기본 인간 난관 상피 세포의 전의 VIVO 문화

요약

나팔관 (FT)는 묽은 난소 암종 (SOC)에 대한 원산지의 대체 사이트로 대두되고 있습니다. 이 프로토콜은 격리에 대한 새로운 방법을 설명하고 예 생체내 문화. 이 시스템 recapitulates 생체내에 상피 및 SOC의 pathogenesis의 연구를 수 있습니다.

초록

상피 난소암은 미국 여성의 암 사망률의 주요 원인이다. 다른 여성의 특정 암 대조적으로, 유방 및 사망 요금은 최근에 빠졌어요 자궁 carcinomas, 같은 난소 암 치료의 요금은 지난 20 년 동안 상대적으로 변하지 ^하나 남아있다. 이것은 수술과 화학 요법은 ^{3, 2} 가장 효과적인 초기 단계의 질병의 검출에 적합한 검사 도구의 부족으로 크게 때문입니다. 결과적으로, 대부분의 환자는 말기 질환과 확산 복부 참여와 함께 현재. 이것은 더욱 난소암 여러 histologic subtypes ^{4, 5와} 이기종 질환이라는 사실에 의해 복잡합니다. 장액의 난소 암종 (SOC)는 가장 일반적이고 적극적인 subtype 가장 자주 BRCA 유전자 돌연변이의와 관련된 양식입니다. 이 분야에서 현재 실험 모델은 더 시작 유전 사건과 질병 ^{6, 7} pathogenesis을 이해하는 암 세포 라인과 마우스 모델의 사용을 포함하고 있습니다. 최근 나팔관 기원 ^{8, 9의} 제안 세포로 난관 (FT) 분비 상피 세포 (FTSEC)와 SOC의 기원에 대한 새로운 사이트로 떠오르고있다. 더 셀 라인 FT의 상피 또는 FTSEC을 연구에 사용할 문화 시스템이 현재 없습니다. 여기 우리는 인간의 기본 FT 상피 세포가 자신의 건축, 극성, immunophenotype, 그리고 physiologic 및 genotoxic 스트레스에 대응을 보존하는 방식으로 양식하는 소설 전의 생체내 문화 시스템을 설명합니다. 이 전 생체내 모델은 종양이 조직에서 발생할 수 방법에 대한 이해를 수 있도록 SOC 연구를위한 유용한 도구를 제공하고, 메커니즘은 종양 개시 및 진행에 관여.

프로토콜

1. 콜라겐 준비 및 필터 코팅.

1. 인간 placental 콜라겐을 준비하기 위해, 인간 placental 콜라겐 30 MG를 핀셋 및 저어 막대로 500 ML의 비커에 증류수 50 ML 맨 (DH ₂ O)에 넣어.
2. 쉽게 용해 수 있도록 직접 콜라겐에 빙초산 100 μls를 추가합니다. 37 따뜻한 ° C와 콜라겐을 분해 그것을 저어. 그것은 20-30분에 용해한다. 콜라겐 가닥이 용액에 남아있는 경우, 필터 살균이 어려운 것입니다.
3. DH ₂ O와 0.2 μm의 막과 필터 - 소독의 450 ML과 50 ML 주식을 희석. 이것은 최종 작업 솔루션입니다. 4 스토어 ° C.
4. 코팅 그들 콜라겐 (50-100 μl) 숙박과 함께하여 트랜 스웰 필터 세포막을 준비합니다. 냉장 콜라겐은 RT로 예열 후 야간 및 RT에서 막을 충당하기 위해 상단 구획에 추가합니다. 트랜 스웰 필터에 dissociated 기본 나팔관 (FT) 상피 (아래 참조)을 도금하기 전에, 1X 인산 세 시간이 초과 콜라겐을 제거하기 위해 사용하기 전에 생리 (PBS) 적어도 1 시간 버퍼 필터를 세척.

2. 조직 수집과 해리.

1. 신선한 난관이 (FT) fimbria는 50 ML의 원심 관에 멸균 1X PBS의 수집 및 살균 조직 문화 후드의 처리를 프롬프트하기 전에 얼음에 보관해야합니다.
2. (샘플은 매체의 다른 유형의 수집 또는이 도금의 효율성에 영향을 수도 있습니다 가능한 한 많은 혈액과 외국 매체로 없애 적어도 3 배 피묻은 헛된되어있는 경우)되면 20 ML 차게 1X PBS에서 조직 샘플을 씻으십시오.
3. 살균과 멸균 핀셋 메스를 사용하여 약간의 PBS와 함께 10cm의 조직 문화 요리에 멸균 핀셋 전송 FT를 사용하여 상피 세포의 노출을 최대화하기 위해 길이 방향 절단. 그것이 더 이상 관하지만 조직의 거의 평면 시트하지 않도록 fimbria을 엽니다. 그런 다음 작은하지만 여전히 복구할 조각 (직경 3mm 정도)로 잘라.
4. 50 ML 튜브에 냉장 분리 미디어 45 ML (멤은 1.4 MG / ML Pronase 및 0.1 MG / ML DNAse을 포함)에 조각을 전송합니다.
5. 4 24~72시간에 대한 ° C에서 부드럽게 록. (경험 48 시간 최적입니다.) 슬라이드에서 분리 미디어 방울 넣어 분리의 양을 확인하고 clumping와 조직 생존 (속눈썹이있는 세포를 치고)의 금액을 확인하려면 다음과 같이하십시오. 당신은 하나의 세포 및 일부 작은 대단히 짧은 시간을 모두보고 싶어요.

3. 나팔관 도금.

1. 상피 세포 분리의 양을 최적 때, FBS 10 % 볼륨을 추가하여 미디어를 inactivate. 작은 집합체에 세포 현탁액을 이동시키다 수있는 몇 번 반전.
2. 큰 조직 대단히 짧은 시간 (stromal 조직)가 하단에있는 튜브를 해결하실 수 있습니다. 두 번째 50 ML 관으로 상피 세포를 포함하는 미디어를 제거합니다.
3. 원래 50 ML 튜브에 추위 멤 50 ML (NO FBS)을 추가합니다. 추가 세포를 수집하는 반전. 삼분의 일 50 ML 튜브 (샘플 매우 큰이며 세포의 높은 숫자가 예상하는 경우,이 단계는 세포 수집을 최대화하기 위해 반복 수)에 미디어를 수집합니다. stromal / 세포외 조직의 큰 조각은 이제 폐기 수 있습니다. 이제 세포 현탁액의 두 50 ML 튜브 있습니다. 셀 알약에서 5 분 대기음 분리 미디어 1,000 rpm으로 원심 분리기.
4. USG 미디어 (DMEM : F12 2% USG, 1 % 펜 Strep과 보충)의 약 50-10 ML의 Resuspend 37 ° C.에 예열 부드럽게 피펫. 이 상피 세포를 손상과 문화의 품질을 줄일 수 있으므로 너무 적극적으로 피펫하지 않도록주의하십시오. 단일 세포와 작은 대단히 짧은 시간 (그림 1)이 있어야합니다.
5. 일시간 또는 최대 3 시간 최소 Primaria 문화 요리와 부화에 전송합니다. 섬유아 세포와 적혈구는 플라스틱에 집중되지만 FT 상피 세포가되지 않습니다. 게 튀어나와 있는지 한 시간 후 접시를 한 번 봐. 속눈썹이있는 세포의 존재는 속눈썹의 심장을 지적하여 볼 수 있습니다.
6. 이 부화하는 동안, 콜라겐 코팅 필터 (단계 1.4 참조) 세탁 및 세포 도금 준비 할 수 있습니다
7. Primaria 접시에 부화 1~3시간 후, 15 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송 5 ML USG 미디어 Primaria 접시를 씻어 15 ML의 최종 볼륨을 만들기 위해 관이 미디어를 전송합니다. 5 분 1,000 rpm으로 원심 분리기.
8. 조심스럽게 미디어를 기음과 세포 펠렛을 방해하지 마십시오. 펠렛의 크기에 의해 판단, USG 매체의 적절한 금액 resuspend. 당신이 필요한 경우 추가로 희석 수 있도록 (보통 1-3 ML 사이) 이하는 처음에 좋습니다. 부드럽게 Resuspend.
9. hemacytometer에 resuspended 세포의 10 μl를 추가하고 셀 밀도를 결정합니다. 팁 : 당신은 분명히 어두운 세포막을 가지고 있으며 이외의 원주 상피 세포 아르를 찾고 있습니다. 당신은 또한 확실히 이사 솜털이있는 세포를 셀 수 있습니다. 후광 appearan을 작은 세포CE는 적혈구이며 계산되지 않습니다. 몇몇 clumping, 그럼 당신은 당신이 셀 개수로 계산해야합니다. 시딩 대상은 1.65 X10 ⁵ 셀 / 멤브레인, 또는 75 % 이상 필터 범위 (그림 1)입니다. 세포가 너무 띄엄띄엄 도금하는 경우, 전지는 완전한 상피 층을 형성 수 없습니다.
10. 24 잘 접시 잘 하단에 USG 미디어 500 μl를 추가하고 트랜 스웰를 삽입합니다. FT의 세포 현탁액 (위 참조)의 요구 볼륨이 다음 각 막에 추가할 수 있습니다, 이것은 일반적으로 100 μl입니다.
11. 부화와 막의 방해없이 최고 1-2일에 대한 성장. 필요한 경우 그 기간 동안 기저 측면에있는 미디어를 변경할 수 있습니다. 1-2일 후, 당신은 신중하게 USG 미디어와 함께 정상을 씻어 막 위에 미디어를 소량 (50-100 μl)을 추가할 수 있습니다. 그것은 미디어가 현미경 전에 필터의 혀끝의 측면에서 제거하면 셀 문화의 합류를 결정하는 것이 더 쉽습니다. 낮은 칸막이는 항상 미디어를 포함해야합니다. 일단 문화가 (일반적으로 5 일 이내) 완전히 합류 있으며, 꼭대기의 양쪽으로 기초에서 필터를 통해 여행 미디어의 금액은 크지 않을 수 있습니다.
12. 처음 10 일 동안 매일 한 이틀 기저 미디어를 변경합니다. 낮은 칸막이는 항상 세포를 살리기 위해 미디어를해야합니다. 일단 세포들은 같은 immunofluorescence (IF) 또는 immunohistochemistry (IHC)와 같은 추가 연구에 사용할 수있는 꽉 상피 레이어를 (그림 1 및 2) 결성했습니다.

4. 막 처리.

1. 멤브레인 처리 수행 될 연구의 유형에 의존하지만, 일반적으로 트랜 스웰 삽입에서 필터 제거를 포함한다.
2. 필터는 일반적으로 제거하기 전에 1X PBS 200 μl에 3 번 씻어 있습니다.
3. 필터의 혀끝의와 기초 측면에서 PBS를 대기음. 이것은 밖으로 건조에서 세포막을 방지하기 위해 한 번에 잘 한 일을해야합니다.
4. , 접시에서 삽입을 제거 그것을 거꾸로 뒤집어 및 멤브레인 주변 잘라 살균 메스를 사용합니다. 대신 가장자리 주변의 메스를 드래그의 멤브레인 가장자리 주위에 바로 상처를함으로써 한 조각의 멤브레인를 제거하려고합니다.
5. 트랙 세포가있는 측면의 유지, 삽입에서 필터를 제거하는 핀셋를 사용합니다. 필터는 다음 적절한 경우, IHC 등 처리할 수 있습니다.
6. 예 :이 연구는, 필터가 (적절한 항체로 고정, permeabilization, 차단 및 부화 후, 절차 IF 기준에 따라) 슬라이드에 배치해야한다면, DAPI와 Vectashield을 UP 직면 세포가 필터에 떨어뜨린이며 덮여 유리 coverslip.

5. 대표 결과 :

트랜 스웰 필터는 쉽게 immunohistochemistry (IHC)와 immunofluorescence (IF) 모두에 의해 전 생체내의 상피를 검사 제거할 수 있습니다. 특정 마커 혈통을 사용, 하나는 이미지를 수 있고 분비 (Pax8 긍정적)와 솜털이있는이 이러한 문화에 (Sall2 긍정적인) 세포 구획 (그림 3) 계량. 또한, 이러한 마커를 사용, 하나는 각 세포 유형이 다른 physiologic 신호 ¹⁰ 대응 방법을 모니터할 수 있습니다. 이 시스템은 다양한 자극에 대한 응답으로 FT의 상피의 secretome과 세포내 phosphoproteome의 변화를 특징 짓는 데 사용되었습니다.

그림 1. 그림은 인간의 기본 나팔관 조직에서 생성된하는 방법 예 생체내 문화 묘사. 나팔관 fimbrial 조직이 수술 스위트에서 얻은 및 24~72시간 ² 분리 미디어 세탁 및 incubated 아르 작은 조각 ^하나를 생성하기 위해 다진입니다. 분리가 완료되면 조직 조각은 ³ 수확하는 부화 관의 바닥과 dissociated 상피 세포를 포함하는 미디어에 정착하기 위해 사용할 수 있습니다. 분리의 효율은 위상 대비 현미경 ^4에 따라 시험으로 모니터링할 수 있습니다. dissociated 상피 세포는 다음 fibroblast하고 결국에 상피 세포 ⁵ admixed 조혈 세포를 제거하는 데 도움 Primaria 접시에 양식 있습니다. 비 상피 세포가 적절하게 제거되면, 상피 세포는 인간 placental 콜라겐 ⁵ 입혀져 있습니다 트랜 스웰 필터에 씨앗을 품고있다. 미디어는 아래에서 트랜 스웰 통해 확산에 의해 제공됩니다. 문화가 24-48시간에 대한 incubated하고 다음 혀끝의 미디어가 제거됩니다. 전 생체내 문화는 다음 트랜 스웰 필터에 완전한, 완벽한 잔디를 형성 5~8일위한 성장을 사용할 수 있습니다. 최대 4 주 동안 전 생체내 문화가이 상태에 viably 유지하실 수 있습니다. 만화 ⁵ hemato로 삽입하고 스테인드에서 제거 필터의 예제와 함께 완벽하게 성장 전 생체내 문화의 표현을 보여줍니다xylin 및 eosin (H & E)은 전 생체내의 상피의 극성과 건축을 설명합니다.

그림 2. FT 전 생체내 문화의 명시야 현미경. 트랜 스웰 삽입이 인간 placental 콜라겐 0.4μm의 모공과 코팅 아르는 (a) 볼 수 있습니다. FT 상피 세포들은 상피 층 (C)을 형성 콜라겐 코팅 삽입 (B)에 양식 있습니다. 일부 파편은 일반적으로 솜털이있는 세포에 가장 자주 (화살표로 표시) 상피 문화에 세포 관찰 준수합니다.

그림 3. FT 전 생체내 문화 immunofluorescence (IF).의 예는 예 생체내 문화의 이미지는 고정 및 항체 물들일 (A) 분비 (Pax8) 반대하고 (D) 솜털이있는 세포 (Sall2)는 마커 IF. DAPI는 세포 핵의 위치 (파란색) (B 및 전자)와 합병 항체 및 DAPI의 얼룩도 (C와 F) 표시됩니다위한 컨트롤로 사용됩니다. 세포의 숫자는 세포 (; Sall2 얼룩, 삼일 Pax8 얼룩, 7 일) 문화에 시간의 길이에 따라 다릅니다.

토론

SOC에 대한 원산지 후보 사이트로 FT의 식별은 알려진 위험 요인과 실제 장액의 발암성 프로세스를 연결하는 메커니즘을 파악하기위한 기본 및 translational 연구 기회를 제공합니다. 이것에 대한 중요한 우리 FTSEC가 골반 묽은 carcinomas에 대한 세포 수준의 기원이라는 가설을 테스트 시작있게 다루기 쉬운 모델 시스템의 개발이다. 여기 설명되어있는 전직 생체내 문화 모델은 기본 FT의 상피의 형태와 생물을 보존하는 방식으로 기본 FT의 분비와 솜털이있는 세포의 분리 및 공동 문화를 허용하는 새로운 시스템입니다. 이 시스템을 사용하여, 우리는 최근이 상피의 secretome를 묘사 방법과 상피는 기계와 genotoxic 부상 ¹⁰ 응답합니다. 배란, 난소 tumorigenesis와 관련된 주요 위험 요인은 조직 손상, 염증 중재자, 성장 요인 및 호르몬 ¹¹ 조합이 특징입니다. 이 시스템은 분비와 솜털이있는 세포의 반응과 생존에 ovulatory 환경의 효과를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 다른 세포 유형 (즉, 염증 세포)의 영향은 사건의 이해를하도록 검사 수 있다고 드라이브 셀 타입의 분화 및 이러한 세포의 종양 변화에 기여하는 요인. 비슷한 모델은 편광 상피가 존재하는 위치를 다른 조직에 설명되어있다. 예를 들어,기도 상피의 편광 차 문화에서 세포 성장과 세포 손상에 대한 응답에 heregulin의 효과는 ¹² 평가했다. 모델 시스템의 이러한 유형은 상피 조직에서 발생하는 종양의 개시 및 pathogenesis을 연구하는 새로운 및 유용한 방법을 제공하고,이 같은 어떤 세포 라인은 현재 존재하지 FT 같은 조직에서 매우 중요하고, 큰 어디에있다 키 경로의 식별 및 새로운 치료 전략의 개발을 위해 필요합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)	Sigma-Aldrich	C7521
DMEM:F12 media	Cellgro	15-090-CV
Ultroser G	Crescent Chemical Company	67042	Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)
Pen Strep	Invitrogen	15140-122
BD Primaria culture plates	BD Biosciences	353802
24 well Transwell Permeable supports	Corning	3470	Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester
MEM (Minimal Essential Media)	Cellgro	10-010-CV
Pronase	Roche Group	11459643001
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
Sall2 antibody	Harvard - T. Benjamin Lab	Gift	1:20 dilution
Pax8 antibody	Proteintech	10336-1-AP	1: 1000 dilution