Isolating Nasal Olfaktorische Stammzellen von Nagetieren oder Menschen

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier eine Methode zur Biopsieentnahme Riechschleimhaut von Ratte und Mensch Nasenhöhlen. Diese Biopsien können entweder für die Identifizierung von molekularen Anomalien bei Schädigungen des Gehirns oder Isolieren multipotente adulte Stammzellen, die für die Zell-Transplantation in Tiermodellen für Hirn-Trauma / Krankheit eingesetzt werden kann genutzt werden

Zusammenfassung

Die Riechschleimhaut in der Nasenhöhle befindet, ist für die Erkennung Gerüche. Es ist auch die einzige Nervengewebe, die zu der äußeren Umgebung ausgesetzt ist und leicht zugänglich in jedem lebenden Individuum. Als Ergebnis ist dieses Gewebe einzigartig für jedermann mit dem Ziel, molekulare Anomalien in der pathologischen Gehirns zu identifizieren oder zu isolieren, adulte Stammzellen für die Zelltherapie.

Molekulare Veränderungen bei Schädigungen des Gehirns sind oft studiert mit Nervengewebe gesammelten Proben post-mortem. Allerdings hat dieses Material zahlreiche Einschränkungen. Im Gegensatz dazu ist die Riechschleimhaut leicht zugänglich und können sicher und ohne jeglichen Verlust des Geruchssinns ¹ biopsiert werden. Dementsprechend stellt die Riechschleimhaut eine "offene Fenster" in der erwachsenen Menschen, durch die man studieren kann Entwicklungsstörungen (zB Autismus, Schizophrenie) ^2-4 oder neurodegenerative (zB Parkinson, Alzheimer) Erkrankungen ^4,5. Riechschleimhaut kann entweder für vergleichende molekulare Untersuchungen ^4,6 oder in vitro-Experimenten auf die Neurogenese ^3,7 verwendet werden.

Das Riechepithel ist auch ein Nervengewebe, dass neue Nervenzellen produziert jeden Tag, um diejenigen, die durch Umweltverschmutzung geschädigt sind, bakterielle von viralen Infektionen zu ersetzen. Diese permanente Neurogenese wird durch Vorfahren aufrechterhalten, sondern auch Stammzellen mit Wohnsitz innerhalb der beiden Kammern der Schleimhaut, nämlich die Neuroepithel und die zugrunde liegenden Lamina propria ^8-10. Wir haben kürzlich eine Methode entwickelt, um die adulten Stammzellen in der Lamina propria befindet reinigen und, nachdem er bewiesen, dass sie eng mit dem Knochenmark mesenchymale Stammzellen (BM-MSC) verbunden, nannten wir sie olfaktorischen Ekto-mesenchymale Stammzellen (OE- MSC) ^11.

Interessanterweise, wenn sie auf BM-MSCs verglichen, zeigen OE-MSCs eine hohe Proliferationsrate, einer erhöhten clonogenicity und eine Neigung zu Nervenzellen differenzieren. Wir nutzten diese Eigenschaften auf Studien gewidmet neue Kandidatengene bei Schizophrenie und Parkinson ⁴ enthüllen durchzuführen. Wir und andere haben auch gezeigt, dass OE-MSCs sind vielversprechende Kandidaten für Zelltherapie nach einer Rückenmarkstraumata ^12,13, ein Cochlea-Schäden ¹⁴ oder in einem Tiermodell der Parkinson-Krankheit ¹⁵ oder Amnesie ^16.

In dieser Studie präsentieren wir Methoden zur Riechschleimhaut bei Ratten und Menschen Biopsie. Nach der Entnahme wird der Lamina propria enzymatisch aus dem Epithel und Stammzellen getrennt werden gereinigt, indem eine enzymatische oder nicht-enzymatische Methode. Gereinigtes olfaktorische Stammzellen können dann entweder in großer Zahl gezüchtet und Querneigung in flüssigem Stickstoff oder veranlasst Sphären Form oder differenziert in neuronale Zellen. Diese Stammzellen können auch für vergleichende omics (genomische, Transkriptom-, epigenomischen-, Proteom-) Studien verwendet werden.

Protokoll

1. Sammlung der Riechschleimhaut in Ratten

1. Beginnen Sie mit der Vorbereitung drei 35 mm Petrischalen mit DMEM / HAM F12 Kulturmedium in einer sauberen Kultur Haube gefüllt.
2. Jede Methode der Sterbehilfe müssen im Voraus von der Institution Tier in Pflege und Gebrauch Ausschuss genehmigt und durchgeführt von qualifiziertem Personal. Nachdem die Ratte hat tiefe Narkose mit Natrium-Pentobarbital oder anderen injizierbaren Formen der Anästhesie wie Ketamin / Xylazin eingegeben, enthaupten und die Haut abziehen. Inhalant Anästhetika sollten vermieden werden. Angemessenheit der Narkose wird von toe Prise beurteilt werden, bevor Enthauptung. Entfernen Sie den Unterkiefer mit der Schere und mit der Hilfe von einem Luer, beseitigen die Gesichtsmuskeln auf beiden Seiten.
3. Ausgehend von der Rückseite der Schneidezähne, mit einem Luer den Knochen für die Nasenhöhle, eine Seite zu einem Zeitpunkt, zu entfernen. Die olfaktorischen Nasenmuscheln in Sicht kommen, wie orange / braun Organe in den Rücken der Nase entfernt.
4. Zart verwerfen die Nasenmuscheln mit einer Pinzette. Mit einer 26-Gauge-Nadel, isolieren die Riechschleimhaut liegt auf der Scheidewand, indem das Gewebe an drei Fronten: den Bogen von der Senkrechten Platte, der Lamina cribrosa und der Decke der Nasenhöhle.
5. Sammeln Biopsien auf beiden Seiten und übertragen Sie sie in einem DMEM / HAM F12 gefüllte Petrischale. Dieser Vorgang sollte nicht länger als 10 Minuten vom Beginn Euthanasie.
6. Nun, um den Schleim zu entfernen, übertragen Sie die Biopsien zweimal in Medium gefüllte Petrischalen.

2. Sammlung der Riechschleimhaut in Humans

1. Dieses Verfahren sollte von einem Hals, Nasen, Ohren (HNO) Chirurgen durchgeführt werden, in Übereinstimmung mit den einschlägigen lokalen Ethikkommission (s), und jede ambulante sollten eine Einverständniserklärung zu unterschreiben.
2. Mit einem 0 ° oder 30 ° starren Endoskop (4 mm Durchmesser), überprüfen Sie beide Nasenhöhlen und bewerten die vermeintliche Anwesenheit von Polypen oder entzündlichen Läsionen. Wählen Sie den besten Nasenhöhle, unter Berücksichtigung der Abweichung der Nasenscheidewand.
3. Mit einem Baumwoll-Applikator, gelten ein Lokalanästhetikum wie Lidocain mit Adrenalin, für 10 Minuten.
4. Mit einem throughcut Siebbein Pinzette, sammeln zwei Quadratmillimeter Biopsie entweder an der Wurzel der medialen Seite der mittleren Muschel oder auf das Septum in den dorsomedialen Bereich.
5. Die olfaktorischen Biopsie wird dann übertragen, mit einer sterilen Kanüle, in ein steriles 2 ml Röhrchen mit 1 ml DMEM / HAM F12 gefüllt. Tipp der Röhre auf den Kopf, um sicherzustellen, dass die Biopsie in das Kulturmedium eingetaucht ist.
6. Stecken Sie das Rohr in einem Kühlcontainer und transportieren sie zu den Forschungslabors. In diesem Stadium kann die Biopsie per se für vergleichende molekulare Studien über spezifische Krankheiten des Gehirns konzentriert oder verarbeitet zur Erzeugung von Stammzellen verwendet werden.

3. Isolation der olfaktorischen Stammzellen aus menschlichen und Rat Mucosa

1. Waschen Sie die Biopsien in DMEM / HAM F12. Inkubieren Sie die Biopsien in einer Petrischale mit 1 ml Dispase II-Lösung (2,4 IU / ml) gefüllt, für 1 Stunde bei 37 ° C.
2. Klicken Sie dann unter einem Binokular mit einem gebeugten invertierten Licht, ist das Riechepithel von der darunter liegenden Lamina propria mit einem Mikro Spatel entfernt.
3. Das Riechepithel ist dünner und sieht über einem schwarzen Hintergrund transparent gegenüber der Lamina propria, die gestreiften ist orange / braun. Über einem weißen Hintergrund, sieht das Epithel grau und der Lamina propria, braun.
4. Einmal gereinigt, Übertragung der Lamina propria in eine Petrischale mit DMEM / HAM F12 gefüllt.
5. Wenn das Gewebe von einem Nagetier, dann schneiden die Lamina propria in kleine Stücke mit zwei 25-Gauge-Nadeln. Dann übertragen Sie die Stücke in ein 15 ml Röhrchen mit 1 ml Kollagenase IA gefüllt.
6. In der Röhre, mit einer sterilen Plastik-Pipette, distanzieren Gewebe. Dann inkubieren das Rohr 10 Minuten bei 37 ° C.
7. Zur Beendigung der Dissoziation, schaukeln die Röhre und stell 9 ml Ca-freien und Mg-freiem PBS und Zentrifuge bei 200 g für 5 Minuten.
8. Zellpellet in DMEM / HAM F12 Kulturmedium mit 10% fötalem Kälberserum, Antibiotika und Platte auf Kunststoff-Kulturschalen ergänzt.
9. Nun, wenn das Gewebe ein Mensch ist, dann schneiden die Lamina propria in 3 bis 4 Stücke mit einer Dicke im Bereich von 200 bis 500 um.
10. Legen Sie jeden Streifen in eine eigene 2 cm Durchmesser Kulturschale und decken das Gewebe mit einer sterilen 1,3 cm Durchmesser Glasdeckgläschen.
11. Dann fügen Sie 500 ul Kulturmedium (DMEM / HAM F12 mit 10% fötalem Kälberserum und Antibiotika ergänzt) zu jeder Kulturschale.
12. Für beide Gewebetyp, erneuern das Kulturmedium alle 2 bis 3 Tagen.
13. Fünf bis sieben Tage nach, werden Stammzellen beginnen, die Kulturschale eindringen und nach zwei Wochen sollten sie konfluent. Wenn Konfluenz ist, Durchgang erreicht und den Transfer der Zellen auf Kulturflaschen.

4. Sphere Formation und Neuronale différéntiation der olfaktorischen Stem Cells

1. Zur Erzeugung von Stammzellen Kugeln, inkubieren Sie die Flaschen für 2 Stunden bei 37 ° C mit Poly-L-Lysin. (TEXT: 5 g/cm2).
2. Platte die Zellen bei einer Dichte von 16.000 Zellen pro Quadratzentimeter in den behandelten Flaschen.
3. Alle zwei Tage, füttern Sie die Zellen mit 0,2 ml pro Quadratzentimeter ergänzt Medium (DMEM / HAM F12 ergänzt mit Insulin, Transferrin, Selen (ITS-X, 1%), EGF (50 ng / ml) und FGF2 (50 ng / ml)).
4. Zwei bis fünf Tage später, sammeln schwimmende Zelle Kugeln und entweder neu Platte oder distanzieren sie vor der Transplantation in Tiermodellen der Zelltherapie.
5. Zur Unterscheidung olfaktorische Stammzellen in Neuronen-ähnliche Zellen, kultivieren sie für 21 Tage in Neurobasal Medium mit B-27, Penicillin, Streptomycin, Glutamin und Glutamat.
6. Dann machen Medium wechselt alle 3 Tage. Neuron-ähnliche Zellen sollte nach zwei vor drei Wochen erscheinen.

5. Repräsentative Ergebnisse:

Nasal menschlichen Explantat-entwachsen Stammzellen (Abbildung 2A) werden sich schnell teilenden und Konfluenz kann innerhalb 1-2 Wochen erreicht werden. Ein wesentliches Merkmal der Stammzell-Seins, Nestin Ausdruck ausgewertet wurde (Abbildung 2B). Wenn auf Poly-L-Lysin mit einem serumfreien Kulturmedium mit EGF (50 ng / ml) und FGF2 (50 ng / ml) ergänzt gewachsen, geben olfaktorische Stammzellen entstehen Kugeln (Abbildung 2C). Wenn in serum-haltigem Kulturmedium gezüchtet neu vergoldet Sphären führen zu GFAP-exprimierenden Zellen (~ 50%), Tubulin-exprimierenden Zellen (~ 10-15%) und O4-exprimierenden Zellen (~ 2-5%) ⁹ (Figures 2D-F). Allerdings kann das Schicksal der Kugel-abgeleiteten Zellen verändert werden. Zum Beispiel, wenn in einem Neurobasal Kulturmedium mit B27 und Glutamat, die meisten von der Nasen-olfaktorische Stammzellen in Neuronen-ähnliche Zellen, die β-III Tubulin (Abbildung 2G) und MAP2 (Abb. 2H) ergänzt gewachsen.

Abbildung 1. Gesamtkonzept des Experiments. Riechschleimhaut Biopsien sind aus Ratte oder des Menschen Nasenhöhle herausgeschnitten. Explantate können per se für vergleichende molekulare Untersuchungen mit dem Ziel, Biomarker bei Schädigungen des Gehirns zu identifizieren verwendet werden. Zur Isolierung olfaktorische Stammzellen sind die Wechselwirkungen zwischen der Lamina propria und der neuro-Epithel mit der Dispase II Enzyms gestört, und nach 45 Minuten, das Epithel mit einem Mikro-Spatel entfernt. Nager olfaktorische Stammzellen werden durch Dissoziation der Lamina propria mit Kollagenase IA ausgewählt. Für menschliches Gewebe, sind Stücke von olfaktorischen Lamina propria unter Deckglas kultiviert, bis entwachsen Stammzellen die ganze Invasion gut. Nach Proliferation, mit einem geeigneten Nährmedium, können olfaktorische Stammzellen zu erzeugen Kugeln oder differenzieren sich in Neuronen-ähnliche Zellen. Olfaktorische Stammzellen kann i verwendet werden) in der Reparatur Hirnerkrankungen oder Trauma oder ii) Identifizierung molekularer Marker für Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Die Abbildungen sind mit Hilfe von Servier Medical Art gemacht.

Abbildung 2. Kultur und Differenzierung von humanen nasalen olfaktorische Stammzellen. Menschliche Stammzellen wächst aus der Lamina propria Explantation (A) sind schnell teilenden, wenn in einem Serum-haltigem Medium kultiviert. Stammzellen drücken die Stammzell-Seins Nestin (B). Wenn auf Poly-L-Lysin-beschichtete Kunststoff beschichtet und kultiviert in einem serumfreien Kulturmedium mit EGF und FGF2 ergänzt, erzeugen olfaktorische Stammzellen Kugeln (C). Sphere-abgeleiteten Zellen, wenn in serum-haltigem Kulturmedium vernickelt, führen zu GFAP-exprimierenden Zellen (~ 50%), Tubulin-exprimierenden Zellen (~ 10-15%) und O4-exprimierenden Zellen (~ 2-5%) ⁹ (DF). Wenn in einem Neurobasal Kulturmedium mit B27 und Glutamat ergänzt gewachsen, unterscheiden sie sich in Neuron-ähnliche Zellen, die β-III Tubulin (G) und MAP2 (H).

Diskussion

Die hier vorgestellten Verfahren stellen die Nager und die menschliche Riechschleimhaut ein nützliches Modell für die klinische Erforschung der Ursachen von neurologischen und neurodegenerativen Erkrankungen sowie ein Werkzeug für die Reparatur der pathologischen oder traumatisierte Gehirn. Das Protokoll ist relativ einfach und kann leicht durchgeführt werden durch einen erfahrenen Zellbiologe. Die Erfolgsrate für die Biopsie und Kultur Techniken ist hoch.

Kritische Schritte

• Für die Sammlung von Nagetier Riechschleimhaut, empfiehlt es sich nicht um eine Frist von 10 Minuten zwischen Euthanasie und die endgültige Entfernung der olfaktorischen Gewebe überschreiten.
• Die Dissoziation der Nager olfaktorischen Lamina propria ist in der Regel nach 10 min erreicht. Inkubation in Kollagenase IA. Wenn nicht, empfehlen wir sammeln am Tag nach der Überstand, in dem undissoziierten Bits Lamina propria float, Zentrifuge bei 200 g und mechanisch distanzieren die schwimmende Lamina mit einer Pasteurpipette vor Neuplattierungen die Zellen in einen neuen Brunnen. Die ersten gut mit den bereits anhaftenden Zellen mit frischem Nährmedium gefüllt ist.
• Für den menschlichen Lamina propria, die kompakter als das Nagetier Gewebe ist, raten wir von einer enzymatischen Dissoziation. Das Gewebe wird in Scheiben geschnitten und jedes Explantat wird zwischen dem unteren Rand der Plastikschale und einem Deckglas eingefügt. Erfolgreiche Kulturen gehören Explantate deren Dickenbereich von 200 bis 500 um.

Mögliche Änderungen

• Das aktuelle Protokoll kann leicht modifiziert werden, um olfaktorischen Neuronen in vitro zu generieren. Zu diesem Zweck ist die neuro-Epithel nicht entfernt und das ganze Riechschleimhaut ist mit einem McIlwain Chopper (200 um Dicke) geschnitten. Jedes Explantat wird in einer Schale überzogen, teilweise für 1 Stunde getrocknet und dann mit FCS-haltigen Kulturmedium rehydriert. Während der ersten Tage nach der Beschichtung, wachsen epithelialen und mesenchymalen Zellen aus dem Explantat. Dann wird Neuron Vorläuferzellen an der Oberseite dieser Zellschicht migrieren und differenzieren zu Neuronen.
• Die Reinigung des olfaktorischen Stammzellen kann mit Hilfe der Durchflusszytometrie werden. Spezifische Oberfläche Marker können aus der Liste in der Charakterisierung Papier veröffentlicht ¹¹ abgerufen werden.
• Für die Transplantation Experimenten ist es möglich, einem Stamm von Ratten, deren olfaktorische Stammzellen sind GFP-positive verwenden. Diese Rattenstamm (Sprague Dawley, eGFP getrieben von der PGK-Promotor) ist IterT (Nantes, Frankreich) zur Verfügung. Zum Einlegen des GFP-Gens in menschlichen Geruchs Stammzellen verwenden wir eine Methode auf Lentivirus Infektion.
• Dieses Papier ist auf olfaktorische Ekto-mesenchymale Stammzellen. Allerdings kann ein anderer Zelltyp von Interesse, die olfaktorischen einhüllenden Zellen, aus dem gleichen Gewebe gereinigt werden. Wir beschrieben eine Methode für ihre Sammlung und Reinigung ^1,17 und wir benutzten die menschliche Nase einhüllenden Zellen für eine Phase I / IIa der klinischen Entwicklung bei querschnittgelähmten Patienten ^18.
• Als Mitglied der mesenchymalen Stammzellen Superfamilie sind OE-MSCs können unter geeigneten Kulturbedingungen, in Adipozyten, Osteozyten und Myozyten ¹¹ zu unterscheiden.

Zukünftige Anwendungen

• Wir haben bereits die menschliche Geruchssinn Biopsien verwendet werden, um zelluläre und molekulare Anomalien bei Patienten mit Autismus, bipolare Störung, familiäre dysautonomia, Morbus Parkinson, Morbus Alzheimer und Schizophrenie ^2-7 studieren. Theoretisch können alle Erkrankungen des Gehirns untersucht mit nasal Biopsien oder peripheren olfaktorischen Stammzellen werden.
• Nager und Mensch nasal olfaktorische Stammzellen haben bereits in Tiermodellen der Amnesie, Morbus Parkinson, Cochlea-Schäden und Rückenmarkstraumata ^12-16 aufgepfropft. Es ist denkbar, diese Zellen in Tiermodellen der Alzheimer-Krankheit, Gehirn Ischämie, Multiple Sklerose zu verpflanzen.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer
Sammlung der Riechschleimhaut in Ratten
DMEM / HAM F12	Invitrogen	31331-028
Natrium-Pentobarbital
Rongeur	FST
26 Gauge Nadel	Terumo	NN-2613R
Zange
Sammlung von Riechschleimhaut beim Menschen
Starres Endoskop	Karl Storz oder Richard Wolf Medical
Lidocain
Adrenalin
Throughcut Siebbein Zange	Karl Storz oder Richard Wolf Medical
Isolierung von olfaktorischen Stammzellen
Dispase II	Roche	10 295 825 001
Präpariermikroskop
Micro Spatel	FST
Collagenase IA	Sigma-Aldrich	C9891
Ca-free/Mg-free PBS	Invitrogen	14190-250
Fötalem Kälberserum	Invitrogen	10270098
Deckglas	Knittel Glaser	001/35
Sphere Bildung und neuronale Differenzierung
Poly-L-Lysin	Sigma-Aldrich	P-1274
Insulin-Transferrin Selen (ITS)	Invitrogen	51500056
EGF	R & D Systems	236-EG
FGF2	R & D Systems	233-FB
Neurobasalmedium	Invitrogen	21103-049
B-27 Serum-Free Supplement	Invitrogen	17504-044
Penicillin / Streptomycin	Invitrogen	15140122
Glutamin	Invitrogen	25030024
Glutamat	Sigma-Aldrich