Method Article
A trompa de falópio (FT) está emergindo como um local alternativo de origem para o carcinoma de ovário seroso (SOC). Este protocolo descreve um novo método para o isolamento e Ex vivo Cultura de células epiteliais trompa de Falópio. Este recapitula o sistema In vivo Epitélio e permite o estudo da patogênese da SOC.
Câncer epitelial de ovário é a principal causa de mortalidade por câncer do sexo feminino nos Estados Unidos. Em contraste com outras mulheres específicos cânceres, como de mama e carcinomas uterinos, onde as taxas de mortalidade têm caído nos últimos anos, as taxas de cura do câncer de ovário têm permanecido relativamente inalterado ao longo das duas últimas décadas 1. Isto é principalmente devido à falta de instrumentos de triagem apropriados para a detecção da doença fase inicial onde a cirurgia ea quimioterapia são mais eficazes 2, 3. Como resultado, a maioria dos pacientes apresentam doença em estágio avançado e envolvimento abdominal difusa. Isto é ainda mais complicada pelo fato de que o câncer de ovário é uma doença heterogênea com múltiplas subtipos histológicos 4, 5. Carcinoma de ovário seroso (SOC) é o subtipo mais comum e agressivo ea forma mais frequentemente associado com mutações nos genes BRCA. Atuais modelos experimentais neste campo envolvem o uso de linhas de células cancerígenas e os modelos de mouse para melhor compreender os acontecimentos de iniciar genética e patogênese da doença 6, 7. Recentemente, a trompa de Falópio surgiu como um site da novela para a origem da SOC, com a trompa de falópio (FT) célula secretora do epitélio (FTSEC) como o celular proposta de origem 8, 9. Actualmente não há linhas de células ou de sistemas de acesso à cultura a estudar o epitélio FT ou o FTSEC. Aqui nós descrevemos um romance ex sistema de cultura in vivo, onde células primárias de humanos FT epiteliais são cultivadas de forma que preserva sua arquitetura, polaridade, imunofenótipo e resposta a estressores fisiológicos e genotóxicos. Este modelo ex vivo fornece uma ferramenta útil para o estudo da SOC, permitindo uma melhor compreensão sobre como os tumores podem surgir a partir deste tecido, e os mecanismos envolvidos na iniciação e progressão tumoral.
1. Preparação de colágeno e Coating Filter.
2. Coleta de Tecidos e dissociação.
3. Plating trompa de Falópio.
4. Processamento de membrana.
5. Resultados representativos:
Os filtros transwell possam ser facilmente removidos para examinar o epitélio ex vivo por ambos os imuno-histoquímica (IHQ) e de imunofluorescência (IF). Utilizando marcadores específicos da linhagem, pode-se imagem e quantificar o secretora (PAX8 positivo) e ciliadas (Sall2 positivo) compartimentos da célula nestas culturas (Figura 3). Além disso, utilizando esses marcadores, pode-se monitorar a forma como cada tipo de célula responde a diferentes estímulos fisiológicos 10. Este sistema tem sido utilizado para caracterizar as mudanças na phosphoproteome secretome e intracelular do epitélio FT em resposta a diversos estímulos.
Figura 1. Ilustração mostrando como ex vivo culturas são gerados a partir de tecido humano tubo primário de falópio. Tecido trompa de Falópio fimbrial é obtido a partir do centro cirúrgico e picada de gerar pequenos fragmentos 1, que são lavadas e incubadas com dissociação de mídia para 24-72 horas 2. Após a dissociação é completa, os fragmentos de tecido são autorizados a se depositar no fundo do tubo de incubação e da mídia contendo as células epiteliais dissociada é colhida 3. A eficiência de dissociação pode ser monitorado por exame ao microscópio de contraste de fase 4. As células epiteliais são, então, dissociado cultivadas em placas de Primaria para ajudar a remover fibroblastos e células hematopoiéticas que, invariavelmente, misturados com as células epiteliais 5. Uma vez que as células não epiteliais são adequadamente removidos, as células epiteliais são semeados em filtros transwell que são revestidos com colágeno placentário humano 5. Os meios de comunicação é fornecida pela difusão através da transwell de baixo. As culturas são incubadas por 24-48 horas e depois a mídia apical é removida. As culturas ex vivo são então autorizados a crescer por 5-8 dias para formar um gramado, cheio completas sobre os filtros transwell. As culturas ex vivo pode ser mantida de forma viável nesse estado por até 4 semanas. O cartoon 5 mostra uma representação da cultura vivo totalmente crescidas ex com um exemplo de um filtro removido da inserção e corado com hematoxylin e eosina (H & E) para demonstrar a polaridade e arquitetura do epitélio ex vivo.
Figura 2. Microscopia de campo claro de culturas FT ex vivo. Inserções Transwell são revestidos com humano poros 0.4μm placentária colágeno são visíveis (a). Células epiteliais FT são cultivadas em inserções de colágeno revestido (b), onde formam uma camada epitelial (c). Alguns detritos é normalmente aderidos às células epiteliais na cultura (indicado por setas), na maioria das vezes para as células ciliadas.
Figura 3. FT ex vivo da cultura de imunofluorescência (IF). Exemplos de SE imagens de culturas vivo ex fixados e corados com anticorpos contra o (a) de secreção (PAX8) e (d) células ciliadas (Sall2) marcadores. DAPI é usado como um controle para a localização de núcleos celulares (azul) (b e e) e do anticorpo fundidas e coloração DAPI também é mostrado (c e f). O número de células depende da duração do tempo as células estão em cultura (PAX8 coloração, 7 dias; Sall2 coloração, 3 dias).
A identificação da FT como um site de candidato de origem para o SOC fornece a oportunidade para a pesquisa básica e translacional destinada a decifrar os mecanismos que ligam fatores de risco conhecidos eo processo serosa real cancerígenos. Crítica para isso é o desenvolvimento de sistemas modelo tratável que vai nos permitir começar a testar a hipótese de que o FTSEC é uma célula de origem para pélvica carcinomas serosos. O modelo de cultura ex vivo aqui descrito é um sistema inovador que permite o isolamento e co-cultura de secreção FT primária e células ciliadas de forma que preserva a morfologia e biologia do epitélio FT nativa. Usando este sistema, que recentemente caracterizou a secretome deste epitélio e como o epitélio responde à agressão mecânica e genotóxicos 10. Ovulação, um importante fator de risco associado a tumorigênese de ovário, é caracterizada por uma combinação de lesão tecidual, mediadores inflamatórios, fatores de crescimento e hormônios 11. Este sistema poderia ser usado para estudar o efeito de um ambiente sobre a resposta ovulatória e viabilidade de células ciliadas e secretoras. Além disso, o impacto de outros tipos de células (células inflamatórias ou seja) poderia ser examinado para permitir uma melhor compreensão dos eventos que a diferenciação de células da unidade-tipo e os fatores que contribuem para a transformação neoplásica destas células. Modelos similares já foram descritos em outros tecidos onde epitélio polarizado está presente. Por exemplo, em culturas primárias de polarizada epitélio das vias aéreas, o efeito da heregulin no crescimento celular e resposta a lesão celular foi avaliada 12. Estes tipos de sistemas modelo fornecer uma maneira nova e útil para estudar a iniciação e patogênese dos tumores que surgem a partir de tecidos epiteliais, e isso é de importância crítica em tecidos como o FT, onde não há linhas de células existem atualmente, e onde há um grande necessidade de identificação das vias principais e desenvolvimento de estratégias de tratamento da novela.
Agradecemos aos professores, bolsistas, residentes e médicos assistentes do Hospital Brigham and Women, o Departamento de Patologia para a tomada de tecido disponível para estes estudos. Este trabalho foi suportado por concessões de pesquisa do NIH / National Cancer Institute (P50 CA105009, K08 CA108748, U01 CA152990), ovário Cancer Research Fund, The May Kay Foundation, Novartis Pharmaceuticals, Robert e Deborah First Fund, Randi e Joel cancro do ovário Cutler Research Fund, Marsha Rivkin Foundation - Prêmio Acadêmico Científico, AACR - George e Patrícia Sehl Fellowship para Cancer Genetics, da Investigação e da Sociedade Médica Americana de Medicina em Israel - Claire e Emmanuel G. Rosenblatt Foundation Grant.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV) | Sigma | C7521 | ||
DMEM:F12 media | Cellgro | 15-090-CV | ||
Ultroser G | Crescent Chemical Company | 67042 | Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration) | |
Pen Strep | Invitrogen | 15140-122 | ||
BD Primaria culture plates | BD Bioscience | 353802 | ||
24 well Transwell Permeable supports | Corning (Costar) | 3470 | Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester | |
MEM (Minimal Essential Media) | Cellgro | 10-010-CV | ||
Pronase | Roche | 11459643001 | ||
DNAse | Sigma | DN25 | ||
Sall2 antibody | Dr T. Benjamin, Harvard | Gift | 1:20 dilution | |
Pax8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | 1: 1000 dilution |
Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE
Solicitar PermissãoThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados