Isolare cellule staminali olfattivo nasale da roditori o Umani

Riepilogo

Descriviamo qui un metodo per biopsying mucosa olfattiva di ratto e umano cavità nasali. Queste biopsie può essere usato sia per identificare le anomalie molecolari nelle malattie cerebrali o isolare le cellule staminali adulte multipotenti che possono essere utilizzati per il trapianto di cellule in modelli animali di trauma cerebrale / malattia

Abstract

La mucosa olfattiva, che si trova nella cavità nasale, si occupa di rilevare gli odori. E 'anche l'unico tessuto nervoso che è esposta all'ambiente esterno e facilmente accessibile in ogni individuo vivente. Come risultato, questo tessuto è unico per chiunque al fine di individuare le anomalie molecolari nel cervello patologico o di isolare le cellule staminali adulte per la terapia cellulare.

Anomalie molecolari nelle malattie del cervello sono spesso studiati utilizzando campioni di tessuto nervoso raccolti post-mortem. Tuttavia, questo materiale ha numerose limitazioni. Al contrario, la mucosa olfattiva è facilmente accessibile e può essere sottoposte a biopsia in modo sicuro senza alcuna perdita di olfatto ^1. Di conseguenza, la mucosa olfattiva fornisce una "finestra aperta" nell'essere umano adulto attraverso il quale si può studiare di sviluppo (es. autismo, schizofrenia) ^2-4 o neurodegenerative (ad esempio, Parkinson, Alzheimer), le malattie ^4,5. Mucosa olfattiva possono essere utilizzati sia per studi comparativi molecolari ^4,6 o esperimenti in vitro sulla neurogenesi ^3,7.

L'epitelio olfattivo è anche un tessuto nervoso che produce ogni giorno nuovi neuroni per sostituire quelli che sono danneggiati da inquinamento batterico delle infezioni virali. Questo neurogenesi permanente è sostenuta da progenitori, ma anche le cellule staminali che risiedono all'interno di entrambi i compartimenti della mucosa, cioè il neuroepitelio e la sottostante lamina propria a ^8-10. Abbiamo recentemente sviluppato un metodo per purificare le cellule staminali adulte si trova nella lamina propria e, dopo aver dimostrato che essi sono strettamente legate alle cellule staminali del midollo osseo mesenchimali (MSC-BM), abbiamo chiamato le olfattiva ecto-le cellule staminali mesenchimali (OE- MSC) ^11.

Interessante notare che, rispetto a BM-MSC, OE-MSC visualizzare un alto tasso di proliferazione, un clonogenicità elevato e una tendenza a differenziarsi in cellule neurali. Abbiamo approfittato di queste caratteristiche per svolgere studi dedicati a svelare nuovi geni candidati nella schizofrenia e ⁴ morbo di Parkinson. Noi e gli altri hanno anche dimostrato che OE-MSC sono promettenti candidati per la terapia cellulare, dopo un trauma del midollo spinale ^12,13, un danno cocleare ¹⁴ o in un modello animale del morbo di Parkinson ¹⁵ o amnesia ^16.

In questo studio, presentiamo i metodi per la biopsia della mucosa olfattiva nei ratti e gli esseri umani. Dopo la raccolta, la lamina propria è enzimaticamente separato dal epitelio e le cellule staminali sono purificate utilizzando un enzimatici o un non-metodo enzimatico. Purificato le cellule staminali olfattive possono quindi essere coltivate in gran numero e sopraelevate in azoto liquido o indotto a formare sfere o differenziate in cellule nervose. Queste cellule staminali possono essere utilizzati anche per omiche comparativa (genomica, trascrittomica, epigenomic, proteomica) studi.

Protocollo

1. Raccolta di mucosa olfattiva in topi

1. Iniziate preparando tre piatti 35 millimetri Petri riempite con DMEM / HAM F12 terreno di coltura in una cappa di cultura pulito.
2. Qualsiasi metodo di eutanasia deve essere approvato preventivamente dalla cura degli animali dell'istituto e sul comitato per l'uso e svolte da personale qualificato. Dopo che il ratto è entrato anestesia profonda con sodio pentobarbital o altre forme di anestesia iniettabili come la chetamina / xylazina, decapitare e togliere la pelle. Anestetici inalatori dovrebbero essere evitati. L'adeguatezza di anestesia sarà valutata pizzico piedi prima di decapitazione. Rimuovere la mascella inferiore con le forbici e con l'aiuto di una pinza ossivora, eliminare i muscoli facciali su entrambi i lati.
3. A partire dalla parte posteriore degli incisivi, rimuovere con una pinza ossivora l'osso che copre la cavità nasale, da un lato alla volta. I turbinati olfattivo entrare in vista come arancio / marrone organi che si trovano nella parte posteriore del naso.
4. Delicatamente scartare il turbinati con una pinza. Utilizzando un ago 26 gauge, isolare la mucosa olfattiva sdraiato sul setto tagliando il tessuto lungo tre direttrici: l'arco della piastra perpendicolare, la lamina cribrosa e il soffitto della cavità nasale.
5. Raccogliere biopsie su entrambi i lati e trasferirli in un DMEM / HAM F12 piena di Petri. Questa procedura non dovrebbe richiedere più di 10 minuti dalla comparsa eutanasia.
6. Ora, al fine di rimuovere il muco, trasferire le biopsie due volte in media riempito piastre di Petri.

2. Raccolta di mucosa olfattiva negli esseri umani

1. Questa procedura deve essere effettuata da un Otorinolaringoiatria (ORL), chirurgo, in conformità con le pertinenti locale comitato etico (s), e ogni ambulatoriale deve firmare un modulo di consenso informato.
2. Usando una 0 ° o 30 ° endoscopio rigido (4 mm di diametro), ispezionare sia cavità nasali e valutare la presenza putativo di polipi o lesioni infiammatorie. Scegli il miglior cavità nasale, tenendo conto della deviazione del setto.
3. Usando un applicatore di cotone, applicare un anestetico locale, come la lidocaina con adrenalina, per 10 minuti.
4. Con una pinza throughcut etmoide, raccogliere a due millimetri quadrati biopsia sia alla radice del mediale del turbinato medio o sul setto nella zona dorsomediale.
5. La biopsia olfattivo viene trasferito, utilizzando un ago sterile, in una sterile 2 ml di tubo riempito con 1 ml di DMEM / HAM F12. Punta il tubo a testa in giù per assicurarsi che la biopsia è immerso nel mezzo di coltura.
6. Inserire il tubo in un contenitore refrigerato e il trasporto al laboratorio di ricerca. In questa fase, la biopsia può essere utilizzato di per sé per gli studi comparativi molecolare focalizzata sulle malattie cerebrali specifici o trattati per la generazione di cellule staminali.

3. Isolamento di cellule staminali da olfattivi dell'uomo e Rat Mucosa

1. Lavare le biopsie in DMEM / HAM F12. Incubare le biopsie in piastre di Petri riempite con 1 ml di soluzione dispasi II (2,4 UI / ml), per 1 ora a 37 ° C.
2. Poi, sotto un microscopio da dissezione con una luce diffratta invertito, l'epitelio olfattivo viene rimosso dal lamina propria sottostante con una spatola micro.
3. L'epitelio olfattivo è più sottile e sembra trasparente su uno sfondo nero rispetto alla lamina propria, che è a strisce arancio / marrone. Su uno sfondo bianco, l'epitelio appare grigia e la lamina propria, marrone.
4. Una volta purificate, trasferire la lamina propria in una capsula di Petri riempite con DMEM / HAM F12.
5. Se il tessuto è di un roditore, quindi tagliare la lamina propria in piccoli pezzi con due aghi di calibro 25. Poi, il trasferimento dei pezzi ad un tubo da 15 ml riempita con 1 ml di collagenasi IA.
6. Nel tubo, usando una pipetta sterile in plastica, dissociare il tessuto. Poi, incubare la provetta per 10 minuti a 37 ° C.
7. Per terminare la dissociazione, agitare delicatamente il tubo e aggiungere 9 ml di Ca-Mg libero e senza PBS e centrifugare a 200 g per 5 minuti.
8. Risospendere il pellet cellulare in DMEM / HAM F12 mezzo di coltura supplementato con 10% di siero fetale bovino, antibiotici e piastra su piatti di plastica cultura.
9. Ora, se il tessuto è umano, allora fetta della lamina propria in 3 a 4 pezzi con uno spessore da 200 a 500 micron.
10. Inserire ogni striscia il meglio di sé 2 piatto cultura cm di diametro e coprire con il tessuto sterile 1,3 scivola in vetro diametro cm copertura.
11. Quindi, aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura (DMEM / HAM F12 supplementato con 10% di siero fetale bovino e antibiotici) per ogni piatto cultura.
12. Per entrambi i tipi di tessuto, rinnovare il terreno di coltura ogni 2 o 3 giorni.
13. Cinque a sette giorni dopo, le cellule staminali cominciano a invadere il piatto cultura e dopo due settimane dovrebbero essere confluenti. Quando confluenza viene raggiunto, passaggio e trasferimento alle cellule di fiaschi cultura.

4. Sfera Formazione e differe neuronalentiation delle cellule staminali olfattive

1. Per generare sfere di cellule staminali, incubare i palloni per due ore a 37 ° C con poli-L-lisina. (TESTO: 5 g/cm2).
2. Piastra le cellule ad una densità di 16.000 cellule per centimetro quadrato in fiaschi trattati.
3. Ogni due giorni, nutrire le cellule con 0,2 ml per centimetro quadrato di media integrati (DMEM / HAM F12 integrato con l'insulina, transferrina, selenio (ITS-X, 1%), EGF (50 ng / ml) e FGF2 (50 ng / ml)).
4. Da due a cinque giorni dopo, raccogliere le sfere delle cellule galleggianti e realizzato una nuova targa o dissociare prima innesto in modelli animali di terapia cellulare.
5. Per differenziare le cellule staminali in neuroni olfattivi-come le cellule, li coltivano per 21 giorni in media Neurobasal contenente B-27, penicillina, streptomicina, glutammina e glutammato.
6. Quindi apportare le modifiche di media ogni 3 giorni. Neurone-come le cellule dovrebbero apparire dopo due o tre settimane.

5. Rappresentante dei risultati:

Nasale umano espianto-superando le cellule staminali (Figura 2A) si dividono rapidamente e confluenza può essere raggiunto in una o due settimane. Una caratteristica chiave di staminalità, espressione nestina, è stata valutata (Figura 2B). Quando coltivate su poli-L-lisina con un siero privo di mezzo di coltura integrato con EGF (50 ng / ml) e FGF2 (50 ng / ml), le cellule staminali olfattive dar luogo a sfere (figura 2C). Quando coltivate in siero contenente terreno di coltura di nuova sfere placcati dare origine a cellule che esprimono GFAP (~ 50%), tubulina cellule che esprimono (~ 10-15%) e O4 cellule che esprimono (~ 2-5%) ⁹ (Figure 2D-F). Tuttavia, il destino della sfera cellule derivate possono essere modificati. Per esempio, quando coltivate in un terreno di coltura Neurobasal integrato con B27 e il glutammato, la maggior parte delle cellule staminali olfattive nasale in neurone-come le cellule che esprimono β-tubulina III (Figura 2G) e MAP2 (Fig. 2H).

Figura 1. Schema generale dell'esperimento. Biopsie della mucosa olfattiva sono asportati dal ratto o umano cavità nasale. Espianti può essere utilizzato di per sé per gli studi comparativi molecolare al fine di individuare biomarcatori in malattie del cervello. Per isolare le cellule staminali olfattive, le interazioni tra la lamina propria e il neuro-epitelio sono interrotti con la II dispasi enzima e, dopo 45 minuti, l'epitelio viene rimosso con un micro-spatola. Le cellule staminali olfattive roditori vengono ulteriormente selezionati dalla dissociazione della lamina propria con collagenasi IA. Per i tessuti umani, pezzi di lamina propria olfattive sono coltivate sotto vetro coprioggetto fino cellule staminali superando invadere l'intero bene. Dopo la proliferazione, utilizzando un mezzo appropriato coltura, le cellule staminali olfattive possono generare sfere o differenziarsi in neuroni-come le cellule. Le cellule staminali olfattive possono essere usati per i) patologie cerebrali riparazione o trauma o ii) identificare marcatori molecolari di malattie del sistema nervoso centrale. Le illustrazioni sono realizzate con l'ausilio di Arte Servier medica.

Figura 2. Cultura e la differenziazione delle cellule staminali nasali olfattive. Cellule staminali umane a crescere senza la lamina propria a espianto (A) dividono rapidamente, quando coltivate in un siero contenente mezzo. Le cellule staminali esprimono la staminalità marcatore nestina (B). Quando placcato in poli-L-lisina rivestite di plastica e coltivati ​​in un siero privo di mezzo di coltura integrato con EGF e FGF2, le cellule staminali olfattive generare sfere (C). Sfera cellule derivate, quando placcato in siero contenente terreno di coltura, danno luogo a cellule che esprimono GFAP (~ 50%), tubulina cellule che esprimono (~ 10-15%) e O4 cellule che esprimono (~ 2-5%) ⁹ (DF). Quando coltivate in un terreno di coltura Neurobasal integrato con B27 e glutammato, essi si differenziano in neuroni-come le cellule che esprimono β-tubulina III (G) e MAP2 (H).

Discussione

Le tecniche qui presentate fanno il roditore e umano mucosa olfattiva un modello utile per la ricerca clinica sulle cause di malattie dello sviluppo neurologico e neurodegenerative, nonché uno strumento per riparare il cervello patologica o traumatizzati. Il protocollo è relativamente semplice e può essere facilmente effettuata da un esperto biologo cellulare. Il tasso di successo per le tecniche di biopsia e la cultura è alto.

Passaggi critici

• Per la raccolta di roditore mucosa olfattiva, si consiglia di non superare un limite di tempo di 10 minuti tra l'eutanasia e l'escissione finale del tessuto olfattivo.
• La dissociazione della lamina propria a olfattivo dei roditori si raggiunge solitamente dopo 10 min. incubazione in collagenasi IA. In caso contrario, si consiglia di raccogliere il giorno dopo il supernatante in cui i bit non dissociato del galleggiante lamina propria, si centrifugare a 200 g e meccanicamente dissociare la lamina mobile usando una pipetta Pasteur prima replating le cellule in un nuovo bene. Il primo pozzo che contiene le cellule già fissato è piena di terreno di coltura fresco.
• Per la lamina propria umano, che è più compatto rispetto al tessuto roditore, si sconsiglia di uno dissociazione enzimatica. Il tessuto viene tagliato e ogni espianto è inserita tra il fondo del piatto di plastica e un copri bicchiere. Culture di successo sono espianti il ​​cui spessore va da 200 a 500 micron.

Eventuali modifiche

• Il protocollo attuale può essere leggermente modificata in modo da generare neuroni olfattivi in ​​vitro. A tal fine, il neuro-epitelio non viene rimosso e la mucosa olfattiva è tutta a fette con un chopper McIlwain (200 micron di spessore). Ogni espianto è placcato in un piatto, parzialmente essiccato per un'ora e poi reidratato con FCS contenenti terreno di coltura. Durante il primo messaggio placcatura giorni, le cellule epiteliali e mesenchimali crescere fuori l'espianto. Poi, progenitori dei neuroni migrerà sulla parte superiore di questo strato di cellule e differenziarsi in neuroni.
• Purificazione di cellule staminali olfattive possono essere raggiunti in citometria a flusso. Specifici marcatori di superficie possono essere recuperate dalla lista pubblicata sul giornale di caratterizzazione ^11.
• Per gli esperimenti di trapianto, è possibile utilizzare un ceppo di topi le cui cellule staminali olfattive sono GFP-positive. Questo ceppo ratto (Sprague Dawley, eGFP guidato dal promotore PGK) sono disponibili all'indirizzo ITERT (Nantes, Francia). Per l'inserimento del gene GFP in cellule staminali olfattive, usiamo un metodo basato sulla infezione lentivirus.
• Questo documento si concentra su olfattivo ecto-le cellule staminali mesenchimali. Tuttavia, un altro tipo di cellula di interesse, le cellule olfattive ensheathing, può essere purificati dal tessuto stesso. Abbiamo descritto un metodo per la loro raccolta e la depurazione ^1,17 e abbiamo usato cellule nasali ensheathing per uno studio di fase I / IIa clinica in pazienti paraplegici ^18.
• In qualità di membro della superfamiglia delle cellule staminali mesenchimali, OE-MSC sono in grado, in appropriate condizioni di coltura, di differenziarsi in adipociti, osteociti e miociti ^11.

Applicazioni future

• Abbiamo già usato biopsie olfattivo umano per studiare le anomalie cellulari e molecolari in pazienti affetti da autismo, disturbo bipolare, disautonomia familiare, morbo di Parkinson, morbo di Alzheimer e la schizofrenia ^2-7. Teoricamente, tutte le malattie del cervello possono essere studiate usando biopsie nasali o periferico delle cellule staminali olfattive.
• Roditore e cellule staminali olfattive nasali sono già stati innestati in modelli animali di amnesia, morbo di Parkinson, danni cocleari e traumi del midollo spinale ^12-16. E 'concepibile di trapiantare queste cellule in modelli animali della malattia di Alzheimer, l'ischemia cerebrale, sclerosi multipla.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo
Raccolta della mucosa olfattiva nei ratti
DMEM / PROSCIUTTO F12	Invitrogen	31331-028
Sodio pentobarbital
Pinza ossivora	FST
26 gauge	Terumo	NN-2613R
Forcipe
Raccolta della mucosa olfattiva nell'uomo
Endoscopio rigido	Karl Storz Medical o Richard Wolf
Lidocaina
Epinefrina
Throughcut etmoide forcipe	Karl Storz Medical o Richard Wolf
Isolamento di cellule staminali olfattive
Dispasi II	Roche	10 295 825 001
Microscopio da dissezione
Spatola Micro	FST
Collagenasi IA	Sigma-Aldrich	C9891
Ca-free/Mg-free PBS	Invitrogen	14190-250
Siero di vitello fetale	Invitrogen	10270098
Vetro coprioggetto	Knittel Glaser	001/35
Sfera formazione e la differenziazione neuronale
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P-1274
Insulina transferrina selenio (ITS)	Invitrogen	51500056
FEG	R & D Systems	236-EG
FGF2	R & D Systems	233-FB
Medio Neurobasal	Invitrogen	21103-049
B-27 senza siero Supplemento	Invitrogen	17504-044
Penicillina / streptomicina	Invitrogen	15140122
Glutammina	Invitrogen	25030024
Glutammato	Sigma-Aldrich