前初级人类输卵管上皮细胞的体外培养

摘要

输卵管（FT）是一种新兴的原产地为浆液性卵巢癌（SOC）的另一幅土地。本协议描述了一种新方法和隔离体外文化输卵管上皮细胞。此系统概括了在体内上皮和允许SOC的发病机制的研究。

摘要

上皮性卵巢癌是女性癌症死亡率在美国的首要原因。相比之下其他女性特定癌症，如乳腺癌和子宫癌，死亡率在最近几年下降，卵巢癌的治愈率保持相对不变，在过去二^十年 1 。这主要是由于缺乏适当的筛检工具，用于检测疾病早期手术和化疗是最^{有效的2，} 3。因此，大多数患者目前晚期疾病和弥漫性腹部参与。这是进一步复杂化的事实，卵巢癌是一种异质性疾病与多个组织学亚型^4，5。浆液性卵巢癌（SOC）是最常见的和积极的亚型，并与BRCA基因突变有关的最常见的形式。目前的实验模型，在这一领域涉及肿瘤细胞株和小鼠模型的使用，以便更好地了解发起的遗传事件^{和发病机制}的疾病6，7。近日，作为SOC的起源小说网站，已经出现输卵管输卵管（FT）的分泌上皮细胞（FTSEC）作为建议的起源^8，9细胞。目前没有任何细胞系或文化系统研究“金融时报上皮或FTSEC。在这里，我们描述了一种新型的体外培养系统，其中首要人权FT上皮细胞培养的方式，可以保留他们的体系结构，极性，免疫，生理和遗传毒性应激。这种体外模型SOC的研究提供了一个有用的工具，允许更好地了解如何从这个组织的肿瘤可以产生，并参与肿瘤启动和进展的机制。

研究方案

1。胶原蛋白的制备和筛选涂层。

1. 为了准备人类胎盘胶原蛋白，tweeze人胎盘胶原蛋白的30毫克和50毫升的蒸馏水_{（DH 2 O）}的顶部，在一个500毫升烧杯中搅拌棒。
2. 直接添加到胶原蛋白100冰醋酸μls，使其更容易溶解。预热至37 ° C，搅拌溶解的胶原蛋白。它应该溶解在20-30分钟。如果胶原蛋白链留在溶液中，过滤除菌将是困难的。
3. 稀与450毫升DH _{2 O}和一个0.2微米的膜过滤消毒，50毫升股票。这是最终的工作方案。保存在4 ° C。
4. 准备涂层他们与胶原蛋白（50-100μL）一夜之间Transwell小滤膜。冰鲜胶原蛋白必须加热到RT，然后添加到上层舱一夜之间覆盖膜，在室温下。 Transwell小过滤器上的电镀前游离原发性输卵管（FT）上皮（见下文），清洗过滤器3次1X磷酸缓冲液（PBS）至少1个小时之前使用，以除去多余的胶原蛋白。

2。组织收集和分离。

1. 新鲜的输卵管（FT）的伞应收集在无菌1X PBS 50 mL离心管中，并保持在冰上前提示在无菌组织培养罩的加工。
2. 组织样品洗净，一次20毫升冷冻1X PBS（如果样品已经被收集在另一种类型的媒体或至少3X得到尽可能多的血液和国外媒体报道，尽可能摆脱的，因为这可能会干扰电镀效率）的血腥清洗。
3. 使用无菌镊子传输英尺至10厘米的一点点PBS和组织培养皿中，用消毒的手术刀和无菌镊子，切纵向最大化的上皮细胞暴露。打开伞，以便它不再是一管，但组织几乎平板。然后切成块较小，但仍检索（直径约3毫米）。
4. 件转移至45毫升50毫升管冷冻分解媒体（MEM含1.4毫克/毫升链霉蛋白酶和0.1毫克/毫升DNA酶）。
5. 岩轻轻在4 ° C为24至72小时。 （从经验来看，48小时是最佳）。要检查的解离适量，放幻灯片上下降解离媒体和检查的聚集量和组织活力（殴打纤毛细胞）。您想看到单个细胞和一些小团块。

3。输卵管电镀。

1. 当上皮细胞分解量是最优的，灭活通过添加10％胎牛血清体积的媒体。颠倒几次打跑聚合成更小的细胞悬液。
2. 允许大的组织团块（间质组织）在底部定居管。取出介质，它包含了第二个50毫升管上皮细胞。
3. 添加50毫升冷的MEM（无FBS），原来的50毫升管。反转，以收集更多的细胞。收集到第三个50毫升管（如果样品是非常大的，高的细胞数量预计的，可重复此步骤，以最大限度地提高细胞采集）的媒体。基质/外组织的大块现在可以被丢弃。你现在有两个50 ml的细胞悬液管。离心5分钟，从细胞颗粒吸分解媒体1000 RPM。
4. 重悬在约5-10毫升媒体副秘书长（辅以2％的副秘书长和1％钢笔链球菌的DMEM：F12）预热至37 ° C移液器轻轻。要小心不要吸管太大力，因为这可能会破坏上皮细胞，并减少的文化素质。应该有单细胞和小团块（图1）。
5. 转移到Primaria培养皿，孵育至少1小时或长达3个小时。成纤维细胞和红细胞，将继续坚持以塑料，但“金融时报”上皮细胞不会。一个小时后，来看看什么是坚持要在板的外观。注意到跳动的纤毛，纤毛细胞的存在可以看出。
6. 在此孵化，胶原蛋白涂层过滤器可水洗和细胞电镀（见步骤1.4）
7. Primaria板孵化1-3小时后，细胞悬液转移至15毫升管和冲洗用5毫升副秘书长媒体Primaria板，管这个媒体传输，使终体积为15毫升。离心5分钟1000转。
8. 小心吸媒体和避免破坏细胞沉淀。颗粒大小来看，重悬在副秘书长媒体适量。 （通常在1-3毫升）是更好的开始，让您可以稀释进一步，如果你需要。重悬轻轻。
9. 加入10μL的悬浮细胞hemacytometer确定细胞密度。提示：您有一个明显的暗的细胞膜和非柱状上皮细胞。您也可以肯定是移动的纤毛细胞计数。较小的细胞，具有晕appearanCE是红血细胞和不应该算。会有一些结块，所以你需要估计，到你的细胞计数。播种的目标是1.65 × 10 ⁵细胞/膜，或至少75％的过滤器覆盖（图1）。如果镀过于稀疏的细胞，细胞将无法形成一个完整的上皮细胞层。
10. 加入500μL的副秘书长媒体以及一个24孔板底部插入Transwell小。然后可以添加到每个膜FT细胞悬液（见上文）的要求量，这通常是100μL。
11. 1-2天的孵化和成长过程中没有令人不安的顶部膜。在那些日子里，您可以更改基础的媒体，如果有必要。 1-2天之后，你可以仔细冲洗副秘书长媒体的顶部和媒体对膜的顶部添加少量（50-100μL）。这是比较容易，以确定细胞培养汇合，如果媒体是从心尖侧镜前的过滤器除去。下格应始终包含媒体。一旦文化完全融合（通常在5天之内），媒体传播通过过滤器从基底到心尖双方应是微不足道的。
12. 更改第10天，每两天一次的基础媒体。下格必须始终保持细胞存活的媒体。一旦细胞已经形成了严密的上皮细胞层（图1，图2），他们可以在进一步的研究，如免疫荧光（IF）或免疫组织化学（IHC），使用。

4。膜处理。

1. 膜处理是依赖于类型的研究，将要执行的，但通常涉及从Transwell小插入过滤器去除。
2. 该过滤器通常是在清除之前的1X PBS 200μL洗3次。
3. 从心尖和基底侧的过滤器，吸PBS。这项工作应在1井一次，以防止膜干燥。
4. 从板卸下插入，翻转，倒置，并用无菌手术刀切断周围的膜。尝试删除周围的膜边缘的直线切割，而不是周围的边缘拖动手术刀在一块膜。
5. 使用镊子取出插入过滤器，跟踪细胞对哪一方。该过滤器，然后可以酌情处理的IF，IHC等。
6. 例如：如果过滤器（固定，通透，阻塞和相应抗体的潜伏期后，如果程序标准）的研究，应放在幻灯片上，细胞朝上，用DAPI Vectashield下降到过滤器和一个覆盖玻璃盖玻片。

5。代表性的成果：

Transwell小过滤器可以很容易地清除到体外上皮细胞免疫组织化学（IHC）和免疫荧光（IF）的研究。谱系特异性标志物的使用，可以形象和量化的分泌（Pax8正）和纤毛（Sall2阳性）细胞，在这些文化室（图3）。此外，使用这些标记，可以监控不同的细胞类型如何响应不同的生理^线索 10 。该系统已用于表征secretome的FT上皮细胞内磷酸化的变化，在各种刺激的反应。

图1。插图描绘体外文化是如何从初级人类输卵管组织的产生 。输卵管菌毛组织是从手术套房和肉末产生小^片段 1，洗净，与解离媒体孵育24-72 ^小时 2 。解离完成后，组织碎片是可以解决的潜伏期管的底部，并含有游离的上皮细胞的^媒体 ，收获3。离解效率可以监视通过考试，下一个相衬^显微镜 4 。游离的上皮细胞，然后培养Primaria板，以帮助消除成纤维细胞和造血干细胞，无不与⁵上皮细胞掺。一旦有足够的拆除，非上皮细胞的上皮细胞接种于Transwell小涂人胎盘胶原蛋白⁵的过滤器。媒体扩散，通过从下面的Transwell小。文化是培养24-48小时，然后删除根尖媒体。 体外培养，然后成长为5-8天，形成一个全面，完整的草坪Transwell小过滤器。 体外培养，可以保持在这种状态下viably至4个星期。卡通⁵显示了一个完全成长的体外培养与从插入和染色与造血删除一个过滤器的一个例子的代表性xylin和伊红（H＆E） 证明体内上皮细胞的极性和架构。

图2。明场显微镜的FT 体外培养。Transwell小插入涂人胎盘胶原0.4μm毛孔可见（一）。金融时报上皮细胞培养的胶原蛋白涂层刀片（B），在那里形成的上皮细胞层（C）。坚持细胞在上皮文化（用箭头表示），最常见的纤毛细胞，通常是观察到一些碎片。

图3。金融时报前体外培养免疫荧光（IF）。如果固定体外培养的图像，并与抗体染色对（A）分泌（Pax8）和（D）纤毛细胞（Sall2）标记。 DAPI是用来作为细胞核（蓝色）的位置（B和E）和合并后的抗体和DAPI染色也显示（C和F）的控制。细胞的数量取决于细胞培养（Pax8染色，7天; Sall2染色，3天）的时间长度。

讨论

“金融时报”作为SOC的原产地标识候选网站旨在破译连接已知的危险因素和实际的浆液性致癌过程的机制的基础和转化研究提供了机会。这个关键是听话的模型系统的发展，使我们开始测试的假设FTSEC是一个盆腔浆液性癌的细胞的原产地。此处所述的体外培养模型是一种新型的系统允许的方式，在保留本地金融时报“上皮细胞的形态和生物学的主要金融时报”的分泌和纤毛细胞的分离和文化合作。使用这个系统，我们最近的特点secretome本上皮上皮细胞如何响应机械和遗传毒性损伤^10。排卵与卵巢肿瘤发生有关的主要危险因素，其特点是结合组织损伤，炎症介质，生长因子和激素^11。该系统可用于研究的分泌和纤毛细胞的反应和生存能力的影响排卵环境。此外，其他类型的细胞（即炎症细胞）的影响，可以检查，以便更好地了解一个事件驱动型细胞分化和促进这些细胞的恶性转化的因素。类似的模型已被极化上皮细胞是目前在其他组织。例如，在呼吸道上皮细胞极化小学文化，对细胞生长和细胞损伤的效果^，heregulin评估12。这些类型的模型系统研究的启动和从上皮组织产生的肿瘤的发病机制提供了一个新的和有用的方式，这是至关重要的组织中，如无细胞系目前存在的“金融时报，那里是一个伟大的需要确定的主要途径和发展新的治疗策略。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)	Sigma-Aldrich	C7521
DMEM:F12 media	Cellgro	15-090-CV
Ultroser G	Crescent Chemical Company	67042	Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)
Pen Strep	Invitrogen	15140-122
BD Primaria culture plates	BD Biosciences	353802
24 well Transwell Permeable supports	Corning	3470	Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester
MEM (Minimal Essential Media)	Cellgro	10-010-CV
Pronase	Roche Group	11459643001
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
Sall2 antibody	Harvard - T. Benjamin Lab	Gift	1:20 dilution
Pax8 antibody	Proteintech	10336-1-AP	1: 1000 dilution