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输卵管(FT)是一种新兴的原产地为浆液性卵巢癌(SOC)的另一幅土地。本协议描述了一种新方法和隔离体外文化输卵管上皮细胞。此系统概括了在体内上皮和允许SOC的发病机制的研究。
上皮性卵巢癌是女性癌症死亡率在美国的首要原因。相比之下其他女性特定癌症,如乳腺癌和子宫癌,死亡率在最近几年下降,卵巢癌的治愈率保持相对不变,在过去二十年 1 。这主要是由于缺乏适当的筛检工具,用于检测疾病早期手术和化疗是最有效的2, 3。因此,大多数患者目前晚期疾病和弥漫性腹部参与。这是进一步复杂化的事实,卵巢癌是一种异质性疾病与多个组织学亚型4,5。浆液性卵巢癌(SOC)是最常见的和积极的亚型,并与BRCA基因突变有关的最常见的形式。目前的实验模型,在这一领域涉及肿瘤细胞株和小鼠模型的使用,以便更好地了解发起的遗传事件和发病机制的疾病6,7。近日,作为SOC的起源小说网站,已经出现输卵管输卵管(FT)的分泌上皮细胞(FTSEC)作为建议的起源8,9细胞。目前没有任何细胞系或文化系统研究"金融时报上皮或FTSEC。在这里,我们描述了一种新型的体外培养系统,其中首要人权FT上皮细胞培养的方式,可以保留他们的体系结构,极性,免疫,生理和遗传毒性应激。这种体外模型SOC的研究提供了一个有用的工具,允许更好地了解如何从这个组织的肿瘤可以产生,并参与肿瘤启动和进展的机制。
1。胶原蛋白的制备和筛选涂层。
2。组织收集和分离。
3。输卵管电镀。
4。膜处理。
5。代表性的成果:
Transwell小过滤器可以很容易地清除到体外上皮细胞免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)的研究。谱系特异性标志物的使用,可以形象和量化的分泌(Pax8正)和纤毛(Sall2阳性)细胞,在这些文化室(图3)。此外,使用这些标记,可以监控不同的细胞类型如何响应不同的生理线索 10 。该系统已用于表征secretome的FT上皮细胞内磷酸化的变化,在各种刺激的反应。
图1。插图描绘体外文化是如何从初级人类输卵管组织的产生 。输卵管菌毛组织是从手术套房和肉末产生小片段 1,洗净,与解离媒体孵育24-72 小时 2 。解离完成后,组织碎片是可以解决的潜伏期管的底部,并含有游离的上皮细胞的媒体 ,收获3。离解效率可以监视通过考试,下一个相衬显微镜 4 。游离的上皮细胞,然后培养Primaria板,以帮助消除成纤维细胞和造血干细胞,无不与5上皮细胞掺。一旦有足够的拆除,非上皮细胞的上皮细胞接种于Transwell小涂人胎盘胶原蛋白5的过滤器。媒体扩散,通过从下面的Transwell小。文化是培养24-48小时,然后删除根尖媒体。 体外培养,然后成长为5-8天,形成一个全面,完整的草坪Transwell小过滤器。 体外培养,可以保持在这种状态下viably至4个星期。卡通5显示了一个完全成长的体外培养与从插入和染色与造血删除一个过滤器的一个例子的代表性xylin和伊红(H&E) 证明体内上皮细胞的极性和架构。
图2。明场显微镜的FT 体外培养。Transwell小插入涂人胎盘胶原0.4μm毛孔可见(一)。金融时报上皮细胞培养的胶原蛋白涂层刀片(B),在那里形成的上皮细胞层(C)。坚持细胞在上皮文化(用箭头表示),最常见的纤毛细胞,通常是观察到一些碎片。
图3。金融时报前体外培养免疫荧光(IF)。如果固定体外培养的图像,并与抗体染色对(A)分泌(Pax8)和(D)纤毛细胞(Sall2)标记。 DAPI是用来作为细胞核(蓝色)的位置(B和E)和合并后的抗体和DAPI染色也显示(C和F)的控制。细胞的数量取决于细胞培养(Pax8染色,7天; Sall2染色,3天)的时间长度。
"金融时报"作为SOC的原产地标识候选网站旨在破译连接已知的危险因素和实际的浆液性致癌过程的机制的基础和转化研究提供了机会。这个关键是听话的模型系统的发展,使我们开始测试的假设FTSEC是一个盆腔浆液性癌的细胞的原产地。此处所述的体外培养模型是一种新型的系统允许的方式,在保留本地金融时报"上皮细胞的形态和生物学的主要金融时报"的分泌和纤毛细胞的分离和文化合作。使用这个系统,我们最近的特点secretome本上皮上皮细胞如何响应机械和遗传毒性损伤10。排卵与卵巢肿瘤发生有关的主要危险因素,其特点是结合组织损伤,炎症介质,生长因子和激素11。该系统可用于研究的分泌和纤毛细胞的反应和生存能力的影响排卵环境。此外,其他类型的细胞(即炎症细胞)的影响,可以检查,以便更好地了解一个事件驱动型细胞分化和促进这些细胞的恶性转化的因素。类似的模型已被极化上皮细胞是目前在其他组织。例如,在呼吸道上皮细胞极化小学文化,对细胞生长和细胞损伤的效果,heregulin评估12。这些类型的模型系统研究的启动和从上皮组织产生的肿瘤的发病机制提供了一个新的和有用的方式,这是至关重要的组织中,如无细胞系目前存在的"金融时报,那里是一个伟大的需要确定的主要途径和发展新的治疗策略。
我们感谢教师,研究员,居民和布里格姆与妇女医院的助理医师,病理科组织为这些研究提供。这项工作是支持由美国国立卫生研究院/国立癌症研究所(P50,U01,K08 CA108748 CA105009 CA152990),卵巢癌研究基金,研究资助的5月凯基金会,诺华制药,罗伯特和Deborah第一基金,兰迪和乔尔卡特勒卵巢癌研究基金,玛莎里夫金先生基金会 - 科学学者奖,美国癌症研究学会 - 乔治和帕特里夏Sehl癌症遗传学研究奖学金,并在以色列的美国医学医师奖学金 - 克莱尔和Emmanuel G.罗森布拉特基金会的资助。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Name | Company | Catalog Number | Comments | |
Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV) | Sigma | C7521 | ||
DMEM:F12 media | Cellgro | 15-090-CV | ||
Ultroser G | Crescent Chemical Company | 67042 | Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration) | |
Pen Strep | Invitrogen | 15140-122 | ||
BD Primaria culture plates | BD Bioscience | 353802 | ||
24 well Transwell Permeable supports | Corning (Costar) | 3470 | Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester | |
MEM (Minimal Essential Media) | Cellgro | 10-010-CV | ||
Pronase | Roche | 11459643001 | ||
DNAse | Sigma | DN25 | ||
Sall2 antibody | Dr T. Benjamin, Harvard | Gift | 1:20 dilution | |
Pax8 antibody | Proteintech | 10336-1-AP | 1: 1000 dilution |
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