Экс Vivo культуры первичных человеческих маточных труб эпителиальных клеток

Резюме

Фаллопиевых труб (FT) появляется в качестве альтернативного места происхождения для серозного рака яичников (SOC). Этот протокол описывает новый метод для изоляции и Исключая виво Культура маточной трубе эпителиальных клеток. Эта система повторяет В естественных условиях Эпителия и позволяет изучение патогенеза SOC.

Аннотация

Эпителиального рака яичников является одной из главных причин женской смертности от рака в Соединенных Штатах. В отличие от других женщин-специфические виды рака, как и рака молочной железы и матки рак, где показатели смертности снизились в последние годы, яичников ставки лечения рака остаются относительно неизменными в течение последних двух десятилетий ^1. Во многом это связано с отсутствием соответствующих инструментов скрининга для выявления ранних стадия заболевания, когда хирургическое вмешательство и химиотерапия являются наиболее эффективными ^{2, 3.} В результате, большинство пациентов имеет продвинутые стадии заболевания и диффузного брюшной участия. Это осложняется еще и тем, что рак яичников является гетерогенным заболеванием с несколькими гистологических подтипов ^{4, 5.} Серозный рак яичников (ШОС) является наиболее распространенным и агрессивный подтип и вид чаще всего связан с мутациями в генах BRCA. Современные экспериментальные модели в этой области связаны с использованием клеточных линий рака и мышах, чтобы лучше понять генетические события начала и патогенеза заболевания ^{6, 7.} В последнее время маточной трубе появился как роман сайт для возникновения ШОС, с маточной трубе (FT) секреторная эпителиальные клетки (FTSEC) в качестве предлагаемой ячейки ^{8 происхождения, 9.} Есть в настоящее время нет клеточных линий или культура систем, доступных для изучения эпителия FT или FTSEC. Здесь мы опишем естественных роман бывшего культуры система, где первичные человеческие FT эпителиальные клетки культивируют в манере, которая сохраняет свою архитектуру, полярность, иммунофенотип, и ответ на физиологические и генотоксического стресса. Это бывшие модели естественных условиях представляет собой полезный инструмент для изучения ШОС, что позволит лучше понять, как опухоли могут возникнуть из этой ткани, а также механизмы, участвующие в опухоли инициации и прогрессии.

протокол

1. Подготовка Коллаген и фильтра покрытие.

1. Для подготовки человеческий плацентарный коллаген, выщипывать из 30 мг человеческого плацентарного коллагена и положить сверху 50 мл дистиллированной воды (дН ₂ O) в 500 мл стакан с мешалкой.
2. Добавить 100 μls ледяной уксусной кислоты непосредственно на коллаген, чтобы сделать его легче раствориться. Нагреть до 37 ° С и размешать, чтобы растворить коллагена. Он должен раствориться в 20-30 минут. Если коллагеновые нити остаются в растворе, стерилизация фильтра будет сложно.
3. Развести 50 мл акции с 450 мл дН ₂ O и фильтр-стерилизуют при 0,2 мкм мембрану. Это последний рабочий раствор. Хранить при температуре 4 ° С.
4. Подготовка Transwell фильтр мембраны путем покрытия их с коллагеном (50-100 мкл) в течение ночи. Охлажденные коллагена должны быть прогреты до комнатной температуры и затем добавляется в верхнее отделение для покрытия мембраны в ночное время и при комнатной температуре. Перед покрытием диссоциированных первичной маточной трубе (FT) эпителия (см. ниже) на фильтры Transwell, мыть фильтры три раза в 1X фосфатным буферным раствором (PBS), не менее 1 часа перед употреблением, чтобы удалить излишки коллагена.

2. Коллекция тканей и диссоциации.

1. Свежий маточной трубе (FT) бахромкой должны быть собраны в стерильных 1X PBS в 50 мл центрифужную пробирку и держится на льду до оперативное оформление в стерильных капот культуры ткани.
2. Промыть образец ткани раз в 20 мл охлажденного 1X PBS (если образец был собран в другой тип носителя или кровавый мыться по крайней мере 3 раза, чтобы избавиться от так много крови и зарубежных СМИ, а возможно, поскольку это может помешать эффективности покрытия).
3. Использование стерильного пинцета передачу FT в 10 см культуре ткани блюдо с небольшим PBS и, используя стерильный скальпель и стерильным пинцетом, разрезанные продольно, чтобы максимизировать воздействие на эпителиальные клетки. Откройте бахромкой так, чтобы она больше не трубу, но почти плоский лист ткани. Затем вырежьте на более мелкие, но все еще извлекаемых штук (около 3 мм в диаметре).
4. Передача части до 45 мл охлажденной диссоциации СМИ (MEM содержащих 1,4 мг / мл проназы и 0,1 мг / мл ДНКазы) в 50 мл трубки.
5. Рок мягко при 4 ° С в течение 24 до 72 часов. (Из опыта, 48 часов, оптимально). Чтобы проверить количество диссоциации, капнуть каплю диссоциации средств массовой информации на слайде и проверить количество слипания и жизнеспособности тканей (избиение ресничных клеток). Вы хотите увидеть как отдельные элементы и небольшие сгустки.

3. Покрытие маточных труб.

1. Когда количество эпителиальных диссоциации клетка является оптимальным, инактивируют СМИ, добавляя 10% объема FBS. Обратить несколько раз, чтобы выбить суспензии клеток на более мелкие агрегаты.
2. Разрешить большого скопления ткани (стромальные ткани) поселиться в нижней трубы. Удалить средах, содержащих эпителиальных клеток в секунду 50 мл трубки.
3. Добавьте 50 мл холодной MEM (без ФБС) к первоначальному 50 мл трубки. Обратить для сбора дополнительных ячеек. Сбор средств массовой информации в третью 50 мл трубки (если образец очень большой и большое количество клеток, как ожидается, этот шаг может быть повторен, чтобы максимизировать ячейку коллекции). Большие куски стромальные / внеклеточной ткани теперь могут быть отброшены. Теперь у вас есть два 50 мл пробирки клеточной суспензии. Центрифуга при 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут и аспирации диссоциации средств массовой информации из ячейки гранул.
4. Ресуспендируют примерно в 5-10 мл USG СМИ (DMEM: F12 с добавлением 2% USG и 1% Pen Strep) нагревают до 37 ° C. Внесите мягко. Будьте осторожны, чтобы не пипетки слишком энергично, поскольку это может привести к повреждению эпителиальных клеток и снижают качество культур. Там должно быть отдельных клеток и небольших скоплений (рис. 1).
5. Передача на Primaria культуры блюд и инкубировать в течение минимум 1 часа или до 3 часов. Фибробласты и красных кровяных телец будет придерживаться пластика, но FT эпителиальных клеток, не будет. Взгляните на пластине после часа, чтобы увидеть, если что-нибудь торчит. Наличие ресничных клеток можно убедиться, заметив, биения ресничек.
6. Во время этой инкубации, коллаген покрытием фильтры можно мыть и приготовили для сотовых покрытия (См. шаг 1.4)
7. Через 1-3 часов инкубации на Primaria пластин, передачи клеточной суспензии в 15 мл трубки и промыть Primaria пластины с 5 мл USG средств массовой информации, передачи этой информации к трубке, чтобы сделать окончательный объем 15 мл. Центрифуга при 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут.
8. Тщательно аспирата средств массовой информации и во избежание нарушения осадок клеток. Судя по размеру гранулы, ресуспендируют в соответствующее количество USG СМИ. (Обычно в пределах 1-3 мл) меньше, да лучше в начале, так что можно разбавить еще больше, если вам это нужно. Ресуспендируют мягко.
9. Добавьте 10 мкл ресуспендировали клетки hemacytometer и определить плотность клеток. Советы: Вы ищете эпителиальные клетки, которые отчетливо темно клеточную мембрану и не являются столбчатые. Вы можете также рассчитывать ресничных клеток, что, безусловно, движется. Меньшие клетки, которые гало appearanсе красные кровяные тельца и не должны учитываться. Там будут какие-то стук, поэтому необходимо оценить, что в вас клеток. Посев цель 1,65 х10 ^{5 клеток} / мембрана, или, по крайней мере, 75% покрытие фильтра (рис. 1). Если клетки высевают слишком редко, клетки не смогут сформировать полный эпителиального слоя.
10. Добавить 500 мкл USG СМИ, чтобы дно колодца из 24-луночного планшета и вставьте Transwell. Необходимый объем FT клеточной суспензии (см. выше) могут быть добавлены на каждый мембраны, как правило, это 100 мкл.
11. Инкубируйте и расти в течение 1-2 дней, не нарушая верхней части мембраны. Вы можете изменить средств массовой информации на базальной стороне в те дни, если это необходимо. Через 1-2 дней, можно тщательно промыть сверху USG СМИ и добавляют небольшое количество (50-100 мкл) сверху на мембрану. Легче определить слиянии клеточных культурах, если средства массовой информации будет удален из апикальной стороне фильтры до микроскопии. Нижнее отделение всегда должно содержать СМИ. После культур полностью вырожденная (обычно в пределах 5 дней), количество средств массовой информации, которая путешествует сквозь фильтры от базального до апикального сторон должно быть незначительным.
12. Изменение базальной СМИ раз в два дня в течение первых 10 дней. Нижнее отделение всегда должно быть СМИ, чтобы сохранить клетки живыми. Как только клетки образовали плотный эпителиальный слой (рис. 1 и 2) они могут быть использованы в дальнейших исследованиях, таких как иммунофлюоресценции (ИФ) или иммуногистохимии (IHC).

4. Мембранные обработки.

1. Мембранные обработки зависит от типа исследования, которые будут выполняться, но обычно включает в себя удаление фильтра с вставками Transwell.
2. Фильтры, как правило, промывали 3 раза в 200 мкл 1X PBS перед удалением.
3. Аспирируйте PBS от апикальной и базальной стороне фильтров. Это должно быть сделано 1 и на время, чтобы предотвратить мембран от высыхания.
4. Удалите вставку из пластины, переверните ее вверх дном и использовать стерильный скальпель, чтобы обвести мембраны. Попробуйте удалить мембраны из одного куска, делая прямые пропилы по всему краю мембраны вместо перетаскивания скальпелем по краю.
5. Используйте пинцет, чтобы удалить фильтр из вставки, отслеживать, какая сторона клетки далее. Фильтр может быть обработан для И.Ф., IHC и т.д. по мере необходимости.
6. Пример: для ЕСЛИ исследований, фильтра (после фиксации, пермеабилизации, блокирование и инкубации с соответствующими антителами, в соответствии со стандартными процедурами IF) должен быть сделан на слайд, клетки вверх, Vectashield с DAPI отбрасывается на фильтр и покрыты покровное стекло.

5. Представитель Результаты:

Transwell фильтры могут быть легко удалены, чтобы исследовать бывший эпителия естественных условиях как иммуногистохимии (IHC) и иммунофлюоресценции (ИФ). Использование линии специфических маркеров, можно изображений и количественной оценки секреторной (Pax8 положительный) и ресничного (Sall2 положительный) клетка отсеков в этих культурах (рис. 3). Кроме того, используя эти маркеры, можно отслеживать, как каждый тип клеток реагирует на различные физиологические сигналы ^10. Эта система была использована для характеристики изменений в secretome и внутриклеточных phosphoproteome эпителия FT в ответ на различные стимулы.

Рисунок 1. Иллюстрация изображением, как бывший естественных культур создаются из первичных человеческих тканей маточных труб. Маточную трубу фимбриальные ткань получается из хирургической люкс и фарш для создания небольших фрагментов ^1, промывают и инкубируют с диссоциацией СМИ за 24-72 часов ^2. После диссоциации завершения фрагментов тканей имеют право поселиться на дно инкубации трубки и сред, содержащих диссоциированные эпителиальные клетки собирают ^3. Эффективность диссоциации можно контролировать с помощью исследования под фазово-контрастным микроскопом ^4. Диссоциированных эпителиальные клетки затем культивировали на Primaria пластин, чтобы помочь устранить фибробластов и гемопоэтические клетки, которые всегда смешаны с эпителиальных клеток ^5. После не-эпителиальных клеток адекватно удалены, эпителиальные клетки высевают на фильтры transwell, которые покрыты человеческий плацентарный коллаген ^5. Средств массовой информации обеспечивается путем диффузии через transwell снизу. Культуры инкубируют в течение 24-48 часов, а затем апикальной СМИ удаляется. Бывший культур естественных затем позволено расти в течение 5-8 дней, чтобы сформировать полный, полный газон на фильтрах transwell. Бывший культур естественных условиях может сохраняться жизнеспособным в этом состоянии на срок до 4 недель. Мультфильм ⁵ показано представление взрослого бывших культуры естественных условиях на примере фильтр удаляется из вставки и окрашивали гематоxylin и эозином (H & E), чтобы продемонстрировать полярность и архитектуры бывшего эпителия естественных условиях.

Рисунок 2. Яркие области микроскопии FT бывший культур естественных условиях. Transwell вставки покрыты плаценты человека поры 0.4μm коллагена видны (а). FT эпителиальные клетки культивируют на коллаген покрытием вставки (б), где они образуют эпителиальный слой (с). Некоторые мусора, как правило, наблюдается придерживаясь клеток в эпителиальные культуры (указаны стрелками), чаще всего в ресничных клеток.

Рисунок 3. FT исключая виво культуры иммунофлюоресценции (ИФ). Примеры ЕСЛИ образы бывших культур естественных фиксировали и окрашивали антителами против () секреторной (Pax8) и (г) ресничной клетки (Sall2) маркеров. DAPI используется в качестве контроля для размещения клеточных ядер (синий) (б, д) и объединены антител и DAPI окрашивания Показано также, (в, е). Число клеток зависит от времени клетки в культуре (Pax8 окрашивания, 7 дней; Sall2 окрашивание, 3 дня).

Обсуждение

Идентификация FT в качестве кандидата сайта происхождения SOC предоставляет возможность для основной и трансляционные исследования, направленные на расшифровку механизмы, связывающие известные факторы риска и фактических серозного канцерогенный процесс. Критические для этого является развитие послушный модельные системы, которая позволит нам приступить к тестированию гипотезы, что FTSEC является клетка-оф-происхождения тазовых серозных опухолях. Бывшие модели культуры естественных условиях, описанных здесь является новая система, которая позволяет изоляции и со-культуре первичных секреторной FT и ресничные клетки таким образом, что сохраняет морфологию и биологию родной эпителия FT. Используя эту систему, мы в последнее время характеризуется secretome этого эпителия и как эпителий реагирует на механические и генотоксического травмы ^10. Овуляция, одним из основных факторов риска, связанных с яичников опухолей, характеризуется сочетанием повреждения тканей, воспалительные медиаторы, факторы роста, гормоны и ^11. Эта система может быть использована для изучения влияния среды на овуляторных реагирования и жизнеспособность секреторную и ресничных клеток. Кроме того, влияние других типов клеток (т.е. клеток воспаления) могут быть изучены, чтобы лучше понять события, диск камерного типа дифференциации и факторов, которые способствуют опухолевой трансформации этих клеток. Подобные модели были описаны в других тканях, где поляризованных эпителия присутствует. Например, в поляризованном первичных культур дыхательных путей эпителия, эффект heregulin на рост клеток и ответ на повреждение клеток оценивали ^12. Эти типы моделей системы предоставляют новые и полезный способ исследования инициирования и патогенеза опухолей, которые возникают из эпителиальных тканей, и это имеет решающее значение в тканях, таких как FT, где нет линий клеток в настоящее время существуют, и где есть большой необходимость определения основных путей и разработка новых стратегий лечения.

Материалы

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)		Sigma	C7521
DMEM:F12 media		Cellgro	15-090-CV
Ultroser G		Crescent Chemical Company	67042	Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)
Pen Strep		Invitrogen	15140-122
BD Primaria culture plates		BD Bioscience	353802
24 well Transwell Permeable supports		Corning (Costar)	3470	Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester
MEM (Minimal Essential Media)		Cellgro	10-010-CV
Pronase		Roche	11459643001
DNAse		Sigma	DN25
Sall2 antibody		Dr T. Benjamin, Harvard	Gift	1:20 dilution
Pax8 antibody		Proteintech	10336-1-AP	1: 1000 dilution