Isoler les cellules souches nasal olfactif des rongeurs ou des êtres humains

Résumé

Nous décrivons ici une méthode pour biopsies muqueuse olfactive de rat et humain des cavités nasales. Ces biopsies peuvent être utilisés soit pour identifier les anomalies moléculaires dans les maladies du cerveau ou d'isoler cellules souches adultes multipotentes qui peuvent être utilisés pour la transplantation de cellules dans des modèles animaux de traumatisme crânien / maladie

Résumé

La muqueuse olfactive, située dans la cavité nasale, est en charge de détecter les odeurs. Il est également le seul tissu nerveux qui est exposée à l'environnement extérieur et facilement accessible à chaque individu vivant. En conséquence, ce tissu est unique pour quiconque vise à identifier les anomalies moléculaires dans le cerveau pathologique ou isoler les cellules souches adultes pour la thérapie cellulaire.

Les anomalies moléculaires dans les maladies du cerveau sont souvent étudiés en utilisant des échantillons de tissus nerveux prélevés post-mortem. Toutefois, ce matériau a de nombreuses limites. En revanche, la muqueuse olfactive est facilement accessible et peut être biopsiées en toute sécurité sans aucune perte de l'odorat ^1. Par conséquent, la muqueuse olfactive offre une «fenêtre ouverte» dans l'homme adulte à travers lequel on peut étudier le développement (par exemple l'autisme, la schizophrénie) ^2-4 ou neurodégénératives (par exemple Parkinson, Alzheimer) ^4,5 maladies. Muqueuse olfactive peut être utilisé soit pour les études comparatives moléculaires ^4,6 ou dans des expériences in vitro sur la neurogenèse ^3,7.

L'épithélium olfactif est aussi un tissu nerveux qui produit de nouveaux neurones par jour pour remplacer ceux qui sont endommagés par la pollution, bactéries des infections virales. Cette neurogenèse permanente est soutenue par les progéniteurs, mais aussi des cellules souches résidant dans les deux compartiments de la muqueuse, à savoir le neuroépithélium et les sous-tendent lamina propria ^80-10. Nous avons récemment développé une méthode pour purifier les cellules souches adultes situées dans la lamina propria et, après avoir démontré qu'ils sont étroitement liés aux cellules de la moelle osseuse souches mésenchymateuses (CSM-BM), nous avons nommé les cellules souches olfactives ecto-mésenchymateuses (OE- MSC) ^11.

Fait intéressant, lorsque comparé à BM-MSC, OE-MSC afficher un taux de prolifération élevé, une clonogénicité élevée et une inclination à se différencier en cellules neurales. Nous avons profité de ces caractéristiques pour réaliser des études dédiées à dévoiler de nouveaux gènes candidats dans la schizophrénie et la maladie de Parkinson ^4. Nous et les autres ont aussi montré que OE-MSC sont des candidats prometteurs pour la thérapie cellulaire, après un traumatisme de la moelle épinière ^12,13, un dommage cochléaire ¹⁴ ou dans un modèle animal de maladie de Parkinson ou d'amnésie ^{15 16.}

Dans cette étude, nous présentons les méthodes pour la biopsie muqueuse olfactive chez les rats et les humains. Après la collecte, la lamina propria est enzymatiquement séparés de l'épithélium et les cellules souches sont purifiés en utilisant une méthode enzymatique ou non enzymatique. Purifié cellules souches olfactives peuvent alors être soit cultivées en grand nombre et mis en banque dans l'azote liquide ou induite pour former des sphères ou différenciées en cellules neurales. Ces cellules souches peuvent aussi être utilisés pour omique comparatif (génomique, transcriptomique, épigénomique, protéomique) des études.

Protocole

1. Collecte de muqueuse olfactive chez le rat

1. Commencez par préparer trois boîtes de Pétri de 35 mm rempli de DMEM / HAM F12 milieu de culture dans une hotte de culture propre.
2. Toute méthode d'euthanasie doit être approuvé au préalable par les soins des animaux de l'institution et le comité et qui sont exécutés par du personnel qualifié. Après que le rat est entré dans une anesthésie profonde avec du pentobarbital sodique ou d'autres formes injectables de l'anesthésie comme la kétamine / xylazine, décapiter et enlever la peau. Anesthésiques inhalés doivent être évités. Adéquation d'anesthésie seront évaluées par pincement de l'orteil avant la décapitation. Retirez la mâchoire inférieure avec des ciseaux et avec l'aide d'un rongeur, d'éliminer les muscles du visage des deux côtés.
3. A partir de la face postérieure des incisives, enlever avec une pince-gouge couvrant l'os de la cavité nasale, d'un côté à la fois. Les cornets olfactifs entreront en vue que l'orange / marron organes situés à l'arrière du nez.
4. Délicatement jeter les cornets avec une pince. En utilisant une aiguille de calibre 26, isoler la muqueuse olfactive couché sur le septum en coupant le tissu autour de trois axes: l'arc de la lame perpendiculaire, la lame criblée et le plafond de la cavité nasale.
5. Recueillir des biopsies sur les deux côtés et de les transférer dans un milieu DMEM / HAM F12-remplie boîte de Pétri. Cette procédure ne devrait pas prendre plus de temps de 10 minutes de l'euthanasie apparition.
6. Maintenant, afin d'éliminer le mucus, le transfert des biopsies deux fois en boîte de Pétri moyen remplis.

2. Collecte de muqueuse olfactive chez l'homme

1. Cette procédure doit être effectuée par un oto-rhino-laryngologie (ORL), conformément aux dispositions pertinentes d'éthique local du comité (s), et tous les soins ambulatoires devrait signer un formulaire de consentement éclairé.
2. L'utilisation d'un 0 ° ou 30 ° endoscope rigide (4 mm de diamètre), inspecter les cavités nasales et d'évaluer la présence supposée de polypes ou de toute lésion inflammatoire. Choisissez le meilleur cavité nasale, en tenant compte de la déviation de la cloison.
3. L'utilisation d'un applicateur en coton, appliquer un anesthésique local, comme la lidocaïne avec épinéphrine, pendant 10 minutes.
4. Avec une pince throughcut ethmoïde, de recueillir deux millimètre carré de biopsie soit à la racine de la face médiale du cornet moyen ou sur le septum dans la zone dorsomédial.
5. La biopsie du olfactive est ensuite transféré, à l'aide d'une aiguille stérile, dans une stérile 2 ml tube rempli de 1 ml de DMEM / HAM F12. Astuce le tube à l'envers pour faire en sorte que la biopsie est immergé dans le milieu de culture.
6. Insérez le tube dans un conteneur réfrigéré et le transport au laboratoire de recherche. A ce stade, la biopsie peut être utilisée en soi pour les études comparatives sur les maladies moléculaires spécifiques du cerveau ou traitées pour générer des cellules souches.

3. Isolement de cellules souches humaines et olfactive du rat Muqueuse

1. Lavez les biopsies dans du DMEM / HAM F12. Incuber les biopsies dans une boîte de Pétri remplie de 1 ml de solution de dispase II (2,4 UI / ml), pendant 1 heure à 37 ° C.
2. Ensuite, sous un microscope à dissection avec une lumière diffractée inversée, l'épithélium olfactif est retiré de la lamina propria sous-jacente à l'aide d'une spatule micro.
3. L'épithélium olfactif est plus mince et regarde translucide sur un fond noir par rapport à la lamina propria qui est rayé orange / marron. Sur un fond blanc, l'épithélium est gris et la lamina propria, marron.
4. Une fois purifié, le transfert de la lamina propria dans une boîte de Pétri remplie de DMEM / HAM F12.
5. Si le tissu provient d'un rongeur, puis couper la lamina propria en petits morceaux avec deux aiguilles de calibre 25. Ensuite, transférez les morceaux d'un tube de 15 ml remplie de 1 ml de collagénase IA.
6. Dans le tube, en utilisant une pipette en plastique stérile, dissocient le tissu. Puis, incuber le tube pendant 10 minutes à 37 ° C.
7. Pour mettre fin à la dissociation, secouez légèrement le tube et ajouter 9 ml de Ca et Mg-libres sans PBS et centrifuger à 200 g pendant 5 minutes.
8. Reprendre le culot cellulaire dans du DMEM / HAM F12 milieu de culture supplémenté en sérum de veau foetal à 10%, les antibiotiques et la plaque sur des boîtes de culture en plastique.
9. Maintenant, si le tissu est humain, puis coupez la lamina propria en 3 à 4 pièces avec une épaisseur allant de 200 à 500 um.
10. Insérez chaque bande dans sa propre boîte de culture 2 cm de diamètre et de couvrir le tissu avec stériles 1,3 cm glisse diamètre couvercle en verre.
11. Ensuite, ajouter 500 ul de milieu de culture (DMEM / HAM F12 complété avec du sérum de veau foetal à 10% et des antibiotiques) pour chaque boîte de culture.
12. Pour chaque type de tissu, de renouveler le milieu de culture tous les 2 à 3 jours.
13. Cinq à sept jours après, les cellules souches vont commencer à envahir la boîte de culture et après deux semaines, ils doivent être confluentes. Lorsque la confluence est atteinte, le passage et le transfert aux cellules de flacons de culture.

4. Formation Sphère et Différé neuronalentiation des cellules souches olfactive

1. Pour générer les sphères de cellules souches, incuber les flacons pendant deux heures à 37 ° C avec de la poly-L-lysine. (TEXTE: 5 g/cm2).
2. Assiette des cellules à une densité de 16.000 cellules par centimètre carré dans les flacons traités.
3. Tous les deux jours, nourrir les cellules avec 0,2 ml par centimètre carré de milieu supplémenté (DMEM / HAM F12 complété avec de l'insuline, la transferrine, sélénium (SES-X, 1%), l'EGF (50 ng / ml) et FGF2 (50 ng / ml)).
4. Deux à cinq jours plus tard, de collecter les sphères de cellules flottantes et soit re-plaque ou les dissocier avant la greffe dans des modèles animaux de la thérapie cellulaire.
5. Pour différencier les cellules souches olfactives dans les neurones comme des cellules, les cultiver pendant 21 jours dans un milieu contenant Neurobasal B-27, la pénicilline, la streptomycine, la glutamine et le glutamate.
6. Puis faire des changements moyenne tous les 3 jours. Neuron-comme des cellules devrait apparaître au bout de deux à trois semaines.

5. Les résultats représentatifs:

Nasale humaine explant-l'étroit cellules souches (figure 2A) sont divisant rapidement et de confluence peut être atteint en une à deux semaines. Une caractéristique clé du caractère souche, expression de la nestine, a été évaluée (figure 2B). Lorsqu'il est cultivé sur des poly-L-lysine avec un milieu de culture sans sérum complété par l'EGF (50 ng / ml) et FGF2 (50 ng / ml), les cellules souches olfactives donnent lieu à des sphères (figure 2C). Lorsqu'il est cultivé dans le milieu de culture contenant du sérum nouvellement sphères plaquées donner lieu à des cellules exprimant la GFAP-(~ 50%), les cellules exprimant la tubuline (~ 10-15%) et O4 cellules exprimant (~ 2-5%) ⁹ (figures 2D-F). Cependant, le sort de la sphère de cellules dérivées peuvent être modifiés. Par exemple, lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu de culture Neurobasal complétée par B27 et le glutamate, la plupart des cellules souches olfactives nasales en neurones, comme les cellules exprimant la tubuline β-III (figure 2G) et MAP2 (figure 2H).

Figure 1. Diagramme d'ensemble de l'expérience. Olfactive des biopsies muqueuses sont excisés de rat ou humains cavité nasale. Explants peut être utilisé en soi pour les études comparatives moléculaires visant à identifier des biomarqueurs dans les maladies du cerveau. Pour isoler des cellules souches olfactives, les interactions entre la lamina propria et le neuro-épithélium sont perturbés avec l'enzyme dispase II et, après 45 minutes, l'épithélium est enlevé avec une spatule de micro-. Cellules souches olfactives rongeurs sont davantage sélectionnés en dissociant la lamina propria par la collagénase IA. Pour les tissus humains, des morceaux de la lamina propria olfactifs sont cultivées dans la lamelle de verre jusqu'à l'étroit envahissent les cellules souches dans l'ensemble bien. Après la prolifération, en utilisant un milieu de culture approprié, les cellules souches olfactives peuvent générer des sphères ou se différencier en neurones comme des cellules. Les cellules souches olfactives peuvent être utilisés pour i) les maladies du cerveau de réparation ou d'un traumatisme ou ii) identifier des marqueurs moléculaires de maladies du système nerveux central. Les illustrations sont faites avec l'aide de Servier Medical Art.

Figure 2. Culture et de la différenciation des cellules souches humaines nasales olfactif. Les cellules souches humaines de plus en plus hors de la lamina propria explant (A) sont divisant rapidement, lorsqu'elles sont cultivées dans un milieu contenant du sérum. Les cellules souches expriment le marqueur de caractère souche nestine (B). Lorsque plaqué sur la poly-L-lysine en plastique et cultivées dans un milieu de culture sans sérum complété par l'EGF et FGF2, les cellules souches olfactives générer des sphères (C). Sphère des cellules dérivées, quand plaqués en milieu de culture contenant du sérum, donner lieu à des cellules exprimant la GFAP-(~ 50%), les cellules exprimant la tubuline (~ 10-15%) et O4 cellules exprimant (~ 2-5%) ⁹ (DF). Lorsqu'il est cultivé dans un milieu de culture Neurobasal complétée par B27 et le glutamate, ils se différencient en neurones, comme les cellules exprimant la tubuline β-III (G) et MAP2 (H).

Discussion

Les techniques présentées ici font le rongeur et humaine muqueuse olfactive un modèle utile pour la recherche clinique sur les causes des maladies neurologiques et neurodégénératives ainsi que d'un outil pour réparer le cerveau pathologique ou traumatisés. Le protocole est relativement simple et peut être facilement réalisée par un biologiste cellulaire expérimentés. Le taux de réussite pour les techniques de biopsie et de la culture est élevé.

Les étapes critiques

• Pour la collecte de la muqueuse olfactive chez les rongeurs, il est recommandé de ne pas dépasser un délai de 10 minutes entre l'euthanasie et l'excision finale du tissu olfactif.
• La dissociation de la lamina propria rongeurs olfactive est habituellement obtenue après 10 min. incubation dans la collagénase IA. Sinon, nous vous recommandons de rassembler le lendemain du surnageant dans lequel les bits non dissocié du flottant de la lamina propria, il centrifuger à 200 g et mécaniquement dissocier la lamina flottante à l'aide d'une pipette Pasteur, avant replating les cellules dans un nouveau puits. Le premier puits contenant les cellules déjà fixé est rempli de milieu de culture frais.
• Pour la lamina propria humain, qui est plus compact que le tissu des rongeurs, nous ne recommandons pas une dissociation enzymatique. Le tissu est coupé en tranches et chaque explant est inséré entre le fond du plat en plastique et une lamelle de verre. Cultures réussies comprennent explants dont l'épaisseur allant de 200 à 500 um.

D'éventuelles modifications

• Le protocole actuel peut être légèrement modifiée afin de générer des neurones olfactifs in vitro. À cette fin, le neuro-épithélium n'est pas supprimé et la muqueuse olfactive est toute en tranches avec un hacheur McIlwain (200 um d'épaisseur). Chaque explant est plaqué dans un plat, partiellement séché pendant une heure et ensuite réhydraté avec un milieu de culture contenant du FCS. Pendant le placage après les premiers jours, les cellules épithéliales et mésenchymateuses se développer hors de l'explant. Ensuite, les progéniteurs des neurones vont migrer sur le dessus de cette couche de cellules et de se différencier en neurones.
• Purification des cellules souches olfactives peuvent être obtenus en utilisant la cytométrie de flux. Marqueurs de surface spécifiques peuvent être extraites de la liste publiée dans le journal ¹¹ de caractérisation.
• Pour les expériences de transplantation, il est possible d'utiliser une souche de rats dont les cellules olfactives souches sont GFP-positives. Cette souche de rat (Sprague-Dawley, eGFP entraîné par le promoteur PGK) est disponible à ITERT (Nantes, France). Pour l'insertion du gène GFP dans les cellules souches olfactives, nous utilisons une méthode basée sur l'infection des lentivirus.
• Ce document est axé sur les cellules souches olfactives ecto-mésenchymateuses. Cependant, un autre type cellulaire d'intérêt, les cellules olfactives engainantes, peut être purifiée à partir du même tissu. Nous avons décrit une méthode pour leur collecte et l'épuration ^1,17 et nous avons utilisé des cellules engainantes nasales humaines pour une phase I / IIa d'essais cliniques chez des patients paraplégiques ^18.
• En tant que membre de la superfamille des cellules souches mésenchymateuses, OE-MSC sont capables, dans des conditions de culture approprié, de se différencier en adipocytes, ostéocytes et les myocytes ^11.

Les applications futures

• Nous avons déjà utilisé des biopsies humaines olfactifs pour étudier les anomalies cellulaires et moléculaires chez les patients souffrant d'autisme, le trouble bipolaire, la dysautonomie familiale, la maladie de Parkinson, maladie d'Alzheimer et la schizophrénie ^2-7. Théoriquement, toutes les maladies du cerveau peut être étudiée en utilisant des biopsies nasales ou de cellules souches périphériques olfactif.
• Rongeurs et les cellules souches humaines nasales olfactifs ont déjà été greffées dans des modèles animaux de l'amnésie, la maladie de Parkinson, lésions cochléaires et les traumatismes de la moelle épinière ^12-16. Il est concevable de transplanter ces cellules dans des modèles animaux de la maladie d'Alzheimer, l'ischémie cérébrale, sclérose en plaques.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue
Collection de la muqueuse olfactive chez les rats
DMEM / HAM F12	Invitrogen	31331-028
Pentobarbital sodique
Rongeur	TSF
Aiguille de calibre 26	Terumo	NN-2613R
Forceps
Collection de la muqueuse olfactive chez l'homme
Endoscope rigide	Karl Storz ou Richard Wolf Medical
La lidocaïne
L'épinéphrine
Throughcut ethmoïde pince	Karl Storz ou Richard Wolf Medical
L'isolement des cellules souches olfactives
Dispase II	Roche	10 295 825 001
Microscope à dissection
Micro spatule en	TSF
Collagénase IA	Sigma-Aldrich	C9891
Ca-free/Mg-free PBS	Invitrogen	14190-250
Sérum de veau fœtal	Invitrogen	10270098
Verre lamelle	Knittel Glaser	001/35
Formation de Sphère et la différenciation neuronale
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P-1274
L'insuline transferrine sélénium (SES)	Invitrogen	51500056
EGF	R & D Systems	236-EG
FGF2	R & D Systems	233-FB
Milieu Neurobasal	Invitrogen	21103-049
B-27 sans sérum Supplément	Invitrogen	17504-044
Pénicilline / streptomycine	Invitrogen	15140122
Glutamine	Invitrogen	25030024
Le glutamate	Sigma-Aldrich