Ex Vivo Cultura de células humanas primarias epiteliales del tubo de Falopio

Resumen

La trompa de Falopio (FT) se está convirtiendo en un sitio alternativo de origen para el carcinoma de ovario seroso (SOC). Este protocolo describe un nuevo método para el aislamiento y Ex vivo Cultivo de células epiteliales del tubo de Falopio. Este recapitula el sistema In vivo y permite el estudio de la patogénesis del SOC.

Resumen

Cáncer epitelial de ovario es la principal causa de mortalidad por cáncer de mujeres en los Estados Unidos. A diferencia de otros específicos para las mujeres el cáncer, como carcinomas de mama y útero, donde las tasas de mortalidad han disminuido en los últimos años, las tasas de curación del cáncer de ovario se han mantenido relativamente sin cambios durante las últimas dos décadas ^1. Esto se debe principalmente a la falta de herramientas de evaluación adecuadas para la detección de la enfermedad en etapa temprana, cuando la cirugía y la quimioterapia son más eficaces ^{2, 3.} Como resultado, la mayoría de los pacientes se presentan con enfermedad en estadio avanzado y la participación abdominal difuso. Esto se complica aún más por el hecho de que el cáncer de ovario es una enfermedad heterogénea con múltiples subtipos histológicos ^{4, 5.} El carcinoma de ovario seroso (SOC) es el subtipo más común y agresiva y la forma más frecuentemente asociada con mutaciones en los genes BRCA. Los actuales modelos experimentales en este campo incluyen el uso de líneas celulares de cáncer y los modelos de ratón para comprender mejor los sucesos iniciadores genética y la patogénesis de la enfermedad de ^{6, 7.} Recientemente, la trompa de Falopio se ha convertido en un nuevo sitio para el origen del SOC, con la trompa de Falopio (FT) de células epiteliales secretoras (FTSEC) como la célula de origen propuesta ^{8, 9.} Actualmente no hay líneas celulares o sistemas de cultivo disponible para estudiar el epitelio FT o la FTSEC. Aquí se describe una nueva ex vivo sistema de cultivo en células primarias de FT epiteliales humanas se cultivan de manera que conserve su arquitectura, la polaridad, inmunofenotipo, y la respuesta al estrés fisiológico y genotóxicos. Este modelo ex vivo es una herramienta útil para el estudio del SOC, lo que permite una mejor comprensión de cómo los tumores pueden surgir de este tejido, y los mecanismos implicados en la iniciación y progresión del tumor.

Protocolo

1. Preparación de colágeno y de revestimiento de filtro.

1. Para preparar el colágeno de placenta humana, pinzas de 30 mg de colágeno de placenta humana y poner encima de 50 ml de agua destilada (dH ₂ O) en un vaso de 500 ml con barra de agitación.
2. Añadir 100 μls de ácido acético glacial directamente en el colágeno para que sea más fácil de disolver. Calentar a 37 ° C y se remueve para disolver el colágeno. Se debe disolver en 20-30 minutos. Si fibras de colágeno permanecen en solución, la esterilización de filtro será difícil.
3. Diluir el stock de 50 ml con 450 ml de dH ₂ O y el filtro a esterilizar con una membrana de 0,2 micras. Esta es la solución final de trabajo. Almacenar a 4 ° C.
4. Preparar membranas Transwell filtro por recubrimiento con colágeno (50-100 l) durante la noche. Colágeno refrigerados debe ser calentado a temperatura ambiente y luego añadió que el compartimiento superior para cubrir la membrana durante la noche y a temperatura ambiente. De las placas, la disociada de tubos primarios de Falopio (FT) epitelio (ver más abajo) en los filtros Transwell, lavar los filtros tres veces en 1X fosfato (PBS) al menos 1 hora antes de su uso para eliminar el exceso de colágeno.

2. Colección de tejidos y disociación.

1. Las trompas de Falopio fresca (FT) fimbria se deben recoger en PBS estéril 1X en un tubo de centrífuga de 50 ml y se mantuvieron en hielo antes de la rápida transformación en una campana de cultivo de tejido estéril.
2. Lavar la muestra de tejido, una vez en 20 ml de PBS 1X frío (si la muestra ha sido recogida en otro tipo de medios de comunicación o se lava con sangre por lo menos 3 veces para deshacerse de tanta sangre y los medios de comunicación extranjeros como sea posible ya que esto podría interferir con la eficiencia de plaqueo).
3. Utilizando M estéril pinzas para la transferencia de una placa de cultivo de 10 cm de tejido con un poco de PBS y, utilizando un bisturí estéril y pinzas estériles, cortados longitudinalmente para maximizar la exposición de las células epiteliales. Abre la fimbria de modo que ya no es un tubo, pero una hoja casi plana de tejido. Luego se corta en trozos más pequeños, pero todavía recuperables (alrededor de 3 mm de diámetro).
4. Transferencia de las piezas a 45 ml de helado de medios de disociación (MEM que contiene 1,4 mg / ml y 0,1 Pronasa DNAsa mg / ml) en un tubo de 50 ml.
5. Roca suavemente a 4 ° C durante 24 a 72 horas. (A partir de la experiencia, las 48 horas es óptimo). Para comprobar la cantidad de disociación, poner una gota de disociación multimedia en una diapositiva y comprobar la cantidad de aglutinación y la viabilidad del tejido (superando a las células ciliadas). ¿Quieres ver tanto las células individuales y algunos pequeños grupos.

3. Revestimiento de las trompas de Falopio.

1. Cuando el importe de la disociación de las células epiteliales es óptimo, inactivar los medios de comunicación mediante la adición de 10% en volumen de FBS. Invertir varias veces para desalojar a la suspensión de células en pequeños agregados.
2. Permita que los grupos grandes de tejidos (tejido estromal) para instalarse en la parte inferior del tubo. Eliminar los medios de comunicación que contiene las células epiteliales en un tubo de 50 ml segundo.
3. Añadir 50 ml de MEM fría (no FBS) en el tubo original de 50 ml. Invertir para recoger las células adicionales. Recoger los medios de comunicación en un tercer tubo de 50 ml (si la muestra es muy grande y un gran número de células se espera, este paso se puede repetir para maximizar la recolección de las células). Los grandes pedazos de tejido estromal / extracelular pueden ahora ser descartadas. Ahora tiene dos tubos de 50 ml de suspensión celular. Centrifugar a 1000 rpm durante 5 minutos y los medios de comunicación aspirado disociación de gránulos de las células.
4. Resuspender en unos 5-10 ml de gobierno de Estados Unidos los medios de comunicación (DMEM: F12 suplementado con 2% y 1% de USG pluma estreptocócica) calentado a 37 ° C. Pipeta suavemente. Tenga cuidado de no pipetear con demasiada fuerza ya que podría dañar las células epiteliales y reducir la calidad de las culturas. No debe haber células individuales y pequeños grupos (Figura 1).
5. Transferencia en placas de cultivo Primaria e incubar por un mínimo de 1 hora o hasta 3 horas. Fibroblastos y las células rojas de la sangre se adhiere a la plástica, pero las células epiteliales de FT no. Echa un vistazo a la placa después de una hora para ver si hay algo que se pegue. La presencia de células ciliadas se puede ver observando el latido de los cilios.
6. Durante la incubación, los filtros de colágeno recubiertas pueden ser lavadas y listas para la siembra de células (véase el paso 1.4)
7. Después de 1-3 horas de incubación en las placas de Primaria, la transferencia de la suspensión de células a un tubo de 15 ml y enjuagar la placa de Primaria con 5 ml de medio USG, la transferencia de este medio en el tubo para hacer un volumen final de 15 ml. Centrifugar a 1000 rpm durante 5 minutos.
8. Con cuidado aspirar los medios de comunicación y de no perturbar el sedimento celular. A juzgar por el tamaño de las pastillas, resuspender en la cantidad adecuada de gobierno de Estados Unidos los medios de comunicación. (Generalmente entre 1-3 ml) Menos es mejor en el inicio para que pueda diluir aún más si es necesario. Resuspender suavemente.
9. Añadir 10 l de las células se resuspendieron en un hemocitómetro y determinar la densidad celular. Sugerencias: Usted está en busca de células epiteliales que tienen una membrana celular claramente oscura y no en columnas. También puede contar con las células ciliadas que son definitivamente en movimiento. Células más pequeñas que tienen un halo de appearance son los glóbulos rojos y no deben ser contados. Habrá algo de aglomeración, por lo que necesita para estimar que en el recuento de células que. El objetivo de la siembra es de 1,65 x10 ⁵ células / membrana, o por lo menos 75% de cobertura del filtro (Figura 1). Si las células son colocadas demasiado poco, las células no será capaz de formar una capa epitelial completa.
10. Añadir 500 l de los medios de comunicación gobierno de Estados Unidos a la parte inferior del pozo de una placa y 24 e insertar Transwell. El volumen requerido de la suspensión celular FT (ver arriba) se puede añadir a cada membrana, esto es normalmente 100 microlitros.
11. Incubar y crecer durante 1-2 días, sin molestar arriba de la membrana. Puede cambiar los medios de comunicación en la parte basal durante esos días si es necesario. Después de 1-2 días, usted puede enjuagar cuidadosamente la parte superior con el gobierno de Estados Unidos los medios de comunicación y agregar una pequeña cantidad (50 a 100 l) de los medios de comunicación en la parte superior de la membrana. Es más fácil determinar la confluencia de los cultivos celulares, si los medios de comunicación se retira de la parte apical de los filtros antes de microscopía. El compartimento inferior debe contener siempre los medios de comunicación. Una vez que las culturas son totalmente confluente (normalmente dentro de los 5 días), la cantidad de medios de comunicación que viaja a través de los filtros de la basal al lado apical debería ser insignificante.
12. Cambiar el medio basal una vez cada dos días durante los primeros 10 días. El compartimento inferior siempre debe tener los medios para mantener las células vivas. Una vez que las células han formado una capa apretada epitelial (Figuras 1 y 2) pueden ser utilizados en otros estudios, como la inmunofluorescencia (IF) o inmunohistoquímica (IHC).

4. Procesamiento de la membrana.

1. Procesamiento de la membrana depende del tipo de estudio que se llevará a cabo, pero por lo general consiste en la extracción del filtro de los insertos Transwell.
2. Los filtros suelen ser lavadas 3 veces en 200 l de 1X PBS antes de la extracción.
3. Aspirar PBS de un lado apical y basal de los filtros. Esto se debe hacer un bien a la vez para evitar que las membranas de la desecación.
4. Extraiga la tapa de la placa, dar la vuelta al revés y el uso de un bisturí estéril para cortar alrededor de la membrana. Trate de eliminar la membrana de una sola pieza mediante cortes rectos en todo el borde de la membrana, en lugar de arrastrar el bisturí en el borde.
5. Utilizar pinzas para quitar el filtro de la inserción, el seguimiento de qué lado se encuentran en las células. El filtro puede ser procesada por IF, IHC, etc, según corresponda.
6. Ejemplo: Si los estudios para el filtro (después de la fijación, la permeabilización, el bloqueo y la incubación con los anticuerpos adecuados, según la norma SI procedimientos) se debe colocar en una diapositiva, las células hacia arriba, Vectashield con DAPI se deja caer sobre el filtro y la cubierta con una vidrio cubreobjetos.

5. Los resultados representativos:

Los filtros Transwell puede ser fácilmente removido para examinar el epitelio ex vivo tanto por inmunohistoquímica (IHC) e inmunofluorescencia (IF). Utilizando marcadores específicos del linaje, se puede cuantificar la imagen y la secreción (PAX8 positivo) y ciliados (Sall2 positivo) compartimentos celulares en estas culturas (Figura 3). Además, el uso de estos marcadores, se puede controlar cómo cada tipo de célula responde a diferentes señales fisiológicas ^10. Este sistema se ha utilizado para caracterizar los cambios en la phosphoproteome secretoma e intracelular del epitelio de FT en respuesta a diversos estímulos.

Figura 1. Ilustración que muestra cómo las culturas ex vivo se generan a partir de tejido humano primario trompa de Falopio. Tejido del tubo de Falopio fimbrial se obtiene de la sala de operaciones y picado para generar fragmentos pequeños de ^una que se lavan y se incuban con la disociación medios de comunicación durante 24-72 horas ^2. Después de la disociación es completa, los fragmentos de tejido se asientan en el fondo del tubo de incubación y los medios de comunicación que contiene las células epiteliales disociada se cosecha ^3. La eficiencia de la disociación se puede controlar mediante el examen bajo un microscopio de ⁴ de contraste de fase. Las células epiteliales se disocia entonces cultivadas en placas de Primaria para ayudar a eliminar los fibroblastos y las células hematopoyéticas que, invariablemente, mezclado con las células epiteliales ^5. Una vez que las células epiteliales no son eliminadas adecuadamente, las células epiteliales se siembran en Transwell filtros que están recubiertas de colágeno de placenta humana ^5. Los medios de comunicación es proporcionado por la difusión a través de la Transwell desde abajo. Los cultivos se incuban durante 24-48 horas y luego los medios de comunicación apical es removido. Los cultivos ex vivo luego se dejan crecer durante 5-8 días para formar un césped lleno, completo en los filtros Transwell. Los cultivos ex vivo se puede mantener de manera viable en este estado durante un máximo de 4 semanas. La caricatura ⁵ muestra una representación de la cultura vivo totalmente crecido ex con un ejemplo de un filtro elimina de la inserción y teñidas con hematoxylin y eosina (H & E) para demostrar la polaridad y la arquitectura del epitelio ex vivo.

Figura 2. Microscopía de campo claro de FT culturas ex vivo. Inserciones Transwell están cubiertas con la placenta humana poros colágeno 0.4μm son visibles (a). Células epiteliales de FT se cultivan en los insertos de colágeno recubiertas (b), donde forman una capa epitelial (c). Algunos escombros se observa normalmente adherirse a las células epiteliales en la cultura (indicado por las flechas), con más frecuencia a las células ciliadas.

Figura 3. FT ex vivo la cultura de inmunofluorescencia (IF). Ejemplos de si las imágenes de las culturas ex vivo fijadas y teñidas con anticuerpos contra (a) secreción (PAX8) y (d) los marcadores de células ciliadas (Sall2). DAPI se utiliza como un control para la localización de los núcleos de las células (azul) (B y E) y el anticuerpo fusionado y DAPI también se muestra (C y F). El número de las células depende de la cantidad de tiempo que las células están en la cultura (PAX8 tinción, los 7 días; Sall2 manchas, 3 días).

Discusión

La identificación de la FT como un sitio candidato de origen para el SOC ofrece la oportunidad de la investigación básica y translacional orientada a descifrar los mecanismos que vinculan factores de riesgo conocidos y el actual proceso carcinogénico serosa. Crítico de esto es el desarrollo de sistemas modelo manejable que nos permitirá comenzar a probar la hipótesis de que la FTSEC es una célula de origen de la pelvis carcinomas serosos. El modelo in vivo la cultura ex descritos en este documento es un novedoso sistema que permite el aislamiento y la co-cultura de la secreción FT primario y las células ciliadas de una manera que preserva la morfología y la biología del epitelio FT nativo. El uso de este sistema, caracterizado recientemente secretoma de este epitelio y la forma en que el epitelio responde a daños mecánicos y genotóxico ^10. La ovulación, un factor de riesgo más importantes asociados con la tumorigénesis de ovario, se caracteriza por una combinación de lesión de los tejidos, los mediadores inflamatorios, factores de crecimiento y hormonas ^11. Este sistema podría ser utilizado para estudiar el efecto de un medio de ovulación en la respuesta y la viabilidad de las células ciliadas y secretoras. Además, el impacto de otros tipos de células (es decir, células inflamatorias) podría ser examinado para permitir una mejor comprensión de los acontecimientos que conducen a la celda de tipo de diferenciación y los factores que contribuyen a la transformación neoplásica de estas células. Modelos similares han sido descritos en otros tejidos en el epitelio polarizado está presente. Por ejemplo, en el polarizado cultivos primarios de epitelio de las vías, el efecto de herregulina sobre el crecimiento celular y la respuesta al daño celular se evaluó ^12. Estos tipos de sistemas de modelos proporcionan una manera nueva y útil para estudiar el inicio y la patogénesis de los tumores que se derivan de los tejidos epiteliales, y esto es de vital importancia en los tejidos, como el Financial Times, donde no hay líneas de células existen en la actualidad, y donde hay una gran necesidad de la identificación de las principales vías y el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)	Sigma-Aldrich	C7521
DMEM:F12 media	Cellgro	15-090-CV
Ultroser G	Crescent Chemical Company	67042	Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)
Pen Strep	Invitrogen	15140-122
BD Primaria culture plates	BD Biosciences	353802
24 well Transwell Permeable supports	Corning	3470	Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester
MEM (Minimal Essential Media)	Cellgro	10-010-CV
Pronase	Roche Group	11459643001
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
Sall2 antibody	Harvard - T. Benjamin Lab	Gift	1:20 dilution
Pax8 antibody	Proteintech	10336-1-AP	1: 1000 dilution