الثقافة السابقين فيفو من خلايا الإنسان الأولية قناة فالوب طلائي

Summary

قناة فالوب (FT) آخذة في الظهور كموقع بديل المنشأ لسرطان المبيض المصلي (SOC). هذا البروتوكول يصف طريقة جديدة لعزل و خارج الحي الثقافة من الخلايا الظهارية قناة فالوب. يلخص هذا النظام في الجسم الحي ظهارة ويسمح للدراسة المرضية SOC.

Abstract

طلائي سرطان المبيض هو السبب الرئيسي لوفيات السرطان في النساء في الولايات المتحدة. على النقيض من سرطانات النساء محددة أخرى ، مثل سرطان الثدي والرحم ، حيث انخفضت معدلات الوفيات في السنوات الأخيرة ، ظلت معدلات المبيض علاج السرطان دون تغيير نسبيا خلال العقدين الماضيين ^1. هذا يرجع إلى حد كبير إلى عدم وجود أدوات الفحص المناسبة للكشف عن المرض مرحلة مبكرة حيث الجراحة والعلاج الكيميائي هي الأكثر فعالية ^{2 ، 3.} ونتيجة لذلك ، ومعظم المرضى يعانون من مرض الحاضر مرحلة متقدمة والمشاركة في البطن منتشر. ويزيد من تعقيد هذه من حقيقة أن سرطان المبيض هو مرض غير متجانسة مع أنواع فرعية متعددة نسيجية ^{4 ، 5.} سرطان المبيض المصلي (SOC) هو الاكثر شيوعا النوع الفرعي والعدوانية والشكل في أغلب الأحيان ترتبط طفرات في جينات BRCA. النماذج التجريبية الحالية في هذا المجال تنطوي على استخدام خطوط الخلايا السرطانية ونماذج الماوس إلى فهم أفضل للبدء الأحداث الجينية والمرضية للمرض ^{6 ، 7.} مؤخرا ، ظهرت قناة فالوب كموقع رواية عن أصل شركة نفط الجنوب ، مع قناة فالوب (FT) الخلايا الطلائية الإفرازية (FTSEC) باعتبارها الخلية المقترحة من أصل ^{8 و 9.} لا يوجد حاليا أي خطوط الخلايا أو أنظمة الثقافة المتاحة للدراسة أو ظهارة FT FTSEC و. نحن هنا وصف فيفو السابقين رواية نظام الثقافة حيث يتم استزراع الخلايا الأولية FT الظهارية البشرية بطريقة تحافظ على فن العمارة ، قطبية ، نمط ظاهري مناعي ، وردا على الضغوطات الفيزيولوجية والسامة. هذا النموذج فيفو السابقين يوفر أداة مفيدة لدراسة SOC ، والسماح لفهم أفضل للكيفية التي يمكن أن تنشأ الأورام من هذا النسيج ، والآليات التي تشارك في بدء الورم والتقدم.

Protocol

1. إعداد الكولاجين وطلاء تصفية.

1. لإعداد الكولاجين المشيمة البشرية ، ينتف الريش من 30 ملغ من الكولاجين المشيمة البشرية ووضع على رأس 50 مل من الماء المقطر (DH ₂ O) في كوب 500 مل بقضيب.
2. إضافة 100 μls من حامض الخليك الجليدية مباشرة على الكولاجين لجعله أسهل حل. الحارة إلى 37 درجة مئوية ويحرك لها حل الكولاجين. يجب أن تذوب في 20-30 دقيقة. إذا فروع الكولاجين يبقى في الحل ، وسوف يكون من الصعب تصفية التعقيم.
3. تمييع الأسهم 50 ملم مع 450 مل من DH ₂ O مع وجود غشاء 0.2 ميكرون فلتر تعقيم. هذا هو الحل النهائي العاملة. المحل في 4 درجات مئوية.
4. تحضير أغشية Transwell تصفية حسب طلاء لهم الكولاجين (50-100 ميكرولتر) بين عشية وضحاها. يجب أن تكون درجة حرارة مبردة لRT الكولاجين وأضاف بعد ذلك إلى حجرة العلوية لتغطية الغشاء بين عشية وضحاها وعلى RT. قبل الطلاء وفصلها قناة فالوب الابتدائي (FT) ظهارة (أنظر أدناه) على المرشحات Transwell ، وغسل المرشحات ثلاث مرات في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) على الأقل 1 ساعة قبل استخدامها لإزالة الكولاجين الزائد.

2. كوكتيل النسيج والتفكك.

1. قناة فالوب جديدة ينبغي (FT) يتم جمعها في برنامج تلفزيوني الخمل 1X العقيمة في أنبوب الطرد المركزي 50 مل وأبقى على الجليد قبل موجه في تجهيز غطاء نسيج الثقافة العقيمة.
2. غسل عينة الأنسجة مرة في 20 مل 1X PBS المبردة (إذا كان قد تم جمع عينات من نوع آخر في وسائل الإعلام أو على الأقل غسل دموي 3X للتخلص من الكثير من الدماء وسائل الاعلام الاجنبية وممكن لأن ذلك قد تتداخل مع كفاءة الطلاء).
3. استخدام ملاقط معقمة FT نقل إلى صحن 10 سم مع زراعة الأنسجة وPBS قليلا ، وذلك باستخدام ملاقط معقمة ومشرط معقم ، وقطع طولي لتحقيق أقصى قدر من تعرض الخلايا الظهارية. فتح الخمل بحيث أنه لم يعد أنبوب لكن ورقة مسطحة تقريبا من الأنسجة. ثم قطع الى قطع صغيرة ولكن لا يزال استرجاعها (حوالي 3 مليمتر في القطر).
4. نقل القطع إلى 45 مل من وسائل الاعلام تفارق المبردة (MEM تحتوي على 1،4 ملغ / مل و 0.1 Pronase الدناز ملغ / مل) في أنبوب 50 مل.
5. صخرة بلطف عند 4 درجة مئوية لمدة 24 إلى 72 ساعة. (من التجربة ، هو الأمثل 48 ساعة). للتحقق من كمية التفكك ، وضعت قطرة من وسائل الاعلام تفارق على شريحة وتحقق قدر من التثاقل وقدرتها على البقاء الأنسجة (الضرب خلايا مهدبة). كنت تريد أن ترى كل من الخلايا واحدة ، وبعض كتل صغيرة.

3. أنبوب فالوب التصفيحات.

1. عندما تفارق من كمية الخلايا الظهارية هو الأمثل ، تعطيل وسائل الإعلام وذلك بإضافة 10 ٪ من حجم FBS. عكس عدة مرات لطرد تعليق الخلية إلى أصغر المجاميع.
2. كتل كبيرة تسمح الأنسجة (الأنسجة اللحمية) ليستقر في قاع الأنبوب. إزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا الظهارية في أنبوب 50 مل.
3. إضافة 50 مل من MEM الباردة (أي FBS) في أنبوب 50 مل الأصلي. عكس لجمع خلايا إضافية. جمع وسائل الاعلام في أنبوب 50 مل third (إذا كانت العينة كبيرة جدا ، ويتوقع عدد كبير من الخلايا ، ويمكن تكرار هذه الخطوة لتحقيق أقصى قدر من جمع خلية). ويمكن الآن لقطع كبيرة من الأنسجة اللحمية / خارج الخلية يتم تجاهل. لديك الآن اثنين من 50 مل من أنابيب التعليق الخلية. الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق وسائل الإعلام نضح تفارق من الكريات الخلية.
4. تحسنت إلى 37 درجة مئوية : Resuspend في حوالي 50-10 مل من وسائل الإعلام وكيل الأمين العام (F12 تستكمل مع وكيل الأمين العام 2 ٪ و 1 ٪ بكتيريا DMEM القلم) ماصة بلطف. يجب الحرص على عدم بقوة ماصة للغاية لأن هذا قد يؤدي إلى تلف الخلايا الطلائية ويقلل من جودة الثقافات. يجب أن يكون هناك خلايا واحدة وكتل صغيرة (الشكل 1).
5. نقل على الأطباق واحتضان الثقافة Primaria لمدة لا تقل عن 1 ساعة أو ساعة تصل إلى 3. والخلايا الليفية وخلايا الدم الحمراء التمسك البلاستيك ولكن الخلايا الظهارية FT لن. نلقي نظرة على لوحة بعد ساعة لمعرفة ما اذا كان كل شيء الشائكة. ويمكن ملاحظة وجود خلايا مهدبة بالإشارة إلى الضرب من الأهداب.
6. خلال هذه الحضانة ، يمكن غسلها مرشحات الكولاجين المغلفة وأدلى جاهزة للطلاء الخلية (انظر الخطوة 1.4)
7. بعد 1-3 ساعات من الحضانة على لوحات Primaria ، ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل وشطف لوحة Primaria مع 5 مل من وسائل الإعلام وكيل الأمين العام ، ونقل هذه الوسائط إلى أنبوب لجعل الحجم النهائي من 15 مل. الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
8. نضح بعناية وسائل الإعلام وتجنب عرقلة بيليه الخلية. استنادا الى حجم بيليه ، resuspend في كمية مناسبة من وسائل الإعلام وكيل الأمين العام. (وعادة ما بين 1-3 مل) اقل من الأفضل في البداية حتى تتمكن من إضعاف أخرى إذا كنت بحاجة إلى. Resuspend بلطف.
9. أضف 10 ميكرولتر من معلق الخلايا إلى عدادة الكريات وتحديد كثافة الخلية. النصائح : أنت تبحث عن الخلايا الظهارية التي تحتوي على غشاء الخلية الظلام واضح وغير قابلة للعمودي. يمكنك أيضا الاعتماد مهدبة الخلايا التي تتحرك بالتأكيد. أصغر الخلايا التي تحتوي على appearan هالةم هي خلايا الدم الحمراء ويجب أن لا تحسب. وسوف يكون هناك بعض التثاقل ، ولذا تحتاج إلى تقدير ذلك في عدد خلايا لك. الهدف هو زرع الخلايا 1،65 X10 ⁵ / الغشاء ، أو على الأقل 75 ٪ من التغطية تصفية (الشكل 1). إذا كانت مطلية خلايا قليلة جدا ، والخلايا لا تكون قادرة على تشكيل طبقة كاملة الظهارية.
10. إضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام وكيل الأمين العام لقاع البئر لوحة بئر 24 و إدراج Transwell. ويمكن بعد ذلك أن حجم المطلوب من تعليق خلية FT (انظر أعلاه) يضاف إلى كل غشاء ، وهذا هو عادة 100 ميكرولتر.
11. احتضان وتنمو لمدة 1-2 أيام بدون رأس مقلقة للغشاء. يمكنك تغيير وسائل الإعلام على الجانب القاعدية خلال تلك الأيام إذا لزم الأمر. بعد 1-2 أيام ، يمكنك شطف بدقة أعلى وكيل الأمين العام مع وسائل الاعلام وإضافة كمية صغيرة (50-100 ميكرولتر) من وسائل الإعلام على رأس الغشاء. فمن الأسهل لتحديد التقاء الثقافات الخلية إذا تمت إزالة وسائل الإعلام من الجانب قمية من المرشحات قبل المجهري. يجب أن تحتوي على أقل مقصورة دائما وسائل الإعلام. مرة واحدة وثقافات متموجة بالكامل (عادة في غضون 5 أيام) ، ينبغي ألا يكون مقدار من وسائل الإعلام أن يسافر ما يصل من خلال مرشحات من الجانبين القاعدية لقمية ضئيلة.
12. تغيير وسائل الإعلام القاعدية مرة واحدة كل يومين خلال الأيام ال 10 الأولى. يجب أن يكون دائما أقل المقصورة وسائل الاعلام للحفاظ على خلايا حية. بمجرد تشكيل الخلايا الظهارية طبقة ضيقة (الشكلان 1 و 2) ويمكن استخدامها في إجراء مزيد من الدراسات ، مثل المناعي (IF) أو المناعية (IHC).

4. تصنيع الغشاء.

1. تجهيز الغشاء يعتمد على نوع الدراسة التي سوف يتم تنفيذها ، ولكن عادة ما ينطوي على إزالة عامل التصفية من إدراج Transwell.
2. عادة يتم غسلها للمرشحات 3 مرات في 200 ميكرولتر من 1X PBS قبل إزالتها.
3. PBS نضح من الجانب قمي والقاعدية من المرشحات. وينبغي القيام بذلك بشكل جيد 1 في وقت واحد لمنع الأغشية من الجفاف.
4. إزالة ادخال من لوحة ، والوجه رأسا على عقب واستخدام مشرط معقم لخفض حول الغشاء. محاولة إزالة الغشاء في قطعة واحدة من خلال جعل التخفيضات على التوالي حول حافة الغشاء ، بدلا من سحب مشرط حول الحافة.
5. استخدام الملقط لإزالة تصفية من إدراج ، تتبع الجانب الذي يوجد في الخلايا. ويمكن بعد التصفية تتم معالجتها لأنه إذا ، IHC ، الخ ، حسب الاقتضاء.
6. على سبيل المثال : لأنه إذا الدراسات ، وينبغي وضع فلتر (بعد permeabilization ، التثبيت ، وعرقلة والحضانة مع الأجسام المضادة المناسبة ، وفقا لمعيار IF الإجراءات) على شريحة ، يتم إسقاط الخلايا التي تواجه UP ، Vectashield مع دابي على مرشح ومغطاة الزجاج ساترة.

5. ممثل النتائج :

ويمكن للمرشحات transwell إزالة بسهولة لفحص ظهارة فيفو السابقين من كلا المناعية (IHC) والمناعي (IF). باستخدام النسب علامات محددة ، يمكن للمرء أن صورة وتقدير إفرازي (PAX8 إيجابية) ومهدبة (Sall2 إيجابية) المقصورات الخلية في هذه الثقافات (الشكل 3). وعلاوة على ذلك ، باستخدام هذه العلامات ، كيف يمكن للمرء أن يرصد كل نوع من الخلايا تستجيب للمنبهات الفسيولوجية المختلفة ^10. وقد استخدم هذا النظام لوصف التغييرات في phosphoproteome secretome وداخل الخلايا الطلائية FT استجابة للمؤثرات المختلفة.

الشكل 1. التوضيح تصور كيف السابقين الثقافات الحية تتولد من المرحلة الابتدائية الأنسجة البشرية قناة فالوب. الحصول على أنبوب فالوب الأنسجة خملي من جناح الجراحة ومفروم لتوليد شظايا صغيرة ⁽¹⁾ التي يتم غسلها والمحتضنة مع وسائل الاعلام لتفارق 24-72 ساعة ^2. بعد اكتمال تفارق ، يسمح شظايا الأنسجة لتستقر في قاع الأنبوب حضانة ووسائل الإعلام التي تحتوي على الخلايا الظهارية نأت تحصد ^3. يمكن رصد كفاءة تفارق التي فحصها تحت المجهر ⁴ المرحلة التباين. ثم يتم استزراع الخلايا الظهارية نأت على لوحات Primaria للمساعدة على إزالة الخلايا الليفية والخلايا المكونة للدم التي دائما ممزوجة مع الخلايا الظهارية ^5. حالما تتم إزالة الخلايا بشكل كاف غير الظهارية ، والمصنف في الخلايا الظهارية على مرشحات transwell التي هي المغلفة مع الكولاجين المشيمة الإنسان ^5. وتقدم وسائل الإعلام من خلال نشر transwell من أسفل. والمحتضنة للثقافات 24-48 ساعة ومن ثم تتم إزالة وسائل الإعلام القمي. وسمح للثقافات فيفو السابقين لتنمو ل5-8 يوما لتشكيل كامل ، الحشيش كاملة على المرشحات transwell. يمكن الحفاظ على الثقافات الحية viably السابقين في هذه الولاية لمدة تصل إلى 4 أسابيع. ⁵ الرسوم المتحركة تظهر تمثيل الثقافة فيفو السابقين نمت بشكل كامل مع مثالا لتصفية إزالتها من إدراج وملطخة أمراض الدموxylin يوزين (H & E) ، للتدليل على الاستقطاب والهندسة المعمارية للظهارة فيفو السابقين.

الشكل 2. مشرق المجهري ميدان الثقافات FT فيفو السابقين. يدرج Transwell هي المغلفة مع الإنسان المشيمة المسام 0.4μm الكولاجين مرئية (أ). يتم استزراع الخلايا الظهارية FT على إدراج مادة الكولاجين المغلفة (ب) ، حيث أنها تشكل طبقة الظهارية (ج). ويلاحظ عادة بعض الحطام الانضمام إلى الخلايا الظهارية في الثقافة (المشار إليها السهام) ، في معظم الأحيان إلى خلايا مهدبة.

الشكل 3. FT الثقافة فيفو السابقين المناعي (IF). أمثلة إذا كانت الصور من الثقافات فيفو السابقين الثابتة وملطخة الأجسام المضادة ضد (أ) إفرازي (PAX8) و (د) علامات خلية مهدبة (Sall2). دابي يستخدم كعنصر تحكم لموقع نواة الخلية (الأزرق) (ب) و (ه) والضد يظهر المدمجة وكذلك تلوين دابي (ج و و). عدد الخلايا يعتمد على طول الفترة الزمنية كانت الخلايا في الثقافة (PAX8 تلوين ، 7 أيام ؛ Sall2 تلوين ، 3 أيام).

Discussion

التعرف على FT كموقع مرشح من أصل لشركة نفط الجنوب يتيح الفرصة لإجراء البحوث الأساسية وتهدف إلى فك رموز متعدية آليات ربط عوامل الخطر المعروفة والفعلي لعملية مسرطنة مصلي. هذه هي حاسمة لتطوير نظم نموذج الانقياد التي سوف تمكننا من بدء اختبار فرضية أن FTSEC خلية المنشأ للسرطان الحوض مصلي. ثقافة فيفو السابقين نموذج الموصوفة هنا هو نظام الرواية التي تسمح للعزلة وشارك الثقافة من إفرازي FT مهدبة الخلايا الأولية وبطريقة تحافظ على مورفولوجيا وبيولوجيا ظهارة FT الأصلي. باستخدام هذا النظام ، ونحن في الآونة الأخيرة تميزت secretome هذا ظهارة ، وكيف يستجيب لظهارة الميكانيكية وإصابة ¹⁰ سمية جينية. يتميز التبويض ، وهو عامل خطر رئيسي المرتبطة تكون الأورام المبيض ، من خلال مزيج من إصابات الأنسجة وسطاء التهابات ، وعوامل النمو والهرمونات ^11. ويمكن استخدام هذا النظام لدراسة تأثير وجود الوسط التبييض على الاستجابة وقابلية إفرازية وخلايا مهدبة. بالإضافة ، يمكن دراسة تأثير أنواع الخلايا الأخرى (أي التهابات الخلايا) للسماح لفهم أفضل للأحداث التي تدفع الخلايا من نوع المفاضلة والعوامل التي تساهم في تحويل هذه الخلايا الورمية. وقد وصفت نماذج مماثلة في الأنسجة الأخرى حيث ظهارة الاستقطاب موجودا. على سبيل المثال ، في الثقافات الاستقطاب الأساسي للظهارة المسالك الهوائية ، تم تقييم تأثير heregulin على نمو الخلية واستجابة لإصابة ¹² الخلوية. هذه الأنواع من الأنظمة نموذج توفير وسيلة جديدة ومفيدة لدراسة المبادرة والمرضية للأورام التي تنشأ من الأنسجة الطلائية ، وهذا أمر له أهمية حاسمة في الأنسجة مثل FT التي لا يوجد فيها خطوط الخلايا الموجودة حاليا ، وحيث هناك كبير ضرورة تحديد المسارات الرئيسية ووضع استراتيجيات العلاج الرواية.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)		Sigma	C7521
DMEM:F12 media		Cellgro	15-090-CV
Ultroser G		Crescent Chemical Company	67042	Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)
Pen Strep		Invitrogen	15140-122
BD Primaria culture plates		BD Bioscience	353802
24 well Transwell Permeable supports		Corning (Costar)	3470	Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester
MEM (Minimal Essential Media)		Cellgro	10-010-CV
Pronase		Roche	11459643001
DNAse		Sigma	DN25
Sall2 antibody		Dr T. Benjamin, Harvard	Gift	1:20 dilution
Pax8 antibody		Proteintech	10336-1-AP	1: 1000 dilution