عزل الخلايا الجذعية الأنف الشم من القوارض أو البشر

Summary

نحن هنا تصف طريقة لbiopsying المخاطية الشمية من الفئران والجيوب الأنفية الإنسان. ويمكن استخدام هذه الخزعات إما لتحديد الحالات الشاذة الجزيئية في الدماغ أو أمراض multipotent عزل الخلايا الجذعية التي يمكن استخدامها لزرع الخلايا في النماذج الحيوانية من الصدمة الدماغ / المرض.

Abstract

الغشاء المخاطي الشمي ، وتقع في تجويف الأنف ، هو المسؤول عن كشف الروائح. بل هو أيضا النسيج العصبي الوحيد الذي يتعرض إلى البيئة الخارجية ، ويمكن الوصول إليها بسهولة في كل فرد المعيشة. نتيجة لذلك ، هذا النسيج هي فريدة من نوعها لأحد تهدف الى تحديد الحالات الشاذة الجزيئية في الدماغ المرضية أو عزل الخلايا الجذعية البالغة لعلاج الخلايا.

غالبا ما تتم دراسة حالة شذوذ الجزيئية في أمراض الدماغ باستخدام عينات الأنسجة العصبية التي تم جمعها بعد الوفاة. ومع ذلك ، هذه المواد وقيود عديدة. في المقابل ، فإن الغشاء المخاطي الشمي يمكن الوصول إليها بسهولة ، ويمكن أن تحتاج فحص بأمان دون أي خسارة في حاسة الشم ^1. تبعا لذلك ، والغشاء المخاطي الشمي يوفر "نافذة مفتوحة" في الإنسان البالغ من خلالها يمكن للمرء أن الدراسة التنموية (مثل التوحد وانفصام الشخصية) ^2-4 أو الاعصاب (باركنسون مثل الزهايمر) ^4،5 الأمراض. ويمكن استخدام الغشاء المخاطي الشمي للدراسات المقارنة إما الجزيئية أو ^4،6 في التجارب المختبرية على تكوين الخلايا العصبية ^3،7.

الظهارة الشمية أيضا الأنسجة العصبية التي تنتج خلايا عصبية جديدة كل يوم لتحل محل تلك التي تضررت من التلوث ، والبكتيرية من الالتهابات الفيروسية. ويستمر هذا تكوين الخلايا العصبية الدائمة الأسلاف ولكن أيضا الخلايا الجذعية المقيمين على حد سواء داخل المقصورات في الغشاء المخاطي ، وهما والظهارة العصبية الكامنة الصفيحة المخصوصة ^80-10. نحن وضعت مؤخرا طريقة لتنقية الخلايا الجذعية الموجودة في الصفيحة المخصوصة ، وبعد أن أثبتت أن ترتبط ارتباطا وثيقا لأنها خلايا نخاع العظام الجذعية الوسيطة (BM - MSC) ، ونحن منهم اسمه الشمية الخلايا الجذعية الوسيطة خارجي (OE - MSC) ^11.

ومن المثير للاهتمام ، بالمقارنة مع BM - اللجان الدائمة ، اللجان الدائمة OE - عرض معدل انتشار عالية ، وهو clonogenicity مرتفعة وميله الى التمايز إلى خلايا عصبية. اتخذنا الاستفادة من هذه الخصائص لتنفيذ دراسات مخصصة لكشف النقاب عن الجينات المرشحة الجديدة في الفصام و ⁴ مرض باركنسون. وقد أظهرت نحن وغيرنا أيضا أن OE - اللجان الدائمة واعدة المرشحين للعلاج الخلايا ، وبعد صدمة الحبل الشوكي ^12،13 ، ¹⁴ قوقعة ضرر أو في النماذج الحيوانية لمرض الشلل الرعاش ¹⁵ أو فقدان الذاكرة ^16.

في هذه الدراسة ، فإننا نقدم طرق لخزعة الغشاء المخاطي الشمي في الفئران والبشر. بعد جمع ، يتم فصل إنزيمي في الصفيحة المخصوصة من ظهارة والخلايا الجذعية هي تنقية باستخدام الأنزيمية أو أسلوب غير الأنزيمية. يمكن تنقية الخلايا الجذعية تكون حاسة الشم ثم نمت إما بأعداد كبيرة ، واعتمدت في النيتروجين السائل أو حثهم على شكل دوائر أو متمايزة في الخلايا العصبية. ويمكن أيضا أن تكون هذه الخلايا الجذعية المستخدمة في omics المقارن (الجينوم ، transcriptomic ، epigenomic ، البروتين) دراسات.

Protocol

1. مجموعة من الفئران في الغشاء المخاطي الشمي

1. البدء بإعداد ثلاثة أطباق بتري 35 مم مملوءة DMEM / HAM مستنبت F12 في غطاء ثقافة نظيفة.
2. يجب الموافقة على أي وسيلة للقتل الرحيم مقدما عن طريق رعاية الحيوانات المؤسسة واستخدام لجنة ونفذت من قبل موظفين مؤهلين. بعد تخدير الفئران دخلت عميقة مع أشكال الصوديوم بنتوباربيتال حقن تخدير أو غيرها من مثل الكيتامين / زيلازين ، قطع رأس وإزالة الجلد. وينبغي تجنب التخدير الاستنشاق. وسيتم تقييم مدى كفاية تخدير بواسطة إصبع قرصة قبل قطع الرأس. إزالة الفك السفلي مع مقص ، وبمساعدة من قراضة ، والقضاء على عضلات الوجه على الجانبين.
3. بدءا من الجزء الخلفي من القواطع ، مع إزالة مقراض العظم الذي يغطي تجويف الأنف ، جانب واحد في وقت واحد. والقرائن حيز البصر حاسة الشم والبرتقالي / البني الأجهزة الموجودة في الجزء الخلفي من الأنف.
4. تجاهل بدقة على القرائن مع ملقط. باستخدام إبرة قياس 26 ، عزل الغشاء المخاطي الشمي ملقاة على الحاجز عن طريق قطع النسيج على ثلاثة خطوط : قوس عمودي لوحة ، لوحة المصفوية وسقف تجويف الأنف.
5. جمع عينات للفحص في كلا الجانبين ونقلها في صحن DMEM / HAM بيتري F12 - شغلها. وينبغي أن هذا الإجراء لا تستغرق وقتا أطول من 10 دقيقة من بداية القتل الرحيم.
6. الآن ، من أجل إزالة المخاط ، نقل الخزعات مرتين في أطباق بتري المتوسطة شغلها.

2. مجموعة من البشر في الغشاء المخاطي الشمي

1. ينبغي أن يتم هذا الإجراء من قبل الأذن والأنف والحنجرة (ENT) جراح ، وفقا للجنة المحلية ذات الصلة الأخلاقية (ق) ، ويجب أن يوقع كل العيادات الخارجية نموذج الموافقة المستنيرة.
2. باستخدام ° 0 أو 30 درجة المنظار جامدة (4 مم) ، وفحص كل من تجاويف الأنف وتقييم وجود المفترضة من الاورام الحميدة أو أي آفة التهابية. اختيار أفضل تجويف الأنف ، مع الأخذ بعين الاعتبار انحراف الحاجز.
3. باستخدام قضيب من القطن ، وتطبيق مخدر موضعي ، مثل يدوكائين مع الادرينالين ، لمدة 10 دقيقة.
4. بالملقط a throughcut الغربالي ، وجمع اثنين ملليمتر مربع خزعة إما في الجذر من الجانب الإنسي من المحارة المتوسطة أو على الحاجز في منطقة ظهراني إنسي.
5. ثم يتم نقل خزعة الشمية ، وذلك باستخدام إبرة معقمة ، في أنبوب العقيمة 2 مل مملوءة 1 مل من DMEM / HAM F12. تقلب رأسا على عقب أنبوب للتأكد من أن يتم غمس خزعة في المتوسط ​​الثقافة.
6. ادخال الانبوب في حاوية مبردة ونقلها إلى مختبر أبحاث. في هذه المرحلة ، يمكن أن تستخدم الخزعة في حد ذاتها للدراسات الجزيئية النسبية التي تركز على أمراض معينة أو معالجة الدماغ لتوليد الخلايا الجذعية.

3. عزل الخلايا الجذعية من الغشاء المخاطي الشمي الإنسان والفأر

1. غسل الخزعات في DMEM / HAM F12. احتضان الخزعات في طبق بتري مليئة 1 مل من dispase حل ثانيا (2.4 وحدة دولية / مل) ، لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
2. المقبل ، تحت مجهر تشريح بضوء diffracted مقلوب ، تتم إزالة الظهارة الشمية من الصفيحة المخصوصة الكامنة باستخدام ملعقة صغيرة.
3. الظهارة الشمية هي أرق وتبدو شفافة على خلفية سوداء بالمقارنة مع الصفيحة المخصوصة التي هي مخططة البرتقالي / البني. على خلفية بيضاء ، وتبدو رمادية ظهارة وصفيحة المخصوصة ، والبني.
4. المنقى مرة واحدة ، ونقل الصفيحة المخصوصة في طبق بتري مليئة DMEM / HAM F12.
5. إذا كان النسيج هو من القوارض ، ثم قطع الصفيحة المخصوصة الى قطع صغيرة مع اثنين من الإبر قياس 25. ثم ، ونقل القطع لأنبوب 15 مل مملوءة 1 مل من IA كولاجيناز.
6. في الأنبوب ، وذلك باستخدام ماصة بلاستيكية معقمة ، فصل الأنسجة. ثم احتضان الأنبوب لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
7. لإنهاء الانفصال ، الصخرة بلطف أنبوب ويضاف 9 مل من الكالسيوم والمغنيسيوم حرة وخالية من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 200 غ لمدة 5 دقائق.
8. Resuspend الكرية خلية في DMEM / HAM مستنبت F12 تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين والمضادات الحيوية والثقافة لوحة على أطباق بلاستيكية.
9. الآن ، إذا كانت الأنسجة البشرية ، وشريحة ثم إلى الصفيحة المخصوصة 3-4 قطعة بسماكة تتراوح بين 200-500 ميكرون.
10. إدراج كل قطاع الخاص في صحن قطره 2 سم الثقافة وتغطية الأنسجة عقيمة مع قطرها 1.3 سم ينزلق الغطاء الزجاجي.
11. ثم ، إضافة 500 ميكرولتر من مستنبت (DMEM / HAM F12 تستكمل مع 10 ٪ مصل العجل الجنين والمضادات الحيوية) إلى كل صحن الثقافة.
12. إما لنوع الأنسجة ، وتجديد الثقافة المتوسطة كل 2 إلى 3 أيام.
13. خمسة إلى سبعة أيام بعد ، وسوف تبدأ الخلايا الجذعية لغزو الثقافة وطبق بعد أسبوعين أنها ينبغي أن تكون متموجة. عندما يتم التوصل confluency ، والمرور ، ونقل الخلايا إلى قوارير الثقافة.

4. تشكيل المجال واح متعلق بالخلايا العصبيةntiation من الخلايا الجذعية الشم

1. لتوليد مجالات الخلايا الجذعية ، واحتضان قوارير لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع بولي - L - يسين. (نص : 5 g/cm2).
2. لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 16000 خلية لكل سنتيمتر مربع في قوارير المعالجة.
3. كل يومين ، تغذية الخلايا مع 0.2ml لكل سنتيمتر مربع من المتوسط ​​تستكمل (DMEM / HAM F12 تستكمل مع الانسولين ، ترانسفيرين ، السيلينيوم (ITS - X ، 1 ٪) ، EGF (50 نانوغرام / مل) ، وFGF2 (50 نانوغرام / مل)).
4. يومين إلى خمسة أيام في وقت لاحق ، وجمع المجالات الخلية عائمة وإما إعادة لوحة أو فصل منها قبل التطعيم في نماذج حيوانية لعلاج الخلايا.
5. للتمييز بين الخلايا الجذعية العصبية الشمية في مثل الخلايا ، بزراعتها لمدة 21 يوما في المتوسط ​​تحتوي على Neurobasal B - 27 ، البنسلين ، الستربتوميسين ، الجلوتامين والغلوتامات.
6. ثم جعل التغييرات المتوسط ​​كل 3 أيام. وينبغي أن الخلايا العصبية التي تشبه الخلايا تظهر بعد أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع.

5. ممثل النتائج :

الأنف البشري يزدرع - تعدى الخلايا الجذعية (الشكل 2A) هي تقسيم بسرعة ويمكن أن يتم التوصل في غضون confluency 1-2 أسابيع. تم تقييم احد السمات الرئيسية لstemness ، nestin التعبير ، (2B الشكل). عندما نمت على بولي يسين - L مع مستنبت المصل خالية تستكمل مع EGF (50 نانوغرام / مل) ، وFGF2 (50 نانوغرام / مل) ، والخلايا الجذعية تثير حاسة الشم لتشمل المجالات (الشكل 2C). عندما نمت في مستنبت المحتوية على مصل المجالات مطلية حديثا تثير GFAP ، معربا عن الخلايا (~ 50 ٪) أرقام تويولين الإعراب ، خلايا (~ 10-15 ٪) وO4 - معربا عن الخلايا (~ 2-5 ٪) ⁹ ( 2D - F). ومع ذلك ، يمكن تعديل مصير الخلايا المشتقة المجال. على سبيل المثال ، عندما نمت في مستنبت Neurobasal تستكمل مع B27 والغلوتامات ، فإن معظم الخلايا الجذعية العصبية الشمية في الأنف مثل الخلايا معربا عن β - III تويولين الشكل (2G) وMAP2 الشكل (2H).

الشكل 1. مخطط شامل للتجربة. يتم استئصال الغشاء المخاطي الشمي خزعات من الجرذان أو تجويف الأنف البشري. ويمكن استخدام Explants في حد ذاته للدراسات الجزيئية النسبية التي تهدف إلى تحديد المؤشرات الحيوية في أمراض الدماغ. لعزل الخلايا الجذعية الشمية ، تتعطل التفاعلات بين الصفيحة المخصوصة والاعصاب ظهارة ، مع انزيم dispase الثاني ، وبعد 45 دقيقة ، تتم إزالة الظهارة مع ملعقة صغيرة. ويتم اختيار المزيد من الخلايا الجذعية الشمية بواسطة القوارض عدم الربط بين الصفيحة المخصوصة مع IA كولاجيناز. للأنسجة البشرية ، ومثقف قطعة من الصفيحة المخصوصة الشمية ساترة تحت الزجاج حتى تعدى غزو الخلايا الجذعية كله جيدا. بعد الانتشار ، وذلك باستخدام وسيلة الثقافة المناسبة ، يمكن توليد الخلايا الجذعية الشمية أو تمييز في مجالات الخلايا العصبية التي تشبه الخلايا. ويمكن استخدام الخلايا الجذعية لحاسة الشم ط) أمراض الدماغ أو إصلاح أو الصدمة الثانية) تحديد المؤشرات الجزيئية للأمراض الجهاز العصبي المركزي. تتم بمساعدة الرسوم التوضيحية للفنون Servier الطبية.

الشكل 2. الثقافة وتمايز الخلايا الجذعية البشرية الأنف حاسة الشم. الخلايا الجذعية البشرية المتزايدة من الصفيحة المخصوصة ازدراع (A) هي تقسيم بسرعة ، وعندما يزرع في وسط المحتوية على مصل. الخلايا الجذعية تعبر عن stemness nestin علامة (B). عندما مطلي على بولي - L - يسين المغلفة البلاستيكية وزراعتها في وسط ثقافة خالية من مصل EGF وتستكمل مع FGF2 ، والخلايا الجذعية مجالات توليد حاسة الشم (C). المجال المستمدة من الخلايا ، وعندما مطلي في مستنبت المحتوية على مصل الدم ، تؤدي إلى GFAP ، معربا عن الخلايا (~ 50 ٪) ، معربا عن الخلايا تويولين - (~ 10-15 ٪) وO4 - معربا عن الخلايا (~ 2-5 ٪) ⁹ (مدافع). عندما نمت في مستنبت Neurobasal تستكمل مع B27 والغلوتامات ، فإنها تفرق في الخلايا العصبية التي تشبه الخلايا معربا عن β - III تويولين (G) وMAP2 (H).

Discussion

قدم هنا تقنيات تجعل القوارض والغشاء المخاطي الشمي الإنسان نموذجا مفيدا للبحوث السريرية في أسباب الأمراض العصبية النمائية والاعصاب وكذلك أداة لإصلاح المرضية في الدماغ أو صدمة. بروتوكول واضح ومباشر نسبيا ويمكن حملها بسهولة من قبل ذوي الخبرة بيولوجيا الخلايا. نسبة النجاح لتقنيات خزعة والثقافة العالية.

خطوات حاسمة

• لجمع الغشاء المخاطي الشمي القوارض ، فمن المستحسن أن لا تتجاوز مهلة من 10 دقيقة بين القتل الرحيم والاستئصال النهائي للأنسجة حاسة الشم.
• وعادة ما يتحقق من التفكك الصفيحة المخصوصة القوارض الشمية بعد 10 دقيقة. حضانة في كولاجيناز IA. إذا لم يكن كذلك ، فإننا نوصي لجمع بعد يوم من طاف في بت undissociated التي تطفو من الصفيحة المخصوصة ، فإنه الطرد المركزي في 200 غ ، وتنأى ميكانيكيا الصفيحة العائمة باستخدام ماصة باستور قبل replating الخلايا في البئر الجديد. يمتلئ البئر الأول الذي يحتوي على خلايا تعلق بالفعل مع مستنبت الطازجة.
• الصفيحة المخصوصة للبشرية ، الذي هو أكثر إحكاما من الأنسجة القوارض ، ونحن لا يوصي تفارق الأنزيمية. هي شرائح الأنسجة ويتم إدراج كل يزدرع بين الجزء السفلي من صحن البلاستيك والزجاج ساترة. الثقافات الناجحة التي تشمل explants سمك نطاق 200-500 ميكرون.

التعديلات الممكنة

• ويمكن للبروتوكول الحالي معدلة بشكل طفيف من أجل توليد خلايا عصبية شمية في المختبر. لهذا الغرض ، لا تتم إزالة العصبية وشرائح ظهارة الغشاء المخاطي الشمي كامل مع المروحية McIlwain (200 ميكرون سمك). غير مطلي كل يزدرع في طبق ، والمجففة جزئيا لمدة ساعة وبعد ذلك مع ممهى مستنبت المحتوية على السفح. خلال الأيام الأولى بعد الطلاء ، والخلايا الظهارية الوسيطة تنمو خارج ازدراع. ثم ، فإن أسلاف الخلايا العصبية الهجرة على رأس هذه الطبقة وتفرق في الخلية العصبية.
• ويمكن تحقيق تنقية الخلايا الجذعية باستخدام حاسة الشم التدفق الخلوي. ويمكن استرجاع علامات سطح معينة من القائمة التي نشرت في ورقة خصائص ^11.
• للتجارب زرع ، فمن الممكن استخدام سلالة من الفئران التي الشمية الخلايا الجذعية هي GFP إيجابية. هذه السلالة الفئران (سبراغ داولي ، eGFP مدفوعا المروج PGK) متوفرا في ITERT (نانت الفرنسي). لإدخال هذا الجين في GFP الخلايا الجذعية البشرية حاسة الشم ، ونحن نستخدم أسلوب يستند على العدوى الفيروسة البطيئة.
• وتركز هذه الورقة على حاسة الشم الخلايا الجذعية الوسيطة خارجي. ومع ذلك ، يمكن تنقيته من نوع آخر خلية من الفائدة ، والخلايا الشمية مغمد ، من النسيج نفسه. صفنا طريقة لجمع وتنقية وكنا ^1،17 الإنسان خلايا الأنف مغمد لمحاكمة I / الداخليين المرحلة السريرية في المرضى الذين مشلول ^18.
• بوصفه عضوا من الفصيلة الخلايا الجذعية الوسيطة ، OE - اللجان الدائمة قادرة ، في ظل ظروف مناسبة ثقافة ، للتمييز في osteocytes ، والخلايا الشحمية myocytes ^11.

التطبيقات المستقبلية

• لقد استخدمنا بالفعل الخزعات الشمية الإنسان لدراسة الحالات الشاذة الخلوية والجزيئية في المرضى الذين يعانون من التوحد ، واضطراب ثنائي القطب ، خلل الوظائف المستقلة العائلية ، ومرض باركنسون ومرض الزهايمر والفصام ^2-7. نظريا ، يمكن أن تدرس جميع أمراض الدماغ باستخدام خزعات الأنف أو الخلايا الجذعية الطرفية الشمية.
• القوارض والإنسان الخلايا الجذعية الشمية الأنفية وقد تم بالفعل المطعمة في النماذج الحيوانية من فقدان الذاكرة ومرض باركنسون ، والضرر القوقعة والحبل الشوكي الصدمة ^12-16. ومن المتصور أن زرع هذه الخلايا في النماذج الحيوانية لمرض الزهايمر ، ونقص تروية الدماغ ، والتصلب المتعدد.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد
مجموعة من الغشاء المخاطي الشمي في الفئران
DMEM / HAM F12	Invitrogen	31331-028
بنتوباربيتال الصوديوم
مقراض	FST
إبرة قياس 26	Terumo	NN - 2613R
ملقط
مجموعة من الغشاء المخاطي الشمي في البشر
جامدة المنظار	كارل ستورز أو ريتشارد وولف الطبية
يدوكائين
الإيبينيفرين
Throughcut الغربالي ملقط	كارل ستورز أو ريتشارد وولف الطبية
عزل الخلايا الجذعية الشمية
Dispase الثاني	روش	10 295 825 001
تشريح المجهر
الملعقة الصغيرة	FST
كولاجيناز IA	سيغما الدريخ	C9891
Ca-free/Mg-free PBS	Invitrogen	14190-250
الجنين مصل العجل	Invitrogen	10270098
ساترة زجاجية	Knittel جلاسر	001/35
تشكيل المجال وتمايز الخلايا العصبية
بولي - L - يسين	سيغما الدريخ	P - 1274
الأنسولين ترانسفيرين السيلينيوم (ITS)	Invitrogen	51500056
EGF	R & D نظم	236 - EG
FGF2	R & D نظم	233 - FB
Neurobasal المتوسطة	Invitrogen	21103-049
B - 27 المصل خالية من الملحق	Invitrogen	17504-044
البنسلين / الستربتوميسين	Invitrogen	15140122
الجلوتامين	Invitrogen	25030024
الغلوتامات	سيغما الدريخ