Флуоресценция Восстановление после фотообесцвечивания (FRAP) флуоресценции меткой Белки в Дендритные Шипы культивированный нейронов гиппокампа

Резюме

FRAP была использована для количественного мобильность Зеленый флуоресцентный белка (GFP), помеченные белков в культуре клеток. Мы рассмотрели мобильных / неподвижные доли GFP путем анализа флуоресценции процент выздоровления после фотообесцвечивания. В этом исследовании, FRAP была выполнена на шипы нейронов гиппокампа.

Аннотация

FRAP была использована для количественной оценки подвижности GFP с метками белков. Использование сильного лазерного возбуждения флуоресценции GFP с метками белка отбеливается в области интереса. Флуоресценции области восстанавливается при небеленой GFP с метками белка из-за пределов региона диффундирует в область интересов. Подвижность белка затем анализируется путем измерения флуоресценции скорость восстановления. Этот метод может быть использован для характеристики подвижности белка и текучести кадров.

В этом исследовании, мы выражаем (улучшенный зеленый флуоресцентный белок) EGFP вектор в культуре нейронов гиппокампа. Использование Zeiss 710 конфокальной микроскопии, мы photobleach флуоресценции сигнал GFP белка в одном позвоночника, а затем получать изображения промежуток времени для записи флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания. Оценим, наконец, процент подвижных и неподвижных доли GFP в шипы, на основе анализа данных с использованием изображений ImageJ и GraphPad программного обеспечения.

Этот протокол FRAP показано, как выполнять основные эксперимент FRAP, а также, как анализировать данные.

протокол

1. Нейрон трансфекции

1. Культуры эмбриональных крыс день 18 (E18) нейронов гиппокампа на поли-D-лизин покрытием Маттек 35-мм со стеклянным дном блюда ^1. На 16-18 дней в пробирке (DIV), трансфекции нейронов использованием Clontech CalPhos млекопитающих Kit трансфекции. Во-первых, заменить культуральной среде с 1,5 мл изменения Eagle Дульбеко среднего (DMEM) в 35-мм блюдо 0,5 часа до трансфекции. Сохраните оригинальную питательную среду в стерильные 15 мл трубку для последующего использования (шаг 1,6) использования.
2. Смешайте 10 мкг pEGFP-N1 ДНК плазмиды стерильной H ₂ O (Clontech) и 12,4 мкл 2 М раствор кальция (Clontech) до общего объема 100 мкл.
3. Добавить смесь из шага 1.2) до 100 мкл 2 × HBS по каплям при вортексе 2 × HBS на средней скорости.
4. Пусть смесь сидеть при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем добавить конечной смеси с шага 1.3) в DMEM-инкубировали нейронов.
5. Положите нейронов обратно в 37 ° C инкубатора в течение 1-1,5 часов.
6. Удалить из фосфата кальция среде, содержащей, затем промыть клетки с DMEM три раза. Перед возвращением культуры блюдо инкубатор, обмен среде DMEM с оригинальным питательной среды.

2. FRAP эксперимент по позвоночнику

1. Нейроны используются для FRAP эксперимент двух до четырех дней после трансфекции.
2. Замените культуральной среде с 35-мм со стеклянным дном тарелку, добавив, немедленно подогретого Tyrode Решение, которое содержит (в мМ) NaCl 145, KCl 5, HEPES 10, Глюкоза 10, Глицин 0,005, CaCl ₂ 2.6 и MgCl ₂ 1.3 (рН до 7,4 с NaOH).
3. Zeiss LSM 710 конфокальной микроскопии используется для FRAP эксперимента. Система Zeiss TempModule используется для контроля температуры (37 ° С), влажности и CO ₂ (5%) из работающей системы. Убедитесь, что CO _2, танк подключен и бутылку воды, которая используется для балансировки влажности, заполнен водой.
4. Найти трансфицированных зрелых дендритных с 100 × цели (αplan-Apochromat 100 × / 1,46 масла). Если трансфекции клеток в блюдо редкие, поиск нужную ячейку с 40 × цель (план-NEOFLUAR 40 × / 1,3 масла), а затем переключиться на 100 × цель для захвата изображений.
5. Используйте 5 × оптический зум и 256 × 256 пикселей на изображение небольшой фрагмент дендрита с несколькими шипами. Для захвата изображения, использовать номинальной скорости 9 (пиксель время задержки 3,15 мкс), который занимает 0,5 секунды, чтобы закончить проверку. Обскуры установлен в 2 мкм, чтобы получить сильную флуоресценцию. При съемке изображений, попробуйте использовать низкие передачи лазера, например, 1-5%, чтобы избежать фотообесцвечивания всего изображения.
6. Выберите позвоночника интересов. В нашем эксперименте мы выбираем гриб шипами с позвоночником головы диаметром ~ 1 мкм.
7. Для этого FRAP эксперимент, возьмите 5 изображений контроль до отбеливания, то отбеливатель позвоночника интерес в 10 раз при номинальной 100% лазерной передачи [власти аргонового лазера составляет 30 мВт, при этом 50% (15 мВт) в 488 лазерных линий, а примерно 3-4 мВт достигает микроскопом через 488 лазерных линий], а затем захват серии изображений сразу после отбеливания. Для этого эксперимента, что изображения будут захвачены каждую 1 секунду в течение 15 секунд после отбеливания. Промежуток времени должен быть скорректирован в зависимости от различных ориентации белков и различных экспериментальных конструкций (рис. 1).
8. Сохранение изображений.

3. Анализ данных

1. Открытие изображений с ImageJ программного обеспечения.
2. Выровняйте стопку фотографий с помощью инструмента выравнивания ('стеки - перетасовка "," плагины "→ →" выровнять ломтики в стеке' → «перевод» и / или «твердого тела») в ImageJ, так, чтобы позвоночник интерес не плавает , другими словами - он остается в том же положении на изображении.
3. Мера относительной интенсивности флуоресценции позвоночника интереса (F _ы), трансфицированных но небеленой регионе (контроль), и фона области (F _б) в образах промежуток времени, используя инструмент "Интенсивность V Time Monitor 'из ImageJ (" плагинов '→' стеки - перетасовка '→' Интенсивность V Time Monitor "). Контроль региона может быть частью целенаправленной дистальных дендрита. Фон регионе не является люминесцентная регионе.
4. Рассчитать фотообесцвечивания ставка (г), сравнивая флуоресценции контрольного региона до (F _c0) и после (F _в) фотообесцвечивания.
   г = F _C / F _с0.
5. Нормализация интенсивности флуоресценции целевой позвоночника (F) следующим образом:
   F = (F _ы - F _б) / r.
6. Кривая соответствует интенсивности флуоресценции целевой позвоночника с однофазной экспоненциальным уравнением программного обеспечения Призма GraphPad (рис. 2) или КетеГ подобного программного обеспечения.
7. Рассчитать мобильных фракции (е _м) и неподвижные фракции (е _я) следующими уравнениями:
   _F M = F _∞ / F _0,
   где F _∞ является интенсивность флуоресценции после полного восстановления, а F ₀ является интенсивность флуоресценции до фотообесцвечивания.
   F ₌ 1 - е _м.

4. Представитель Результаты:

В этом исследовании мы проводим эксперимент по FRAP зрелых нейронов гиппокампа. На 18-22 DIV, грибы шипы уже сформировались. Используя наш метод, динамические изменения интенсивности флуоресценции в небольшой области, например, позвоночника, могут быть записаны.

Для анализа флуоресценции процесс восстановления EGFP, мы берем 5 изображений в качестве контроля перед отбеливанием, а затем 1 изображение каждые 1 секунды сразу после отбеливания в течение 15 секунд. Разрешение изображения достаточно для количественного анализа. Флуоресценции профилей восстановления меченых флуоресценции белков высокой воспроизводимостью.

Мы также кратко показать, как определить подвижные и неподвижные доли флуоресценции белка, используя ImageJ и GraphPad Призма программного обеспечения. Метод FRAP и анализа мы показываем здесь, могут быть широко использованы в неврологии, клеточной биологии и других исследований.

Рисунок 1. FRAP измерения флуоресценции EGFP в позвоночнике от культурных гиппокампа нейрона. Красные стрелки указывают время фотообесцвечивания. Фотографии представляют той же области до (Pre) и 0, 1, 5, 10, 15 секунд после фотообесцвечивания. Отделе позвоночника, контроль и фона, помечены буквами S, C и B, соответственно. Нейроны были сохранены при 37 ° С в течение эксперимента. Шкала бар, 1 мкм.

Рисунок 2. FRAP кривых флуоресценции EGFP в течение 15-секундного периода. Зеленая линия показывает оригинальной кривой, красная линия показывает нормированный кривой. Точками на кривых показывают FRAP каждую 1 секунду. Кривые были установлены на одну фазу показательные уравнения. Средний флуоресценции до фотообесцвечивания считался 100%. В этом эксперименте мобильных фракции (MF) составляет 94%, а неподвижные фракции (ИФ) составляет 6%.

Обсуждение

FRAP анализ был широко используются в естественных условиях и в пробирке ^1-2 исследований. Эта техника широко использует GFP слитых белков , хотя она может также использовать красные водоросли белков слияния ^3. Этот анализ чувствительны и могут быть использованы для характеристики мобильности GFP с метками белков.

Для получения полноценного анализа FRAP, важно, чтобы избежать ненужных фотообесцвечивания до и во время FRAP эксперимента. Есть два пути для достижения этого. Во-первых, процесс поиска и наблюдения экспериментальных нейрон должен быть быстрым. В частности, наблюдения нейронов с 100X цель в течение длительного времени значительно отбеливает флуоресценции. Во-вторых, высокая мощность лазерного сканирования и частые часто увеличивают возможность фотообесцвечивания. Таким образом, необходимо будет рассчитать фотообесцвечивания ставка в контрольной области, а затем нормализовать FRAP кривой в экспериментальной области. Нормализации метод был описан в протоколе (см. шаг 3.3-3.5 право).

Фотообесцвечивания шаг также решающее значение для обеспечения хороших результатов FRAP. В этом эксперименте мы отбеливателя позвоночника интерес в 10 раз при 100 передачи лазерного%. Это условие является достаточным, чтобы отбелить флуоресценции позвоночника к фоновому уровню в фиксированном подготовки. Таким образом, мы устанавливаем интенсивности флуоресценции на тот же номер в качестве фона на 0 секунд после фотообесцвечивания. В зависимости от скорости первого сканирования, значительное количество флуоресценции восстановления, возможно, уже обнаружена, когда белок является очень мобильны.

Многие флуоресцентных зондов белка были разработаны для изучения динамики белков с FRAP. Дополнительный подход является, например, использовать фотоактивируемых GFP (PA-GFP), или photoconvertible вариантов. Вместе с FRAP техники, эти инструменты становятся необходимыми для живой клетки диагностическая визуализация ^4-6.

Материалы

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
35 mm glass-bottom dishes		MatTek	P35GC-1.0-14-C
CalPhos Mammalian Transfection Kit		Clontech	631312
pEGFP-N1 plasmid		Clontech	6085-1
Zeiss confocal microscope		Zeiss	LSM 710
Zeiss TempModule system		Zeiss	N.A.
ImageJ software		NIH	N.A.
Graphpad Prism software		Graphpad software	N.A.