Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

Özet

Fallop tüpü (FT), seröz over kanseri (SOC) kökenli bir alternatif site olarak ortaya çıkmaktadır. Bu protokol izolasyon için yeni bir yöntem açıklanır ve Ex vivo Fallop tüpü epitel hücreleri kültür. Bu sistem özetlediği In vivo Epitel ve SOC patogenezinde çalışma sağlar.

Özet

Epitelyal over kanseri, Amerika Birleşik Devletleri'nde kadın kanser ölümlerinin önde gelen nedenidir. Diğer kadınlara özgü kanserlerin aksine, meme ve rahim karsinom, ölüm oranlarının son yıllarda düşmüş gibi, yumurtalık kanseri kür oranları, son iki ^yıldır 1 üzerinde nispeten değişmeden kalmıştır . Bu ameliyat ve ^{kemoterapi, 3,} 2 en etkili erken evre hastalık tespiti için uygun tarama araçları eksikliği büyük ölçüde . Sonuç olarak, hastaların çoğu ileri evre hastalık ve karın bölgesine yayılmış katılımı ile mevcut. Bu, yumurtalık kanseri çok sayıda ^{histolojik alt 4,} 5 ile heterojen bir hastalık olduğu gerçeğini daha karmaşıktır. Seröz over kanseri (SOC), en sık görülen ve agresif tür ve en sık BRCA genleri mutasyonları ile ilişkili form . Bu alandaki deneysel modeller başlatan genetik olaylar ve ^{6, 7} hastalığı patogenezinde daha iyi anlamak için, kanser hücre hatları ve fare modelleri kullanımı dahil. Son zamanlarda, fallop ^{tüplerinde, 8,} 9 kökenli önerilen hücre olarak fallop tüpü (FT) salgı epitel hücresi (FTSEC), SOC kökeni için yeni bir site olarak ortaya çıkmıştır . Henüz hiçbir hücre hatları veya FT epitel veya FTSEC çalışma kültürü sistemleri vardır. Burada birincil insan FT epitel hücreleri, mimarisi, polarizasyon, immünfenotip ve fizyolojik ve genotoksik streslerinin yanıt koruyan bir şekilde kültüre bir roman ex vivo kültür sistemi açıklanmaktadır . Bu ex vivo modeli SOC çalışma için bu doku tümörleri ortaya nasıl daha iyi bir anlayış sağlayan, kullanışlı bir araç sağlar ve mekanizmaları tümör başlangıcında ve ilerlemesinde yer.

Protokol

1. Kollajen hazırlanması ve Filtre Kaplama.

1. Human plasental kollajen hazırlamak için 30 mg, human plasental kollajen Tweeze ve heyecan bar ile 500 ml beher 50 ml distile su (dH ₂ O) üst üste koymak.
2. Daha kolay çözülür hale getirmek için doğrudan kollajen üzerine 100 μls buzul asetik asit ekleyin. Sıcak - 37 ° C ve kollajen erimesi için karıştırın. 20-30 dakika içinde çözülür. Kolajen iplikçikleri çözüm kalırsa, filtre sterilizasyonu zor olacaktır.
3. DH ₂ O ve 0,2 mikron membran filtre ile sterilize 450 ml, 50 ml stok sulandırınız. Bu son çalışma çözümdür. 4 ° C saklayınız
4. Transwell filtre membranlar kolajen (50-100 ul) gece boyu kaplama onları hazırlayın. Soğuk kollajen RT ısındı ve daha sonra bir gecede ve RT membran kapsayacak şekilde üst bölmesi eklenmesi gerekir. Ayrışmış primer fallop tüpü (FT) epitel (aşağıya bakın) transwell filtreleri üzerine kaplama önce üç kez 1X fosfat Aşırı kollajen kaldırmak için kullanmadan önce tuzlu su (PBS) en az 1 saat tamponlu filtreler yıkayın.

2. Doku Toplama ve Ayrılma.

1. Taze fallop tüpü (FT) fimbria 50 ml santrifüj tüpüne steril 1X PBS içinde toplanır ve steril doku kültürü kaputu işleme istemi için önce buz üzerinde tutulmalıdır olmalıdır.
2. (Örnek toplanan veya başka bir medya türü en azından mümkün olduğu kadar çok kan ve yabancı medya olarak bu kaplama verimliliği ile etkileşebilir kurtulmak için 3X kanlı yıkama varsa) bir kez 20 ml soğutulmuş 1X PBS doku örneği yıkayın.
3. Steril neşter ve steril bir cımbız kullanarak, küçük bir PBS ve 10 cm doku kültürü çanak, steril bir cımbız transferi FT kullanarak, epitel hücrelerinin maruz kalma en üst düzeye çıkarmak için uzunlamasına kesilir. Artık bir tüp değil, neredeyse düz bir levha doku böylece fimbria açın. Sonra daha küçük ama daha hala geri adet (yaklaşık 3 mm çapında) oyulmuş.
4. 45 ml (1.4 mg / ml Pronase ve 0.1 mg / ml DNAz içeren MEM) 50 ml'lik bir tüp içinde soğutulmuş disosiasyon medya adet aktarın.
5. 4 ° C 24 ila 72 saat için hafifçe sallayın. (48 saat deneyimlerinden, en uygunudur). Bir slaytta disosiasyon medya bir damla koymak, disosiasyon miktarını kontrol edin ve topaklanma ve doku canlılığı (tüycüklü hücreleri yenerek) miktarını kontrol etmek için. Tek hücreler ve bazı küçük öbekler hem de görmek istiyorum.

3. Fallop Tüp Kaplama.

1. Epitel hücre ayrılma miktarı optimum olduğunda, FBS% 10 hacmi ekleyerek medya inaktive. Küçük agrega içine hücre süspansiyonu çıkarmak için birkaç kez ters çevirin.
2. Büyük doku kümeleri (stromal doku) alt tüp yerleşmek için izin verin. İkinci bir 50 ml'lik tüp içine epitel hücreleri içeren ortamları çıkarın.
3. Orijinal 50 ml tüp 50 ml soğuk MEM (FBS) ekleyin. Ek hücreleri toplamak için ters çevirin. Üçüncü bir 50 ml tüp (örnek çok büyük ve yüksek hücre sayısı beklenen ise, bu adımı hücre toplama maksimize etmek için tekrar edilebilir) içine medya toplayın. Stromal / ekstraselüler doku büyük parça şimdi iptal edilebilir. Artık iki hücre süspansiyonu 50 ml tüpler var. Hücre pelletleri 5 dakika aspirat disosiasyon medya için 1000 rpm'de santrifüjleyin.
4. 37 ° C'ye kadar ısındı USG medya (DMEM:% 2 USG ve% 1 Kalem Strep ile desteklenmiş F12) yaklaşık 5-10 ml içinde süspanse edin Yavaşça Pipet. Bu epitel hücrelerinde hasar ve kültürlerin kalitesini azaltabilir gibi çok güçlü bir şekilde pipetle için dikkatli olun. Tek hücre ve küçük öbekler (Şekil 1) olmalıdır.
5. En az 1 saat veya 3 saat kadar primaria kültür yemekleri ve inkübe üzerine aktarın. Fibroblastlar ve kırmızı kan hücreleri, plastik sopa ama FT epitel hücreleri olmaz. Plakasına şey yapışmasını olup olmadığını görmek için bir saat sonra bir göz atın. Siliyalı hücrelerinin varlığı kirpikler dayak belirterek tarafından görülebilir.
6. Bu İnkübasyon sırasında, kollajen kaplı filtreler (adım 1.4 'e bakınız) yıkanmış ve hücre kaplama için hazır.
7. Primaria plakaları inkübasyon süresi 1-3 saat sonra, 15 ml tüp hücre süspansiyonu transferi ve durulama 5 ml USG medya ile primaria plaka, 15 ml nihai hacmi oluşturmak için bu medya tüp transferi. 1000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
8. Dikkatlice aspire medya ve hücre pelletini bozmamak. Pelet boyutu tarafından bakılırsa, USG medya uygun miktarda tekrar süspansiyon haline getirin. Eğer gerekiyorsa daha sulandırmak böylece (Genellikle 1-3 ml arasında) Eksi başında daha iyidir. Yavaşça tekrar
9. Bir hemasitometre 10 ul yeniden süspanse hücre ve hücre yoğunluğu belirlemek. İpuçları: belirgin bir karanlık hücre zarı ve non-kolumnar epitel hücreleri arıyoruz. Ayrıca kesinlikle hareket tüycüklü hücreleri saymak. Halo appearan daha küçük hücrelerce, kırmızı kan hücreleri ve sayılmamalıdır. Orada bazı topaklanma, böylece hücre sayısı tahmin etmek gerekir. Tohumlama hedef 1,65 x10 ⁵ hücre / membran, ya da en azından% 75 oranında filtre kapsama alanı (Şekil 1 ). Hücreleri çok seyrek kaplama varsa, hücreler tam bir epitel tabakası oluşturmak mümkün olmayacaktır.
10. USG medya ul 500 24 plaka iyi alt ve transwell eklemek. FT hücre süspansiyonu (yukarıya bakınız) gerekli olan hacim sonra her membran üzerine eklenebilir, bu genellikle 100 ul.
11. Inkübasyon ve membran rahatsız üst olmadan 1-2 gün büyümeye. Gerekirse bu gün boyunca bazal tarafında medya değiştirebilirsiniz. 1-2 gün sonra, USG medya ile üst dikkatlice yıkayın ve medya membran üstüne küçük bir miktar (50-100 ul). Bu medya, mikroskobu önce filtreler apikal tarafında kaldırılırsa, hücre kültürlerinin birleştiği belirlemek için daha kolaydır. Alt bölmesi, her zaman medya içermelidir. Bir kez kültürler tam konfluent (normalde 5 gün içinde), apikal taraf için bazal filtreler aracılığıyla yolculuk medya miktarı ihmal edilebilir olmalıdır.
12. Ilk 10 gün boyunca her iki günde bir kez bazal medya değiştirin. Alt bölmesi, her zaman hücrenin hayatta tutmak için medya sahip olması gerekir. Immünofloresan (IF) veya immünhistokimyasal (İHK) gibi daha ileri çalışmalar, kullanılabilir sıkı bir epitel tabakası (Şekil 1 ve 2) hücreleri oluşturdular.

4. Membran İşleme.

1. Membran işlem yapılacaktır çalışmanın türüne bağlıdır, ancak genellikle transwell ekler filtre ayrılmasını gerektirir.
2. Bu filtreler genellikle 1X PBS 200 ul çıkarmadan önce 3 kez yıkanır.
3. Filtrelerin apikal ve bazal tarafındaki PBS aspire. Bu membranlar kurumasını önlemek için bir kerede 1 yapılmalıdır.
4. Plaka eklemek çıkarın, ters çevirin ve membran etrafında kesmek için steril bir neşter kullanabilirsiniz. Tek parça membran yerine kenarında neşter sürükleyerek membran kenarı etrafında düz kesimler yaparak kaldırmayı deneyin.
5. Parça hücrelerin hangi tarafta, tutarak, ekleme filtreyi kaldırmak için cımbız kullanın. Filtre, sonra uygun şekilde VARSA, İHK, vb işlenebilir.
6. Örnek: çalışmaları, filtre (uygun antikorlar ile fiksasyon, permeabilization, engelleme ve inkübasyon sonra, standart prosedürler EĞER göre) bir slaytta yer olmalıdır EĞER DAPI, Vectashield UP karşı karşıya hücrelerin filtre üzerine bırakılır ve bir kapalı cam lamel.

5. Temsilcisi Sonuçlar:

Transwell filtreleri kolayca immünhistokimyasal (İHK) ve immünofloresan (IF), hem de ex vivo epiteli incelemek için silinebilir. Spesifik belirteçler soyundan kullanarak, bir resim ve sekretuar (Pax8 pozitif) ve siliyalı bu kültürlerin (Sall2 pozitif) hücre bölme (Şekil 3) ölçmek. Ayrıca, bu belirteçler kullanarak, her bir hücre ^tipi, 10 farklı fizyolojik ipuçları nasıl tepki vereceğini izleyebilirsiniz. Bu sistem, çeşitli uyaranlara yanıt olarak, FT epitelin secretome ve hücre içi phosphoproteome değişiklikleri karakterize etmek için kullanılmaktadır.

Şekil 1. İllüstrasyon, birincil insan fallop tüpü dokusundan üretilen nasıl ex vivo kültürler resmeden Fallop tüpü fimbrial doku cerrahi seti elde edilen ve 24-72 ^saat 2 disosiasyon medya ile yıkanır ve inkübe küçük ^parçalar 1 oluşturmak için kıyılmış . Disosiasyon tamamlandıktan sonra, doku parçalarının ³ hasat kuluçka tüpün alt ve ayrışmış epitel hücreleri içeren medya yerleşmek için izin verilir. Disosiasyon, verimlilik, faz kontrast ^mikroskop 4 altında incelenmesi ile izlenebilir . Ayrışmış epitel hücreleri daha sonra primaria plakaları kültüre fibroblast ve değişmez epitel ^hücreleri 5 Karıştım hematopoetik hücreler kaldırmanıza yardımcı . Olmayan epitel hücreleri yeterince kaldırıldıktan sonra, epitel hücreleri transwell human plasental kollajen ⁵ ile kaplı filtreler üzerine numaralı seribaşı. Medya alttan transwell aracılığıyla difüzyon ile sağlanır. Kültürler 24-48 saat inkübe edilir ve daha sonra apikal medya kaldırılır. Ex vivo kültürleri sonra transwell filtreler oluşturmak için 5-8 gün için tam, tam çim büyümeye izin verilir. 4 hafta kadar ex vivo kültürleri bu durumda viably korunabilir. Karikatür ⁵ hemato ekleme ve vitray kaldırılır bir filtre bir örneği ile tam olarak yetiştirilen ex vivo kültür gösterirxylin ve eosin (H & E) ex vivo epitelin polarite ve mimari göstermek için.

Şekil 2. FT ex vivo kültürlerin Parlak alan mikroskobu transwell ekler human plasental kollajen 0.4μm gözenekleri ile kaplı (a) görünür. FT epitel hücreleri (c) bir epitel tabakası oluşturan kollajen kaplı ekler (b), kültür. Bazı enkaz normalde tüycüklü hücreleri en sık epitel kültür hücreleri (oklarla gösterilen) bağlı kalarak görülmektedir.

Şekil 3. FT ex vivo kültür immünofloresan (IF). Ex vivo kültürleri görüntülerini sabit ve (a) salgı (Pax8) karşı antikorlar ile boyandı ve (d) siliyalı hücre (Sall2) işaretleyicileri EĞER. DAPI hücre çekirdeğinin konumunu (mavi) (b) ve (e) ve birleştirilmiş antikor ve DAPI boyama da gösterilmiştir (c ve f) için bir kontrol olarak kullanılır. Sayıda hücre kültür hücreleri (Sall2 boyama, 3 gün Pax8 boyama, 7 gün) zaman uzunluğuna bağlıdır.

Tartışmalar

FT belirlenmesi SOC için kökenli aday bir site olarak bilinen risk faktörleri ve gerçek seröz kanserojen süreci birbirine bağlayan mekanizmaları deşifre yönelik temel ve translasyonel araştırma için fırsat sağlar. Kritik bu çözülebilir bir model sistemler bize FTSEC pelvik seröz karsinomlarda hücre kökenli olduğu hipotezini test başlamanızı sağlayacak bir gelişmedir. Burada açıklanan ex vivo kültür modeli yerli FT epitel morfoloji ve biyoloji koruyan bir şekilde birincil FT salgı ve siliyalı hücreler izolasyon ve co-kültür izin veren bir roman sistemidir. Bu sistemi kullanarak, son zamanlarda bu epitelin secretome karakterize ve nasıl epiteli mekanik ve genotoksik yaralanma ¹⁰ yanıt. Yumurtlama, yumurtalık tümörogenez ile ilgili önemli bir risk faktörü, doku hasarı, mediyatörlerin, büyüme faktörleri ve hormonlar ¹¹ bir kombinasyonu ile karakterizedir. Bu sistem, salgı ve siliyalı hücreler tepki ve canlılığını ovulatuar bir ortamın etkisini araştırmak için kullanılabilir. Sürücü tipi hücre farklılaşması ve bu hücrelerin neoplastik dönüşüme katkıda bulunan faktörlerin yanı sıra, diğer hücre tipleri (yani inflamatuar hücreler) etkisi, olayların daha iyi anlaşılmasına izin incelenebilir. Benzer modeller polarize epitel mevcut olduğu diğer dokularda da tarif edilmiştir. Örneğin, epitel polarize primer kültürlerinde, hücre büyümesi ve hücre hasarına yanıt heregulin etkisi ¹² değerlendirildi. Model sistemler bu tür yeni ve yararlı bir şekilde başlatılması ve epitel dokuların kaynaklanan tümörlerin patogenezi çalışma sağlamak ve bu dokularda hücre hatları var FT gibi kritik öneme sahip, ve büyük bir yerde var. anahtar yollarının belirlenmesi ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için gerekli.

Malzemeler

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)		Sigma	C7521
DMEM:F12 media		Cellgro	15-090-CV
Ultroser G		Crescent Chemical Company	67042	Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)
Pen Strep		Invitrogen	15140-122
BD Primaria culture plates		BD Bioscience	353802
24 well Transwell Permeable supports		Corning (Costar)	3470	Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester
MEM (Minimal Essential Media)		Cellgro	10-010-CV
Pronase		Roche	11459643001
DNAse		Sigma	DN25
Sall2 antibody		Dr T. Benjamin, Harvard	Gift	1:20 dilution
Pax8 antibody		Proteintech	10336-1-AP	1: 1000 dilution