Kültür Hipokampal Nöronlar Dendritik Spine Floresan Takip edilen Proteinler Photobleaching sonra Floresan Kurtarma (sıkı bağlamak)

Özet

Sıkı bağlamak, Yeşil Floresan Protein (GFP) etiketli kültür hücreleri proteinlerin hareketliliği ölçmek için kullanılır olmuştur. Biz photobleaching sonra floresan kurtarma yüzdesi analiz ederek, GFP mobil / hareketsiz kesirler inceledi. Bu çalışmada, sıkı bağlamak hipokampal nöronlar, dikenler yapıldı.

Özet

Sıkı bağlamak GFP etiketli proteinler hareketliliği ölçmek için kullanılır olmuştur. , Güçlü bir uyarım lazer kullanarak, bir GFP etiketli proteinin floresan ilgi bölgede ağartılmış. Bölge bölge dışından ağartılmamış GFP etiketli protein ilgi bölgeye yayılır floresan kurtarır. Protein hareketlilik floresan iyileşme oranı ölçerek analiz edilir. Bu teknik, protein hareketlilik ve devir hızı karakterize etmek için kullanılabilir.

Bu çalışmada, kültür hipokampal nöronlarda (gelişmiş yeşil flüoresan protein) EGFP vektör ifade eder. Zeiss 710 konfokal mikroskop kullanarak, tek bir omurga GFP proteinin floresan sinyal photobleach ve sonra photobleaching sonra floresan kurtarma kaydı zaman atlamalı görüntüleri çekmek. Son olarak, ImageJ ve GraphPad yazılımları kullanarak görüntüleme verileri analiz ederek, dikenler, GFP mobil ve sabit kesirler yüzdesi tahmin ediyoruz.

Bu sıkı bağlamak protokolünün yanı verilerini analiz etmek için nasıl bir temel sıkı bağlamak deneyi gerçekleştirmek için nasıl gösterir.

Protokol

1. Nöron transfeksiyon

1. Poli-d-lizin kaplı Mattek Kültür embriyonik gün 18 (E18) sıçan hipokampal nöron 35 mm cam alt yemekleri ^1. (DIV), in vitro 16-18 gün Clontech CalPhos Memeli Transfeksiyon kiti kullanılarak transfect nöronlar. İlk olarak, 1,5 ml kültür ortamı değiştirmek Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta transfeksiyon önce 35 mm çanak 0.5 saat başına (DMEM). Daha sonra (adım 1.6) kullanımı için 15 ml steril bir tüp içinde özgün bir kültür ortamı kaydedin.
2. Steril H ₂ O (Clontech) ve toplam hacmi 100 ul 12.4 ul 2 M kalsiyum solüsyonu (Clontech) ile 10 mg pEGFP-N1 plazmid DNA karıştırın.
3. 100 ul 2 adım 1.2) karışımı ekleyin. × HBS damla damla vorteks 2 iken × orta hızda HBS.
4. Karışımı oda sıcaklığında 20 dakika oturup sonra DMEM inkübe nöronlar adım 1.3) son karışımı ekleyin.
5. Nöronlar 1-1.5 saat boyunca 37 ° C inkübatör içine geri koyun.
6. Kalsiyum fosfat içeren orta çıkarın, sonra hücreleri DMEM üç kez yıkayın. Orijinal bir kültür ortamı ile DMEM orta inkübatör, döviz kültür çanak dönmeden önce.

2. Bir omurga üzerinde sıkı bağlamak deney

1. Nöronlar transfeksiyon 2-4 gün sonra sıkı bağlamak deney için kullanılır.
2. (MM) içeren 145 NaCl, KCl 5, HEPES 10, Glikoz 10, Glycine 0.005, CaCl _2, 2.6 ve MgCl önceden ısıtılmış Tyrode Çözüm, hemen ekleyerek, 35 mm cam alt çanak kültür ortamı değiştirin ₂ 1.3 (7.4 NaOH ile pH değeri ayarlanmış).
3. Zeiss LSM 710 konfokal mikroskop sıkı bağlamak deney için kullanılır. Zeiss TempModule sistemi (37 ° C) sıcaklık, nem ve çalışma sistemi, CO ₂ (% 5) kontrol etmek için kullanılır. CO ₂ tank bağlı ve nem dengeleme için kullanılan su şişesi, su ile dolu olduğunu emin olun.
4. 100 × objektif (αplan APOCHROMAT 100 × / 1,46 yağ) ile transfekte olgun dendrit bulun. Çanak transfekte hücreler seyrek istenen bir hücre için, 40 ile arama × hedefi (plan-NEOFLUAR 40 × yağ / 1.3) ve daha sonra 100 geçmek × görüntü yakalamak için objektif.
5. Kullanım 5 × optik zoom ve görüntü birkaç dikenleri ile dendrit kısa bir parça için 256 × 256 piksel çözünürlük. Çekim yapmak için, 0.5 saniyede bir tarama bitirmek için gereken nominal hızı 9 (durmak piksel zaman 3.15 μsec) kullanın. Iğne deliği güçlü floresan elde 2μm için ayarlanır. Görüntüleri çekerken, tüm görüntü photobleaching önlemek için, örneğin% 1-5, düşük lazer iletim kullanmayı deneyin.
6. Ilgi omurga seçin. Yaptığımız denemelerde, mantar dikenler ~ 1 mikron omurga kafa çapları seçin.
7. Sıkı bağlamak deney yapmak için, 488 lazer çizgisi% 50 (15 mW), argon lazer gücü 30 mW [çamaşır suyu, sonra beyazlatma önce% 100 lazer iletim, nominal faiz 10 kez omurga 5 kontrol görüntüleri alabilir ve yaklaşık 3-4 mW 488 lazer çizgisi ile mikroskop ulaşır ve daha sonra, hemen beyazlatma sonra görüntülerin bir seri yakalamak. Bu deneme için, görüntüleri beyazlatma sonra 15 saniye boyunca her 1 saniyede yakalanır. Zaman aralığı, farklı hedefleme proteinler ve farklı deneysel tasarımları (Şekil 1) göre ayarlanmalıdır .
8. Görüntüleri kaydetme.

3. Veri analizi

1. ImageJ yazılımı ile görüntüleri açın.
2. Ilgi omurga float değildir, böylece ImageJ - (→ → 'çeviri' ve / veya katı cisim '' yığın dilim align 'eklentileri' → 'karıştırma yığınları) hizalamak aracı kullanarak görüntü yığınını hizalayın Diğer bir deyişle bu görüntü üzerinde aynı pozisyonda kalır.
3. ImageJ 'Şiddeti v Zaman Monitör' aracı ('eklentileri kullanarak, ilgi (F), omurga, transfekte ama ağartılmamış bölgeye (kontrol) ve zaman atlamalı görüntüler bir arka plan bölgesi (F _b) göreceli floresan ölçün '→' yığınlarının - karıştırma '→' Şiddeti v Zaman Monitör '). Kontrol bölgesi, iyi odaklanmış distal dendrit bir parçası olabilir. Arka plan bölgesi, floresan olmayan bir bölgedir.
4. Önce (F _c0) ve (F _c) photobleaching sonra kontrol bölgenin floresan karşılaştırarak photobleaching oranı (r) hesaplayın.
   r = F _/ F _c0.
5. Normale hedef omurganın floresan yoğunluğu (F) aşağıdaki gibi:
   F = (F - F _b) / r
6. Eğri bir fazlı üstel GraphPad Prism yazılım denklemi (Şekil 2) veya Othe hedef omurga floresan sığdırmakr da benzer bir yazılım.
7. Cep fraksiyonu _(f) ve (f _i) aşağıdaki denklemler hareketsiz fraksiyonu hesaplayın:
   f _m = F _∞ / F _0,
   burada F _∞ tam iyileşme sonra floresan ve F ₀ photobleaching önce floresan.
   f _i = 1 - f _m.

4. Temsilcisi Sonuçlar:

Bu çalışmada, biz olgun hipokampal nöronlar üzerinde sıkı bağlamak deney gerçekleştirir. 18-22 DIV, mantar dikenler zaten oluşur. Bizim yöntemini kullanarak, bir omurga gibi küçük bir bölgede floresan yoğunluğu, dinamik değişimler kaydedilebilir.

EGFP floresan kurtarma işlemini analiz etmek, ağartma önce kontrol olarak 5 görüntüler ve daha sonra 15 saniye için ağartma hemen sonra her 1 saniyede 1 resim alır. Görüntünün çözünürlüğü kantitatif analiz için yeterli. Etiketli floresan proteinleri floresan kurtarma profilleri yüksek tekrarlanabilir.

Biz de kısaca ImageJ ve GraphPad Prism yazılımı kullanarak bir floresan protein, mobil ve sabit kesirler, nasıl tanımlanacağı göstermektedir. Burada göstereceğimiz sıkı bağlamak yöntem ve analiz geniş nörobilim, hücre biyolojisi ve diğer çalışmalarda kullanılabilir.

Şekil 1 bir kültür hipokampal nöron bir omurga EGFP floresan sıkı bağlamak ölçümleri. Kırmızı ok uçları photobleaching zaman gösterir. Fotoğraflar önce aynı bölgede (Ön) temsil eder ve photobleaching 0, 1, 5, 10, 15 saniye sonra. Omurga, kontrol ve arka bölge sırasıyla S, C ve B harfleri ile işaretlenmiş. Nöronlar deney sırasında 37 ° C'de muhafaza edildi. Ölçeği bar, 1 mikron.

Şekil 2 EGFP floresan 15 saniyelik bir süre içinde sıkı bağlamak eğrileri . Yeşil hat orijinal eğrisi gösterir; kırmızı çizgi normalize eğri gösterir. Eğrileri üzerinde nokta sıkı bağlamak, her 1 saniyede göstermektedir. Eğrileri tek fazlı üstel denklemler tarafından takıldı. Photobleaching önce ortalama floresan% 100 olarak sayılmıştır. Bu deneyde, cep fraksiyonu (MF),% 94 ve hareketsiz fraksiyonu (IF)% 6.

Tartışmalar

In vivo ve in vitro ^1-2 çalışmalar sıkı bağlamak analiz geniş kullanılmıştır. Bu teknik yaygın GFP kullanır füzyon proteinleri aynı zamanda kırmızı alg füzyon proteinleri ³ rağmen. Bu analiz, duyarlı ve GFP-etiketli proteinlerin hareketliliği karakterize etmek için kullanılabilir.

Anlamlı sıkı bağlamak analiz üretmek için, önce ve sıkı bağlamak deney sırasında gereksiz photobleaching önlemek için önemlidir. Bunu başarmak için iki yol vardır. İlk olarak, arama ve deneysel nöron gözlemlemek süreci hızlı olmalıdır. Özellikle, uzun bir süre 100X amacı ile nöronların gözlem önemli ölçüde floresan beyazlatıcılar. İkincisi, yüksek lazer gücü ve sık sık tarama genellikle photobleaching olasılığını artırır. Bu nedenle, bir kontrol bölgede photobleaching oranını hesaplamak ve ardından deneysel bölgede sıkı bağlamak eğrisi normalleştirmek için gerekli olacaktır. Normalizasyon yöntemi protokol tarif edilmiştir (Detaylar için adım 3,3-3,5 bakınız).

Photobleaching adım, aynı zamanda, iyi bir sıkı bağlamak sonuç sağlanması için kritik öneme sahiptir. Bu deneyde, çamaşır suyu,% 100 lazer iletim ilgi 10 kat omurga. Bu durum, çamaşır suyu, sabit bir hazırlık arka plan seviyesi bir omurga floresan yeterli. Böylece, photobleaching sonra 0 saniye arka planı olarak aynı sayıda floresan yoğunluğunu ayarlayın. İlk tarama hızına bağlı olarak, önemli miktarda bir floresan kurtarma zaten ilgi protein son derece mobil tespit olabilir.

Birçok floresan protein probları sıkı bağlamak protein dinamiklerini incelemek için geliştirilmiştir. Tamamlayıcı bir yaklaşım photoactivatable GFP (PA-GFP), ya da photoconvertible türevleri, örneğin. Sıkı bağlamak tekniği ile birlikte, bu araçları, canlı hücre görüntüleme ^{çalışmaları} 4-6 için vazgeçilmez olma .

Malzemeler

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass-bottom dishes		MatTek	P35GC-1.0-14-C
CalPhos Mammalian Transfection Kit		Clontech	631312
pEGFP-N1 plasmid		Clontech	6085-1
Zeiss confocal microscope		Zeiss	LSM 710
Zeiss TempModule system		Zeiss	N.A.
ImageJ software		NIH	N.A.
Graphpad Prism software		Graphpad software	N.A.