Method Article
Die Eileiter (FT) wird als Alternative vor Ort Ursprungsbezeichnungen für seröse Ovarialkarzinom (SOC) entstehen. Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Isolierung und Ex vivo Kultur der Eileiter Epithelzellen. Dieses System rekapituliert die In vivo Epithel und ermöglicht das Studium der Pathogenese SOC.
Epithelialen Ovarialkarzinom ist eine führende Ursache der weiblichen Krebssterblichkeit in den Vereinigten Staaten. Im Gegensatz zu anderen frauenspezifischen Krebsarten, wie Brust-und Gebärmutterkrebs Karzinome, wo Todesraten in den letzten Jahren gesunken sind, haben Eierstockkrebs Heilungsraten blieb relativ unverändert in den vergangenen zwei Jahrzehnten 1. Dies ist im Wesentlichen auf das Fehlen geeigneter Screening-Tools zur Erkennung von frühen Stadium der Erkrankung, wo Operation und Chemotherapie sind am effektivsten, 2, 3. Als Ergebnis präsentieren die meisten Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung und diffuse Bauchschmerzen Engagement. Dies wird auch durch die Tatsache, dass Eierstockkrebs eine heterogene Erkrankung mit mehreren histologischen Subtypen 4, 5 ist kompliziert. Seröse Ovarialkarzinom (SOC) ist die häufigste und aggressivste Subtyp und die Form häufig mit Mutationen in den BRCA-Gene assoziiert. Aktuelle experimentelle Modelle in diesem Bereich mit dem Einsatz von Krebszelllinien und Maus-Modellen zum besseren Verständnis der Einleitung genetischen Ereignissen und Pathogenese der Krankheit 6, 7. Vor kurzem hat die Eileiter als neuartige Ort für die Entstehung des SOC in Erscheinung, der Eileiter (FT) sekretorischen Epithelzellen (FTSEC) als die vorgeschlagene Zelle Herkunft 8, 9. Es liegen noch keine Zelllinien oder Kultur-Systeme zur Verfügung, die FT Epithel oder die FTSEC studieren. Hier beschreiben wir eine neuartige ex vivo Kultur System, in dem primären humanen FT Epithelzellen in einer Weise, dass ihre Architektur, Polarität, Immunphänotyp, und die Reaktion auf physiologische und genotoxische Stressoren bewahrt kultiviert werden. Diese ex vivo-Modell bietet ein nützliches Werkzeug für das Studium der SOC, so dass ein besseres Verständnis davon, wie Tumore können aus diesem Gewebe entstehen, und die Mechanismen der Tumor-Initiation und Progression beteiligt.
1. Collagen Vorbereitung und Filter Coating.
2. Tissue Collection und Dissoziation.
3. Eileiter Plating.
4. Membrane Processing.
5. Repräsentative Ergebnisse:
Die Transwell-Filter können leicht entfernt werden, um die ex vivo Epithel von beiden Immunhistochemie (IHC) und Immunfluoreszenz (IF) zu untersuchen. Mit Linie spezifische Marker kann man Bild und Quantifizierung der sekretorischen (Pax8 positiv) und Flimmerepithel (Sall2 positive) Zellkompartimenten in diesen Kulturen (Abbildung 3). Darüber hinaus mit diesen Markern kann man beobachten, wie jeder Zelltyp verschiedene physiologische Signale 10 reagiert. Dieses System wurde verwendet, um die Veränderungen in der Sekretom und intrazelluläre Phosphoproteom der FT Epithel in Reaktion auf verschiedene Reize zu charakterisieren.
Abbildung 1. Die Illustration zeigt, wie ex vivo Kulturen aus primären humanen Eileiter Gewebe erzeugt. Eileiter Fimbrien Gewebe aus der OP gewonnen und zerkleinert, um kleine Fragmente 1, gewaschen und mit Dissoziation Medien inkubiert 24-72 Stunden 2 zu erzeugen. Nach Dissoziation abgeschlossen ist, werden die Gewebestücke dürfen auf den Grund der Inkubationszeit Rohr und das Medium mit den dissoziierten Epithelzellen absetzen geerntet wird 3. Die Effizienz der Dissoziation kann durch eine Untersuchung unter dem Phasenkontrast-Mikroskop 4 überwacht werden. Die dissoziierten epithelialen Zellen werden dann auf Primaria Platten kultiviert zur Beseitigung von Fibroblasten und hämatopoetischen Zellen, die sich immer mit den Epithelzellen 5 beigemischt. Sobald die nicht-epithelialen Zellen ausreichend entfernt werden, sind die Epithelzellen auf Transwell-Filter, die mit der menschlichen Plazenta Kollagen 5 beschichtet werden ausgesät. Das Medium wird durch Diffusion durch die Transwell von unten zur Verfügung gestellt. Die Kulturen werden für 24-48 Stunden inkubiert und anschließend die apikalen Medien entfernt wird. Die ex vivo Kulturen sind dann erlaubt, für 5-8 Tage wachsen, um eine vollständige, komplette Rasen auf der Transwell-Filter bilden. Die ex vivo Kulturen rentabel in diesem Zustand gehalten werden für bis zu 4 Wochen. Die Karikatur 5 zeigt eine Darstellung der ausgewachsenen ex vivo Kultur mit einem Beispiel für einen Filter aus dem Einsatz und gefärbt mit hämato entferntxylin und Eosin (H & E) zu zeigen, die Polarität und die Architektur der ex vivo Epithel.
Abbildung 2. Hellfeld-Mikroskopie von FT ex vivo Kulturen. Transwell-Einsätze sind mit der menschlichen Plazenta Kollagen 0.4μm Poren beschichtet sind (a). FT Epithelzellen auf die Kollagen-beschichteten Wendeschneidplatten (b), wo sie bilden eine Epithelschicht (c) kultiviert. Einige Trümmer wird in der Regel beobachtet Einhaltung Zellen im Epithel Kultur (durch Pfeile angedeutet), die meist auf Flimmerzellen.
Abbildung 3. FT ex vivo Kultur Immunfluoreszenz (IF). Beispiele für IF Bilder von ex vivo Kulturen fixiert und gefärbt mit Antikörpern gegen (a) sekretorische (Pax8) und (d) Flimmerepithel Zelle (Sall2) Marker. DAPI ist als Kontrolle für die Lage der Zellkerne (blau) (b und e) und fusionierte Antikörper und DAPI-Färbung wird auch gezeigt, (c und f) verwendet. Die Anzahl der Zellen ist abhängig von der Länge der Zeit werden die Zellen in Kultur (Pax8 Färbung, 7 Tage; Sall2 Färbung, 3 Tage).
Die Identifizierung der FT als Kandidat vor Ort Ursprungsbezeichnungen für SOC bietet die Möglichkeit für Grundlagenforschung und translationale Forschung an der Entschlüsselung der Mechanismen der Verknüpfung von bekannten Risikofaktoren und der tatsächlichen seröse krebserregend Prozess soll. Entscheidend für diese ist die Entwicklung von gefügig Systeme modellieren, die es uns ermöglichen, beginnen die Prüfung der Hypothese, dass die FTSEC einer Zelle des Ursprungslandes für Becken-seröse Karzinome ist, wird. Die ex vivo Kultur-Modell beschriebenen ist ein neuartiges System, das die Isolierung und Co-Kultur von primären FT sekretorische und Flimmerzellen erlaubt in einer Weise, dass die Morphologie und Biologie der einheimischen FT Epithel bewahrt. Mit diesem System haben wir vor kurzem aus der Sekretom dieses Epithel und wie das Epithel reagiert auf mechanische und genotoxische Verletzungen 10. Ovulation, ein wesentlicher Risikofaktor mit Eierstockkrebs Tumorgenese verbunden sind, ist durch eine Kombination von Gewebeschäden, Entzündungsmediatoren, Wachstumsfaktoren und Hormone 11 gekennzeichnet. Dieses System könnte verwendet werden, um die Wirkung eines ovulatorischen Milieu auf die Reaktion und die Lebensfähigkeit von sekretorischen und Flimmerzellen zu studieren. Darüber hinaus könnten die Auswirkungen anderer Zelltypen (zB Entzündungszellen) untersucht, um zu einem besseren Verständnis der Ereignisse zu ermöglichen, dass Laufwerk Zelltyp Differenzierung und die Faktoren, die zur neoplastischen Transformation dieser Zellen beitragen. Ähnliche Modelle wurden in anderen Geweben beschrieben worden, wo polarisierten Epithel vorhanden ist. Zum Beispiel im polarisierten primären Kulturen von Atemwegsepithel, wurde die Wirkung von Heregulin auf das Zellwachstum und die Reaktion auf Zellschädigung 12 bewertet. Diese Art von Modell-Systeme bieten eine neue und nützliche Methode, um die Einleitung und Pathogenese von Tumoren, die aus epithelialen Geweben entstehen zu studieren, und dies ist von entscheidender Bedeutung in Geweben wie der FT, wo keine Zelllinien zur Verfügung steht, und wo gibt es eine große Notwendigkeit für die Identifizierung der wichtigsten Wege und Entwicklung von neuartigen Therapiestrategien.
Wir danken der Fakultät, Genossen, Bewohner und Arzthelferinnen des Brigham and Womens Hospital, Department of Pathology zur Herstellung von Gewebe für diese Studien. Diese Arbeit wurde durch Forschungsgelder von der NIH / National Cancer Institute (P50 CA105009, CA108748 K08, U01 CA152990), Ovarian Cancer Research Fund, unterstützt The May Kay-Stiftung, Novartis Pharmaceuticals, Robert und Deborah Erste Fund, Randi und Joel Cutler Eierstockkrebs Research Fund, Marsha Rivkin Foundation - Scientific Scholar Award, AACR - George und Patricia Sehl Fellowship for Cancer Genetics Research, und dem amerikanischen Arzt Stipendium für Medizin in Israel - Claire und Emmanuel G. Rosenblatt Foundation Grant.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV) | Sigma | C7521 | ||
DMEM:F12 media | Cellgro | 15-090-CV | ||
Ultroser G | Crescent Chemical Company | 67042 | Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration) | |
Pen Strep | Invitrogen | 15140-122 | ||
BD Primaria culture plates | BD Bioscience | 353802 | ||
24 well Transwell Permeable supports | Corning (Costar) | 3470 | Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester | |
MEM (Minimal Essential Media) | Cellgro | 10-010-CV | ||
Pronase | Roche | 11459643001 | ||
DNAse | Sigma | DN25 | ||
Sall2 antibody | Dr T. Benjamin, Harvard | Gift | 1:20 dilution | |
Pax8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | 1: 1000 dilution |
Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden
Genehmigung beantragenThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten