Ex Vivo התרבות של האדם תאים ראשוניים החצוצרה אפיתל

Summary

החצוצרה (FT) מתגלה כאתר חלופי ממוצא עבור סרטן השחלות הצפק (SOC). פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה בידוד ו לשעבר vivo התרבות של תאים החצוצרה אפיתל. מערכת זו משחזר In vivo האפיתל, ומאפשר את לימוד בפתוגנזה SOC.

Abstract

סרטן השחלות אפיתל היא הגורם המוביל לתמותה מסרטן נשי בארצות הברית. בניגוד לנשים ספציפיים סרטן אחרים, כמו השד קרצינומה של הרחם, כאשר שיעור התמותה ירדו בשנים האחרונות, שיעורי ריפוי סרטן השחלות נותרו ללא שינוי יחסית לאורך שני העשורים האחרונים ^1. זה נובע במידה רבה מחוסר כלים ההקרנה המתאים לגילוי המחלה בשלב מוקדם בו ניתוח וכימותרפיה הם יעילים ביותר ^{2, 3.} כתוצאה מכך, רוב המטופלים עם מחלה בשלב הנוכחי מתקדמים מעורבות הבטן מפוזר. זה מסתבך עוד יותר בשל העובדה סרטן השחלות היא מחלה הטרוגנית עם תת היסטולוגית מספר ^{4, 5.} סרטן שחלות נסיובי (SOC) הוא תת הנפוצים ביותר אגרסיבי הטופס הקשורים לרוב עם מוטציות בגנים BRCA. מודלים ניסיוניים מקומי בתחום זה כרוכות בשימוש שורות תאים סרטניים מודלים העכבר כדי להבין טוב יותר את האירועים גנטי ייזום בפתוגנזה של מחלות ^{6, 7.} לאחרונה, החצוצרה התפתחה כאתר הרומן מוצא SOC, עם החצוצרות (FT) התאים מפרישים אפיתל (FTSEC) כתא המוצע של ^{8 המוצא, 9.} כרגע אין קווים סלולריים או מערכות תרבות זמין ללמוד את האפיתל FT או FTSEC. כאן אנו מתארים לשעבר רומן vivo התרבות מערכת שבה העיקרי בתאי האפיתל FT אדם מתורבתים באופן שמשמר ארכיטקטורה שלהם, קוטביות, immunophenotype, ובתגובה ללחצים פיזיולוגי genotoxic. מודל זה vivo לשעבר מספק כלי שימושי לחקר SOC, ומאפשר הבנה טובה יותר של כמה גידולים יכול לנבוע רקמה זו, המנגנונים המעורבים בייזום התקדמות הגידול.

Protocol

1. קולגן הכנה ציפוי מסנן.

1. כדי להכין את השליה קולגן אנושי, למרוט את 30 מ"ג של קולגן השליה האנושית לשים על גבי 50 מ"ל של מים מזוקקים (DH ₂ O) בכוס 500 מ"ל עם בר ומערבבים.
2. הוספת 100 μls של חומצה אצטית קרחונית ישירות על קולגן כדי להקל לפזר. חם עד 37 ° C ומערבבים אותו לפזר את הקולגן. יש להמיס 20-30 דקות. אם גדילי קולגן להישאר פתרון, עיקור לסנן יהיה קשה.
3. לדלל את המניות עם 50 מ"ל 450 מ"ל של DH ₂ O ו-מסנן לעקר עם קרום 0.2 מיקרומטר. זהו הפתרון הסופי עובד. חנות ב 4 ° C.
4. הכן ממברנות Transwell לסנן ידי ציפוי אותם עם קולגן (5-10 μl) לילה. קולגן מצוננים יש לחמם RT ואז הוסיף לתא העליון על מנת לכסות את קרום לילה ועל RT. לפני ציפוי הצינור ניתק השחלה ראשונית (FT) אפיתל (ראה להלן) על גבי מסנני Transwell, לשטוף את המסננים שלוש פעמים פוספט 1X בופר סליין (PBS) לפחות 1 שעה לפני השימוש כדי להסיר עודפי קולגן.

2. רקמות איסוף דיסוציאציה.

1. החצוצרה טרי (FT) fimbria צריך להיות סטרילי שנאספו 1X PBS בצינור צנטריפוגה 50 מ"ל ושמרה על הקרח לפני הפקודה עיבוד ברדס רקמה סטרילית תרבות.
2. שטפו את דגימת רקמות פעם 20 מ"ל מקורר 1X PBS (אם המדגם נאסף בסוג אחר של מדיה או לשטוף הדמים לפחות 3X להיפטר כמו דם רב בתקשורת הזרה ככל האפשר זה עלול להפריע יעילות ציפוי).
3. שימוש סטרילי FT פינצטה להעביר צלחת 10 ס"מ עם רקמה תרבות PBS מעט, בעזרת פינצטה אזמל סטרילי סטריליות, לחתוך longitudinally על מנת למקסם את החשיפה של תאים אפיתל. פתח את fimbria כך הוא כבר לא צינור אלא גיליון כמעט שטוח של רקמה. ואז לחתוך לחתיכות קטנות יותר אבל עדיין לשחזור (כ 3 מ"מ קוטר).
4. העברת חלקים ל 45 מ"ל של צונן ניתוק התקשורת (ממ המכיל 1.4 מ"ג / מ"ל ​​Pronase ו 0.1 מ"ג / מ"ל ​​DNAse) בתוך שפופרת 50 מ"ל.
5. רוק בעדינות על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 72 שעות. (מניסיון, 48 שעות הוא אופטימלי). כדי לבדוק את כמות דיסוציאציה, לשים טיפה של ניתוק התקשורת בשקופית ולבדוק כמות clumping ואת הכדאיות רקמות (מכות ריסי התאים). אתה רוצה לראות שני תאים בודדים וכמה גושים קטנים.

3. החצוצרה ציפוי.

1. כאשר כמות דיסוציאציה תא אפיתל הוא אופטימלי, להשבית את התקשורת על ידי הוספת נפח 10% FBS. ללא מרחב זה כמה פעמים כדי לסלק את ההשעיה לתוך תא אגרגטים קטנים יותר.
2. אפשר גושי רקמה גדול (רקמת סטרומה) ​​להתיישב לתחתית הצינור. הסר מדיה המכילה תאים אפיתל לתוך צינור 50 second מ"ל.
3. הוסף 50 מ"ל של ממ קר (לא FBS) אל הצינור המקורי 50 מ"ל. היפוך לאסוף תאים נוספים. איסוף מדיה לתוך שפופרת 50 מ"ל השלישי (אם המדגם הוא גדול מאוד ומספר גבוה של תאים צפוי, שלב זה ניתן לחזור על מנת למקסם את אוסף תאים). חתיכות גדולות של רקמה סטרומה / תאיים יכולים כעת להיות מושלך. כעת יש שני צינורות 50 מ"ל של השעיה התא. צנטריפוגה בסל"ד 1000 למשך 5 דקות לשאוב התקשורת ניתוק מן כדורי התא.
4. Resuspend ב כ 5-10 מ"ל של USG מדיה (DMEM: F12 USG בתוספת 2% ו עט סטרפטוקוקוס 1%) חימם עד 37 ° C. פיפטה בעדינות. היזהר שלא פיפטה גם במרץ כמו זה עלול לגרום נזק לתאי האפיתל ולהפחית את האיכות של תרבויות. לא צריך להיות תאים בודדים ו גושים קטנים (איור 1).
5. העברה על גבי צלחות Primaria תרבות דגירה מינימום של 1 שעה או עד 3 שעות. Fibroblasts ותאי דם אדומים ידבק הפלסטיק אבל התאים FT אפיתל לא. תסתכל על הצלחת אחרי שעה כדי לראות אם משהו הוא דבק. נוכחות של תאים ריסי ניתן לראות על ידי ציון הפועם של הריסים.
6. במהלך הדגירה זה, מסננים קולגן מצופה ניתן לכבס ועשה מוכן ציפוי התא (ראה שלב 1.4)
7. לאחר 1-3 שעות של דגירה על צלחות Primaria, להעביר את ההשעיה התא צינור 15 מ"ל ולשטוף את הצלחת Primaria עם 5 מ"ל USG התקשורת, להעביר את התקשורת הצינור לעשות נפח סופי של 15 מ"ל. צנטריפוגה בסל"ד 1000 למשך 5 דקות.
8. בזהירות לשאוב התקשורת למנוע שיבוש התא גלולה. אם לשפוט לפי גודל כדורית, resuspend בכמות המתאימה של USG התקשורת. (בדרך כלל בין 1-3 מ"ל) פחות טוב בהתחלה, כך שאתה יכול לדלל עוד יותר אם אתם צריכים. Resuspend בעדינות.
9. הוסף 10 μl של תאים resuspended hemacytometer כדי לקבוע את צפיפות התאים. טיפים: אתם מחפשים לתאי האפיתל שיש להם קרום התא כהה בבירור והם לא עמודי. ניתן גם לספור תאים ריסי זה בהחלט מרגש. תאים קטנים יותר, כי יש appearan הילהce הם כדוריות דם אדומות ולא צריך לסמוך. יהיו כמה clumping, אז אתה צריך להעריך את זה לתוך לספור את התא. המטרה היא זריעת 1.65 x10 ⁵ תאים / קרום, או לפחות 75% כיסוי המסנן (איור 1). אם התאים מצופה גם בדלילות, התאים לא יוכלו ליצור שכבת האפיתל להשלים.
10. הוסף 500 μl של התקשורת USG לתחתית הבאר של צלחת גם 24 והכנס Transwell. נפח הנדרש ההשעיה תא FT (ראה לעיל) ניתן להוסיף על גבי קרום אחד, זה בדרך כלל 100 μl.
11. דגירה ולגדול עבור 1-2 ימים ללא למעלה מטרידה של הממברנה. ניתן לשנות את התקשורת בצד הבסיס באותם ימים אם יש צורך. לאחר 1-2 ימים, אתה יכול לשטוף היטב את החלק העליון עם USG מדיה להוסיף כמות קטנה (5-10 μl) של התקשורת על גבי הממברנה. קל יותר לקבוע את מפגש של תרביות תאים אם התקשורת מוסר מהצד apical של המסננים לפני במיקרוסקופ. תא נמוך צריך תמיד להכיל התקשורת. לאחר תרבויות הם ומחוברות במלואו (בדרך כלל תוך 5 ימים), כמות התקשורת העוברים דרך המסננים מן הבסיס אל הצדדים apical צריך להיות זניח.
12. שינוי בתקשורת הבסיס פעם ביומיים במשך 10 הימים הראשונים. תא התחתון חייב תמיד התקשורת כדי לשמור על התאים בחיים. ברגע שהתאים יצרו שכבת האפיתל צמודים (איורים 1 ו -2) הם יכולים לשמש מחקרים נוספים, כגון immunofluorescence (IF) או אימונוהיסטוכימיה (IHC).

4. ממברנה עיבוד.

1. עיבוד ממברנה תלוי בסוג מחקר זה יבוצע, אבל בדרך כלל כרוכה הסרת המסנן מ מחדיר Transwell.
2. המסננים נשטפים בדרך כלל 3 פעמים 200 μl של 1X PBS לפני ההסרה.
3. לשאוב PBS מצד apical ואת הבסיס של המסננים. זה צריך להיעשות 1 היטב בכל פעם כדי למנוע את הקרומים מהתייבשות.
4. הסר את הכנס מהצלחת, להפוך אותו הפוך ולהשתמש אזמל סטרילי לחתוך סביב הממברנה. נסה להסיר את הקרום בחתיכה אחת על ידי ביצוע חתכים ישר מסביב לקצה קרום, במקום לגרור את האזמל מסביב לקצה.
5. להשתמש בפינצטה כדי להסיר את המסנן מתוך הכנס את, שמירה על מסלול של איזה צד התאים על. מסנן אז יכול להיות מעובד על IF, IHC, וכו 'בהתאם.
6. דוגמה: אם עבור מחקרים, המסנן (לאחר permeabilization קיבוע, חסימת הדגירה עם נוגדנים מתאימים, על פי תקן אם הליכים) צריך להיות ממוקם בשקופית, התאים כלפי מעלה, Vectashield עם DAPI הוא ירד על המסנן מכוסה זכוכית coverslip.

5. נציג תוצאות:

המסננים transwell ניתן להסיר בקלות לבחון את אפיתל vivo לשעבר ידי אימונוהיסטוכימיה שניהם (IHC) ו immunofluorescence (IF). שימוש השושלת סמנים ספציפיים, אפשר לכמת את התמונה הפרשה (Pax8 חיובי) ו ריסי (Sall2 חיובי) תאים תא בתרבויות אלה (איור 3). יתר על כן, באמצעות סמנים אלה, ניתן לעקוב כיצד כל סוג תא מגיב לאותות פיזיולוגיים שונים ^10. מערכת זו נעשה שימוש על מנת לאפיין את השינויים phosphoproteome secretome ו תאיים של האפיתל FT בתגובה לגירויים השונים.

באיור 1. איור המתאר כיצד לשעבר תרבויות vivo נוצרות מרקמת הצינור האנושי העיקרי השחלה. רקמת החצוצרה fimbrial מתקבל חבילת כירורגית טחון ליצור שברים קטנים ^1, כי הם שטף מודגרות עם ניתוק התקשורת 24-72 שעות ^2. לאחר הניתוק הוא מוחלט, שברי הרקמה מותר ליישב לתחתית של התחתית הדגירה והתקשורת המכיל את לתאי האפיתל הוא ניתק שנקטפו ^3. היעילות של דיסוציאציה יכולה להיות במעקב על ידי בדיקה תחת ⁴ שלב בניגוד מיקרוסקופ. תאים אפיתל ניתק הם מתורבתים אז על צלחות Primaria לעזור להסיר תאים פיברובלסטים hematopoietic כי תמיד ונכללה בה תאים אפיתל ^5. לאחר אי - אפיתל תאים יוסרו כראוי, התאים אפיתל הם זורעים על גבי מסנני transwell כי הם מצופים השליה קולגן אנושי ^5. התקשורת מסופק על ידי דיפוזיה דרך transwell מלמטה. תרבויות מודגרת במשך 24-48 שעות ואז התקשורת apical מוסר. תרבויות vivo לשעבר מותר אז לגדול במשך 5-8 ימים כדי ליצור דשא מלא, שלם על מסנני transwell. תרבויות vivo לשעבר יכול להישמר viably עד 4 שבועות במצב הזה. הקריקטורה ⁵ מראה ייצוג של תרבות בוגרת vivo לשעבר עם דוגמה של מסנן להסיר להכניס את ומוכתמים והמטוxylin ו eosin (H & E) כדי להדגים את הקוטביות ואת הארכיטקטורה של האפיתל vivo לשעבר.

איור 2. במיקרוסקופ שדה מוארת של FT תרבויות לשעבר vivo. מוסיף Transwell הם מצופים האדם הנקבוביות 0.4μm השליה קולגן נראים (א). תאים אפיתל FT הם מתורבתים על קולגן מוסיף מצופים (ב), שם הם יוצרים שכבת אפיתל (ג). פסולת כמה הוא ציין שבדרך כלל לדבוק תאים בתרבות אפיתל (מסומנת בחצים), לרוב תאים ריסי.

איור 3. FT לשעבר vivo תרבות immunofluorescence (IF). דוגמאות אם התמונות של תרבויות vivo לשעבר קבוע מוכתם נוגדנים כנגד הפרשה (א) (Pax8) ו - (ד) תא ריסי (Sall2) סמנים. DAPI משמש לשלוט על המיקום של גרעיני תאים (כחול) (ב ו - ה) ו נוגדן הממוזג מכתים DAPI מוצג גם (ג ו - ו). מספר התאים תלוי משך הזמן התאים בתרבית (Pax8 מכתים, 7 ימים; Sall2 מכתים, 3 ימים).

Discussion

הזיהוי של FT כאתר מועמד ממוצא עבור SOC מספק הזדמנות למחקר בסיסי translational שמטרתן לפענח את המנגנונים המקשרים גורמי סיכון ידועים ותהליך בפועל מסרטנים הצפק. קריטי עבור זה הוא פיתוח של מערכות מודל ממושמע שיאפשר לנו להתחיל לבדוק את ההשערה כי FTSEC הוא תא-of-מקור עבור קרצינומה הצפק האגן. Vivo לשעבר התרבות המודל שתואר להלן, היא מערכת חדשנית המאפשרת את הבידוד ושיתוף תרבות של הפרשה FT ראשוניים בתאים ריסי באופן שמשמר את המורפולוגיה והביולוגיה של האפיתל FT הילידים. באמצעות מערכת זו, אנו לאחרונה שאפיינה את secretome של האפיתל הזה ואיך האפיתל מגיב פגיעה מכנית genotoxic ^10. הביוץ, גורם סיכון מרכזי הקשור tumorigenesis השחלות, מאופיין על ידי שילוב של פגיעה ברקמות, מתווכים דלקתיים, גורמי גדילה, והורמונים ^11. מערכת זו יכולה לשמש כדי לחקור את ההשפעה של הסביבה הביוץ על התגובה ואת הכדאיות של הפרשה ותאי ריסי. בנוסף, ההשפעה של סוגי תאים אחרים (כלומר תאים דלקתיים) ניתן היה לבדוק על מנת לאפשר הבנה טובה יותר של אירועים מסוג זה בתא הכונן בידול הגורמים שתורמים השינוי neoplastic של תאים אלה. מודלים דומים תוארו ברקמות האפיתל מקוטב אחר שבו הוא ההווה. למשל, בתרבויות העיקרי מקוטב של אפיתל דרכי הנשימה, ההשפעה של heregulin על צמיחת התאים בתגובה לפציעה הסלולר הוערך ^12. אלו סוגים של מערכות מודל לספק דרך חדשה ושימושית ללמוד את חניכה בפתוגנזה של גידולים אשר נובעים רקמות אפיתל, ואת זה הוא בעל חשיבות קריטית ברקמות כגון FT שבו אין שורות תאים קיימות כיום, והיכן יש גדול לצורך זיהוי של המסלולים מפתח ופיתוח של אסטרטגיות טיפול חדשניות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)	Sigma-Aldrich	C7521
DMEM:F12 media	Cellgro	15-090-CV
Ultroser G	Crescent Chemical Company	67042	Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)
Pen Strep	Invitrogen	15140-122
BD Primaria culture plates	BD Biosciences	353802
24 well Transwell Permeable supports	Corning	3470	Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester
MEM (Minimal Essential Media)	Cellgro	10-010-CV
Pronase	Roche Group	11459643001
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
Sall2 antibody	Harvard - T. Benjamin Lab	Gift	1:20 dilution
Pax8 antibody	Proteintech	10336-1-AP	1: 1000 dilution