Ex vivo-Kultur von primären humanen Eileiter Epithelzellen

Zusammenfassung

Die Eileiter (FT) wird als Alternative vor Ort Ursprungsbezeichnungen für seröse Ovarialkarzinom (SOC) entstehen. Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige Methode zur Isolierung und Ex vivo Kultur der Eileiter Epithelzellen. Dieses System rekapituliert die In vivo Epithel und ermöglicht das Studium der Pathogenese SOC.

Zusammenfassung

Epithelialen Ovarialkarzinom ist eine führende Ursache der weiblichen Krebssterblichkeit in den Vereinigten Staaten. Im Gegensatz zu anderen frauenspezifischen Krebsarten, wie Brust-und Gebärmutterkrebs Karzinome, wo Todesraten in den letzten Jahren gesunken sind, haben Eierstockkrebs Heilungsraten blieb relativ unverändert in den vergangenen zwei Jahrzehnten ^1. Dies ist im Wesentlichen auf das Fehlen geeigneter Screening-Tools zur Erkennung von frühen Stadium der Erkrankung, wo Operation und Chemotherapie sind am effektivsten, ^{2, 3.} Als Ergebnis präsentieren die meisten Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung und diffuse Bauchschmerzen Engagement. Dies wird auch durch die Tatsache, dass Eierstockkrebs eine heterogene Erkrankung mit mehreren histologischen Subtypen ^{4, 5} ist kompliziert. Seröse Ovarialkarzinom (SOC) ist die häufigste und aggressivste Subtyp und die Form häufig mit Mutationen in den BRCA-Gene assoziiert. Aktuelle experimentelle Modelle in diesem Bereich mit dem Einsatz von Krebszelllinien und Maus-Modellen zum besseren Verständnis der Einleitung genetischen Ereignissen und Pathogenese der Krankheit ^{6, 7.} Vor kurzem hat die Eileiter als neuartige Ort für die Entstehung des SOC in Erscheinung, der Eileiter (FT) sekretorischen Epithelzellen (FTSEC) als die vorgeschlagene Zelle Herkunft ^{8, 9.} Es liegen noch keine Zelllinien oder Kultur-Systeme zur Verfügung, die FT Epithel oder die FTSEC studieren. Hier beschreiben wir eine neuartige ex vivo Kultur System, in dem primären humanen FT Epithelzellen in einer Weise, dass ihre Architektur, Polarität, Immunphänotyp, und die Reaktion auf physiologische und genotoxische Stressoren bewahrt kultiviert werden. Diese ex vivo-Modell bietet ein nützliches Werkzeug für das Studium der SOC, so dass ein besseres Verständnis davon, wie Tumore können aus diesem Gewebe entstehen, und die Mechanismen der Tumor-Initiation und Progression beteiligt.

Protokoll

1. Collagen Vorbereitung und Filter Coating.

1. Zur Vorbereitung der menschlichen Plazenta Kollagen, tweeze aus 30 mg der menschlichen Plazenta Kollagen und setzte oben auf 50 ml destilliertem Wasser (dH ₂ O) in einem 500 ml Becherglas mit Rührstab.
2. Geben Sie 100 μls Eisessig direkt auf Kollagen zu erleichtern, sich aufzulösen. Warm bis 37 ° C und umrühren, um das Kollagen zu lösen. Es sollte in 20-30 Minuten zu lösen. Wenn Kollagenstränge in Lösung bleibt, wird Filtersterilisation schwierig sein.
3. Verdünnen Sie die 50 ml Lager mit 450 ml dH ₂ O und mit einem 0,2-um-Membranfilter-sterilisieren. Dies ist die letzte funktionierende Lösung. Lagerung bei 4 ° C.
4. Bereiten Transwell Filtermembranen durch Beschichtung mit Kollagen (50-100 ul) über Nacht. Chilled Kollagen muss auf RT erwärmt und dann in die obere Kammer hinzugefügt, um die Membran über Nacht und bei RT decken. Vor der Beschichtung der dissoziierten primäre Eileiter (FT) Epithel (siehe unten) auf die Transwell-Filter, waschen Sie die Filter dreimal in 1X Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mindestens 1 Stunde vor dem Gebrauch, um überschüssige Kollagen zu entfernen.

2. Tissue Collection und Dissoziation.

1. Frische Eileiter (FT) fimbria sollte in sterile 1X PBS in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen gesammelt und auf Eis gehalten vor der Verarbeitung in einem sterilen Gewebekultur Haube prompt.
2. Waschen Sie die Gewebeprobe einmal in 20 ml gekühltes 1X PBS (wenn die Probe in einem anderen Medientyp gesammelt worden ist oder blutige Wäsche mindestens 3X loswerden, wie viel Blut und ausländischen Medien wie möglich, da dies mit Platierungseffizienz stören könnten).
3. Mit einer sterilen Pinzette Transfer FT zu einer 10 cm Gewebe Kulturschale mit ein wenig PBS und mit einem sterilen Skalpell und einer sterilen Pinzette, geschnitten längs der Exposition der Epithelzellen zu maximieren. Öffnen Sie die Fimbria so dass es nicht mehr ist ein Rohr, sondern eine fast flache Platte aus Gewebe. Dann in kleinere, aber immer noch abrufbar Stück (ca. 3 mm im Durchmesser) schneiden.
4. Transfer-Stücke bis 45 ml des gekühlten Dissoziation Medien (MEM mit 1,4 mg / ml Pronase und 0,1 mg / ml DNAse) in einer 50 ml Tube.
5. Rock sanft bei 4 ° C für 24 bis 72 Stunden. (Aus Erfahrung, ist 48 Stunden optimal). Um Höhe der Dissoziation zu überprüfen, geben Sie einen Tropfen der Dissoziation Medien auf einer Folie und überprüfen Menge Verklumpung und Lebensfähigkeit des Gewebes (Schläge Flimmerzellen). Sie wollen sowohl einzelne Zellen und einige kleine Klumpen zu sehen.

3. Eileiter Plating.

1. Wenn die Menge der Epithelzellen Dissoziation optimal ist, inaktivieren die Medien durch Zugabe von 10% vol FBS. Invert ein paar Mal um die Zellsuspension in kleinere Aggregate zu entfernen.
2. Lassen großen Klumpen Gewebe (Stroma-Gewebe) in den Boden ab der Röhre. Entfernen Sie das Medium mit Epithelzellen in eine zweite 50 ml Tube.
3. Fügen Sie 50 ml kaltem MEM (ohne FBS), um den ursprünglichen 50 ml Tube. Umkehren, um weitere Zellen zu sammeln. Sammeln Medien in einen dritten 50 ml Tube (wenn die Probe ist sehr groß und eine hohe Anzahl von Zellen zu erwarten ist, kann dieser Schritt wiederholt werden, um Zellen Sammlung zu maximieren). Die große Stücke von stromalen / extrazelluläre Gewebe können nun entsorgt werden. Sie haben jetzt zwei 50 ml Röhrchen Zellsuspension. Zentrifugation bei 1000 rpm für 5 Minuten und absaugen Dissoziation Medien aus Zellpellets.
4. Resuspendieren in ca. 5-10 ml USG Medien (DMEM: F12 mit 2% USG und 1% Pen Strep ergänzt) erwärmt auf 37 ° C. Pipette vorsichtig. Seien Sie vorsichtig, nicht zu kräftig Pipette, da dies die epithelialen Zellen schädigen können und reduzieren die Qualität der Kulturen. Es sollte Einzelzellen und kleine Klumpen (Abbildung 1).
5. Transfer auf Primaria Kulturschalen und Inkubation für mindestens 1 Stunde oder bis zu 3 Stunden. Fibroblasten und die roten Blutkörperchen werden dem Kunststoff-Stick, aber die FT Epithelzellen nicht. Werfen Sie einen Blick auf die Platte nach einer Stunde, um zu sehen, wenn etwas kleben. Die Anwesenheit von Haarzellen kann mit der Feststellung, das Schlagen der Zilien zu sehen.
6. Während dieser Inkubation können Kollagen beschichtete Filter gewaschen und bereit gemacht für die Zell-Plating (Siehe Schritt 1,4)
7. Nach 1-3 Stunden Inkubation auf die Primaria Platten, übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15 ml Tube und spülen Sie die Primaria Platte mit 5 ml USG Medien, übertragen Sie diese Medien auf das Rohr auf ein Endvolumen von 15 ml zu machen. Zentrifugation bei 1000 rpm für 5 Minuten.
8. Vorsichtig absaugen Medien und verhindern, dass das Zellpellet. Gemessen an der Pellet-Größe, in der entsprechenden Menge an USG Medien resuspendieren. (In der Regel zwischen 1-3 ml) Weniger ist besser am Anfang, so dass Sie weiter verdünnen kann, wenn Sie benötigen. Resuspendieren sanft.
9. Add 10 ul der resuspendierten Zellen zu einem Hämacytometer und bestimmen die Zelldichte. Tipps: Sie sind für Epithelzellen, die eine deutlich dunkler Zellmembran haben und nicht-säulenförmige suchen. Sie können auch rechnen Flimmerzellen, die definitiv in Bewegung sind. Kleinere Zellen, die einen Heiligenschein appearan habence sind rote Blutkörperchen und sollte nicht gezählt werden. Es wird einige Klumpen werden, so müssen Sie diese in dich Zellzahl zu schätzen. Die Aussaat Ziel beträgt 1,65 x10 ⁵ Zellen / Membran oder mindestens 75%-Filter-Deckung (Abbildung 1). Wenn Zellen zu dünn sind vergoldet, werden die Zellen nicht in der Lage, eine vollständige Epithelschicht bilden.
10. Add 500 ul der USG Medien Unterseite der Vertiefung einer 24-Well-Platte und legen Transwell. Das erforderliche Volumen der FT Zellsuspension (siehe oben), dann kann auf jede Membran hinzugefügt werden, ist dies in der Regel 100 ul.
11. Inkubieren und wachsen nach 1-2 Tagen ohne störende Spitze Membran. Sie können die Medien auf der basalen Seite in diesen Tagen bei Bedarf ändern. Nach 1-2 Tagen können Sie sorgfältig abspülen oben mit USG Medien und eine kleine Menge (50-100 ul) von Medien auf der Membran. Es ist einfacher, dem Zusammenfluss von Zellkulturen zu bestimmen, ob Medien aus der apikalen Seite der Filter vor Mikroskopie entfernt wird. Das untere Fach sollte immer Medien. Sobald Kulturen sind vollständig konfluenten (in der Regel innerhalb von 5 Tagen), sollte die Menge von Medien, die sich Reisen durch die Filter von der basalen zur apikalen Seiten vernachlässigbar sein.
12. Ändern Sie den Basalmedien einmal alle zwei Tage für die ersten 10 Tage. Das untere Fach muss immer Medien zu halten Zellen am Leben. Sobald die Zellen haben ein dichtes Epithel (Abb. 1 und 2) sie in weiteren Studien, wie z. B. Immunfluoreszenz (IF) oder Immunhistochemie (IHC) verwendet werden können gebildet.

4. Membrane Processing.

1. Membrane Verarbeitung ist abhängig von der Art der Studie, die ausgeführt werden, aber in der Regel schließt die Entfernung der Filter aus dem Transwell-Einsätze.
2. Die Filter sind in der Regel 3-mal in 200 ul 1X PBS vor der Entnahme gewaschen.
3. Absaugen von PBS apikalen und basalen Seite der Filter. Diese sollte 1 gut gemacht werden zu einem Zeitpunkt, um die Membranen vor dem Austrocknen zu verhindern.
4. Entfernen Sie den Einsatz aus der Platte, drehen Sie sie auf den Kopf und mit einem sterilen Skalpell um die Membran herum geschnitten. Versuchen Sie, die Membran in einem Stück, indem sie gerade Schnitte um die Membran herum Kante, anstatt ziehen das Skalpell um den Rand zu entfernen.
5. Verwenden einer Pinzette, um den Filter aus dem Einsatz zu entfernen, zu verfolgen, welche Seite die Zellen auf. Der Filter kann dann für IF, IHC, etc. nach Bedarf bearbeitet werden.
6. Beispiel: für IF-Studien, den Filter (nach der Fixierung, Permeabilisierung, Sperrung und Inkubation mit entsprechenden Antikörpern, nach der Norm IF-Verfahren) sind auf einer Folie platziert werden, ist Zellen nach oben Vectashield mit DAPI auf den Filter fallen gelassen und mit einer Deckglas.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Die Transwell-Filter können leicht entfernt werden, um die ex vivo Epithel von beiden Immunhistochemie (IHC) und Immunfluoreszenz (IF) zu untersuchen. Mit Linie spezifische Marker kann man Bild und Quantifizierung der sekretorischen (Pax8 positiv) und Flimmerepithel (Sall2 positive) Zellkompartimenten in diesen Kulturen (Abbildung 3). Darüber hinaus mit diesen Markern kann man beobachten, wie jeder Zelltyp verschiedene physiologische Signale ¹⁰ reagiert. Dieses System wurde verwendet, um die Veränderungen in der Sekretom und intrazelluläre Phosphoproteom der FT Epithel in Reaktion auf verschiedene Reize zu charakterisieren.

Abbildung 1. Die Illustration zeigt, wie ex vivo Kulturen aus primären humanen Eileiter Gewebe erzeugt. Eileiter Fimbrien Gewebe aus der OP gewonnen und zerkleinert, um kleine Fragmente ^1, gewaschen und mit Dissoziation Medien inkubiert 24-72 Stunden ^{2 zu} erzeugen. Nach Dissoziation abgeschlossen ist, werden die Gewebestücke dürfen auf den Grund der Inkubationszeit Rohr und das Medium mit den dissoziierten Epithelzellen absetzen geerntet wird ^3. Die Effizienz der Dissoziation kann durch eine Untersuchung unter dem Phasenkontrast-Mikroskop ⁴ überwacht werden. Die dissoziierten epithelialen Zellen werden dann auf Primaria Platten kultiviert zur Beseitigung von Fibroblasten und hämatopoetischen Zellen, die sich immer mit den Epithelzellen ⁵ beigemischt. Sobald die nicht-epithelialen Zellen ausreichend entfernt werden, sind die Epithelzellen auf Transwell-Filter, die mit der menschlichen Plazenta Kollagen ⁵ beschichtet werden ausgesät. Das Medium wird durch Diffusion durch die Transwell von unten zur Verfügung gestellt. Die Kulturen werden für 24-48 Stunden inkubiert und anschließend die apikalen Medien entfernt wird. Die ex vivo Kulturen sind dann erlaubt, für 5-8 Tage wachsen, um eine vollständige, komplette Rasen auf der Transwell-Filter bilden. Die ex vivo Kulturen rentabel in diesem Zustand gehalten werden für bis zu 4 Wochen. Die Karikatur ⁵ zeigt eine Darstellung der ausgewachsenen ex vivo Kultur mit einem Beispiel für einen Filter aus dem Einsatz und gefärbt mit hämato entferntxylin und Eosin (H & E) zu zeigen, die Polarität und die Architektur der ex vivo Epithel.

Abbildung 2. Hellfeld-Mikroskopie von FT ex vivo Kulturen. Transwell-Einsätze sind mit der menschlichen Plazenta Kollagen 0.4μm Poren beschichtet sind (a). FT Epithelzellen auf die Kollagen-beschichteten Wendeschneidplatten (b), wo sie bilden eine Epithelschicht (c) kultiviert. Einige Trümmer wird in der Regel beobachtet Einhaltung Zellen im Epithel Kultur (durch Pfeile angedeutet), die meist auf Flimmerzellen.

Abbildung 3. FT ex vivo Kultur Immunfluoreszenz (IF). Beispiele für IF Bilder von ex vivo Kulturen fixiert und gefärbt mit Antikörpern gegen (a) sekretorische (Pax8) und (d) Flimmerepithel Zelle (Sall2) Marker. DAPI ist als Kontrolle für die Lage der Zellkerne (blau) (b und e) und fusionierte Antikörper und DAPI-Färbung wird auch gezeigt, (c und f) verwendet. Die Anzahl der Zellen ist abhängig von der Länge der Zeit werden die Zellen in Kultur (Pax8 Färbung, 7 Tage; Sall2 Färbung, 3 Tage).

Diskussion

Die Identifizierung der FT als Kandidat vor Ort Ursprungsbezeichnungen für SOC bietet die Möglichkeit für Grundlagenforschung und translationale Forschung an der Entschlüsselung der Mechanismen der Verknüpfung von bekannten Risikofaktoren und der tatsächlichen seröse krebserregend Prozess soll. Entscheidend für diese ist die Entwicklung von gefügig Systeme modellieren, die es uns ermöglichen, beginnen die Prüfung der Hypothese, dass die FTSEC einer Zelle des Ursprungslandes für Becken-seröse Karzinome ist, wird. Die ex vivo Kultur-Modell beschriebenen ist ein neuartiges System, das die Isolierung und Co-Kultur von primären FT sekretorische und Flimmerzellen erlaubt in einer Weise, dass die Morphologie und Biologie der einheimischen FT Epithel bewahrt. Mit diesem System haben wir vor kurzem aus der Sekretom dieses Epithel und wie das Epithel reagiert auf mechanische und genotoxische Verletzungen ^10. Ovulation, ein wesentlicher Risikofaktor mit Eierstockkrebs Tumorgenese verbunden sind, ist durch eine Kombination von Gewebeschäden, Entzündungsmediatoren, Wachstumsfaktoren und Hormone ¹¹ gekennzeichnet. Dieses System könnte verwendet werden, um die Wirkung eines ovulatorischen Milieu auf die Reaktion und die Lebensfähigkeit von sekretorischen und Flimmerzellen zu studieren. Darüber hinaus könnten die Auswirkungen anderer Zelltypen (zB Entzündungszellen) untersucht, um zu einem besseren Verständnis der Ereignisse zu ermöglichen, dass Laufwerk Zelltyp Differenzierung und die Faktoren, die zur neoplastischen Transformation dieser Zellen beitragen. Ähnliche Modelle wurden in anderen Geweben beschrieben worden, wo polarisierten Epithel vorhanden ist. Zum Beispiel im polarisierten primären Kulturen von Atemwegsepithel, wurde die Wirkung von Heregulin auf das Zellwachstum und die Reaktion auf Zellschädigung ¹² bewertet. Diese Art von Modell-Systeme bieten eine neue und nützliche Methode, um die Einleitung und Pathogenese von Tumoren, die aus epithelialen Geweben entstehen zu studieren, und dies ist von entscheidender Bedeutung in Geweben wie der FT, wo keine Zelllinien zur Verfügung steht, und wo gibt es eine große Notwendigkeit für die Identifizierung der wichtigsten Wege und Entwicklung von neuartigen Therapiestrategien.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)	Sigma-Aldrich	C7521
DMEM:F12 media	Cellgro	15-090-CV
Ultroser G	Crescent Chemical Company	67042	Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)
Pen Strep	Invitrogen	15140-122
BD Primaria culture plates	BD Biosciences	353802
24 well Transwell Permeable supports	Corning	3470	Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester
MEM (Minimal Essential Media)	Cellgro	10-010-CV
Pronase	Roche Group	11459643001
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
Sall2 antibody	Harvard - T. Benjamin Lab	Gift	1:20 dilution
Pax8 antibody	Proteintech	10336-1-AP	1: 1000 dilution