقبة) ، والمنطقة الخلفية (اف _ب) في الصور الفاصل الزمني ، وذلك باستخدام أداة "كثافة الزمن الخامس مراقب" من ImageJ ('الإضافات "→" مداخن -- خلط "→" كثافة الزمن الخامس مراقب '). ويمكن السيطرة على المنطقة أن تكون قطعة من جيدة التركيز تغصن القاصي. المنطقة الخلفية هي منطقة غير الفلورسنت.
4. حساب معدل photobleaching (ص) من خلال مقارنة مضان في المنطقة تحكم من قبل (F _C0) وبعد (F _ج) photobleaching.
   ص = _ج F / F _C0.
5. تطبيع كثافة مضان في العمود الفقري الهدف (F) على النحو التالي :
   F = _(ق F -- F _ب) / ر.
6. منحنى تناسب كثافة مضان في العمود الفقري الهدف مع معادلة واحدة من البرمجيات المرحلة الأسي بريزم Graphpad (الشكل 2) أو آلات موسيقية أخرىص برامج مماثلة.
7. حساب الكسر المحمول (و _م) والكسر متحركة (و _ط) من خلال المعادلات التالية :
   و _م = _∞ F / F _{0 ،}
   حيث F _∞ هو كثافة مضان بعد الشفاء التام ، وواو ₀ هو كثافة مضان قبل photobleaching.
   و _ط = 1 -- و _م.

4. ممثل النتائج :

في هذه الدراسة ، ونحن إجراء تجربة FRAP على الخلايا العصبية الحصين ناضجة. في 18-22 DIV ، وبالفعل شكلت العمود الفقري الفطر. باستخدام طريقة لدينا ، يمكن تسجيل التغييرات الدينامية للكثافة مضان في منطقة صغيرة ، مثل العمود الفقري ،.

لتحليل عملية التعافي من EGFP مضان ، ونحن نأخذ 5 الصور والضوابط قبل تبيض ثم 1 صورة كل 1 ثانية مباشرة بعد التبييض لمدة 15 ثانية. القرار للصورة كافية للتحليل الكمي. ملامح الانتعاش مضان من البروتينات يتم استنساخه مضان المفتاحية للغاية.

نحن ايضا لفترة وجيزة تبين كيفية تعريف الكسور المتنقلة وغير متحرك مضان من البروتين ، وذلك باستخدام برامج ImageJ وGraphpad بريزم. يمكن أن يكون الأسلوب وتحليل FRAP نعرض هنا تستخدم على نطاق واسع في علم الأعصاب ، وعلم الأحياء الخلوي وغيرها من الدراسات.

الشكل 1. FRAP قياسات مضان EGFP في العمود الفقري من الخلايا العصبية الحصين a مثقف. وتشير السهام الحمراء وقت photobleaching. صور فوتوغرافية تمثل نفس المنطقة قبل (قبل) وphotobleaching في 0 ، 1 ، 5 ، 10 ، 15 ثانية بعد. وتتميز منطقة السيطرة ، العمود الفقري والخلفية مع الحروف S ، C و B ، على التوالي. واستمرت الخلايا العصبية في 37 درجة مئوية خلال التجربة. شريط النطاق ، 1 ميكرون.

الشكل 2. منحنيات FRAP من مضان EGFP على مدى فترة 15 ثانية. الخط الأخضر يبين منحنى الأصلي ، والخط الأحمر يظهر منحنى تطبيع. النقاط على المنحنيات تظهر FRAP كل ثانية 1. تم تركيبها من قبل أحد المنحنيات المرحلة المعادلات الأسية. تم احتساب متوسط ​​مضان قبل photobleaching الى 100 ٪. في هذه التجربة ، الكسر المحمول (وسط) هي 94 ٪ ونسبة غير متحركة (IF) هو 6 ٪.

Discussion

وقد تم استخدام التحليل FRAP نطاق واسع في الجسم الحي والدراسات في المختبر ^1-2. هذه التقنية تستخدم عادة GFP البروتينات الانصهار ، على الرغم من أنه يمكن أيضا استخدام البروتينات الانصهار الطحالب الحمراء ^3. هذا التحليل هو حساس ويمكن استخدامها لوصف حركة GFP الموسومة البروتينات.

لإنتاج معنى FRAP التحليل ، فإنه من المهم تجنب photobleaching لا لزوم لها قبل وخلال التجربة FRAP. هناك طريقتان لتحقيق ذلك. أولا ، ينبغي لهذه العملية للبحث ومراقبة الخلايا العصبية التجريبية تكون سريعة. خاصة ، ورصد الخلايا العصبية مع الهدف 100X لفترة طويلة بشكل ملحوظ التبييض مضان. الثانية ، قوة الليزر عالية والمسح الضوئي متكررة كثيرا ما تزيد من احتمال photobleaching. وبالتالي ، سيكون من الضروري لحساب معدل photobleaching في منطقة التحكم ثم تطبيع منحنى FRAP في المنطقة التجريبية. وقد وصفت طريقة تطبيع في البروتوكول (راجع الخطوة 3،3-3،5 للحصول على التفاصيل).

الخطوة photobleaching أمر بالغ الأهمية أيضا لضمان تحقيق نتائج جيدة FRAP. في هذه التجربة ، ونحن التبييض العمود الفقري من الفائدة 10 مرات في 100 ٪ انتقال الليزر. هذا الشرط يكفي لتبييض مضان من العمود الفقري على مستوى الخلفية في إعداد الثابتة. وبالتالي ، وضعنا كثافة مضان لنفس العدد في الخلفية 0 ثانية بعد photobleaching. اعتمادا على سرعة الفحص الأولى ، قد بالفعل قدرا كبيرا من الانتعاش مضان عندما يتم الكشف عن هذا البروتين من الفائدة هو كثيري التنقل.

وقد وضعت العديد من المجسات بروتين فلوري لدراسة ديناميات البروتين مع FRAP. نهج تكميلية ، على سبيل المثال ، لاستخدام photoactivatable GFP (PA - GFP) ، أو متغيرات photoconvertible. جنبا إلى جنب مع تقنية FRAP ، أصبحت هذه الأدوات التي لا غنى عنها للعيش دراسات التصوير الخلية ^4-6.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass-bottom dishes		MatTek	P35GC-1.0-14-C
CalPhos Mammalian Transfection Kit		Clontech	631312
pEGFP-N1 plasmid		Clontech	6085-1
Zeiss confocal microscope		Zeiss	LSM 710
Zeiss TempModule system		Zeiss	N.A.
ImageJ software		NIH	N.A.
Graphpad Prism software		Graphpad software	N.A.