げっ歯類やヒトから鼻嗅覚幹細胞を単離する

要約

ここでは、ラットおよびヒトの鼻腔から嗅粘膜をbiopsyingための方法を説明します。これらの生検は、脳疾患の分子異常を識別したり、脳の外傷/疾患の動物モデルの細胞移植に利用することができる多能性成体幹細胞を単離するどちらにも使用できます。

要約

鼻腔にある嗅粘膜には、、匂いを検出するのを担当しています。また、外部環境にさらされると、すべての生存する個人で簡単にアクセスされている場合にのみ神経組織です。その結果、この組織は病理学的な脳内の分子の異常を特定したり、細胞治療のための成体幹細胞を分離することを目指し、誰のためにユニークです。

脳疾患の分子異常がしばしば事後収集した神経組織のサンプルを用いて研究しています。しかし、この材料は多くの制限があります。対照的に、嗅粘膜は容易にアクセス可能であり、臭い¹の感覚を失うことなく、安全に生検を実施することができます。したがって、嗅粘膜は1つが発達勉強できるような大人のヒト（例えば自閉症、統合失調症^）2-4または神経変性（例えば、パーキンソン、アルツハイマー病^）4,5疾患で、"開いているウィンドウを"提供します。嗅粘膜は^4,6どちらの比較分子研究のためにまたは神経新生^3,7でin vitroの実験で使用することができます。

嗅上皮はまた、ウイルス感染症の細菌汚染によって損傷されているものを、置き換えるために毎日新しいニューロンを生み出す神経組織です。この永久的な神経発生は、前駆細胞によって支えだけでなく、すなわち粘膜、神経上皮および基礎となる固有層^8-10の両方のコンパートメント内に存在する幹細胞れている。我々は最近、粘膜固有層にある成体幹細胞を精製する方法を開発し、それらが密接に骨髄間葉系幹細胞（BM - MSC）に関連していることを実証した後、我々は（彼らの嗅覚エ​​クト - 間葉系幹細胞を命名OE - ^MSC）11。

興味深いことに、BM - MSCに比較した場合、OE - MSCは、高い増殖率、上昇clonogenicityと神経細胞に分化する傾向を表示します。我々は統合失調症とパーキンソン病の⁴の新しい候補遺伝子を明らかにする専用の研究を行うためにこれらの特性を利用した。我々と他にもOE - MSCは、脊髄の外傷^12,13、人工内耳損傷^14日以降またはパーキンソン病¹⁵または健忘症¹⁶の動物モデルにおいて、細胞治療のための候補者を約束していることが示されている。

本研究では、我々はラットとヒトでの嗅粘膜の生検する方法を提示する。収集した後、粘膜固有層は、酵素的に上皮と幹細胞から分離されている酵素的または非酵素的方法を用いて精製されています。精製された嗅覚幹細胞は、どちらの大量に増殖させ、液体窒素でバンクレジスタまたは球を形成したり、神経細胞に分化誘導することができる。これらの幹細胞はまた、比較オミクス（プロテオーム、エピ、トランスクリプトーム、ゲノム）研究に使用することができます。

プロトコル

1。ラット嗅粘膜のコレクション

1. 純粋培養フードのDMEM / HAM F12培養液で満たさthree 35ミリメートルのペトリ皿を準備することから始めます。
2. 安楽死のいずれかの方法は、金融機関の動物のケアと使用に関する委員会で事前に承認を受けた有資格者によって実施されている必要があります。ラットではそのようなケタミン/キシラジンとして麻酔のペントバルビタールナトリウムまたは他の注射の形態で深い麻酔を入力した後、頭部を除去すると皮膚を取り除く。吸入麻酔薬は避けるべきである。麻酔の妥当性は斬首前につま先のピンチによって評価される。はさみで下顎を外して、骨鉗子の助けを借りて、両側の顔面の筋肉を排除。
3. 切歯の後ろから始めて、骨鉗子で鼻腔、一度に片側を覆って骨を取り除く。嗅覚甲介は鼻の奥にあるオレンジ/茶色の器官として見えてくる。
4. 繊細な鉗子で甲を捨てる。垂直板、篩板と鼻腔の天井の弧：26ゲージの針を使用して、3つの線に沿って組織を切断することにより隔壁に横たわって嗅粘膜を分離する。
5. 両側に生検を収集し、DMEM / HAM F12を充填したシャーレに移す。この手順では、発症の安楽死から10分を上回ってはいけません。
6. 今、粘液を除去するために、培地充填ペトリ皿に生検を2回転送する。

2。ヒトの嗅粘膜のコレクション

1. この手順は、関連するローカル倫理委員会（S）に準拠して、耳、鼻、喉（ENT）外科医によって行われるべきである、とすべての外来患者はインフォームドコンセントのフォームに署名する必要があります。
2. 0 °または30 °硬性内視鏡（直径4mm）を使用して、鼻腔の両方を検査し、ポリープまたは炎症性病変の推定存在を評価する。考慮中隔の偏差を取って、最高の鼻腔を選択してください。
3. 綿棒を使用して、10分間、エピネフリンとリドカイン等の局所麻酔薬を、適用する。
4. throughcut篩骨鉗子で、中鼻甲介の内側面のルートまたは背内側領域における隔壁上にどちらか一方平方ミリメートル生検を収集する。
5. 嗅覚生検は、その後、DMEM / HAM F12を1 mlを充填した滅菌を2 mlのチューブに、滅菌針を用いて、転送されます。生検を培養培地に浸漬されていることを確認するために逆さにチューブを傾ける。
6. 冷蔵コンテナでチューブを挿入し、研究室に移送。この段階では、生検は、特定の脳の疾患に焦点を当てたり、幹細胞を生成するための処理の比較分子生物学的研究のためにそれ自体使用することができます。

3。ヒトおよびラット粘膜から嗅覚幹細胞の単離

1. DMEM / HAM F12で生検を洗ってください。 37℃で1時間、ディスパーゼIIソリューション（2.4 IU / ml）を1mlで満たしたシャーレに生検をインキュベート℃に
2. 次に、回折反転光と解剖顕微鏡下で、嗅上皮は、ミクロスパチュラを用いて、基礎となる固有層から削除されます。
3. 嗅上皮は薄く、オレンジ/茶色の縞模様である粘膜固有層に比べて黒い背景の上に半透明に見えます。白い背景の上、上皮は灰色と固有層、茶色に見えます。
4. 一度精製された、DMEM / HAM F12で満たされたシャーレに粘膜固有層を転送する。
5. 組織は、齧歯類からのものである場合には、2つの25ゲージの針で小さな断片に固有層をカット。その後、コラゲナーゼIA 1mlで満たした15mlのチューブに曲を転送する。
6. チューブに、滅菌したプラスチック製のピペットを使用して、組織を解離する。その後、37℃で10分間チューブをインキュベート℃に
7. 解離を終了するには、軽くチューブを揺すりとCa -無料およびMg -フリーPBSで5分間に200 gで遠心9 mlを加える。
8. 10％ウシ胎児血清、抗生物質やプラスチック製の培養皿上にプレートを添加したDMEM / HAM F12培地中で細胞ペレットを再懸濁します。
9. 今、組織が人間の場合は、後、200〜500μmのからの範囲の厚さ3〜4枚に固有層をスライス。
10. 独自の2 cmの直径の培養皿に各ストリップを挿入し、滅菌1.3センチメートルの直径のガラスカバースリップを持つ組織をカバーしています。
11. その後、各培養皿に培養液500μlの培地（DMEM / HAM F12、10％ウシ胎児血清と抗生物質を補充）を追加します。
12. いずれの組織型の場合は、2〜3日おき培養液を更新。
13. 5〜7日後に、幹細胞は、培養皿を侵略を開始し、二週間後に彼らがコンフルエントにする必要があります。 、通路に達し、培養フラスコに細胞を移すされている場合コンフルエント。

4。球の形成と神経Differe嗅覚幹細胞のntiation

1. 幹細胞の球を生成するには、37℃で2時間フラスコをインキュベートしますポリ- L -リジンとC。 （TEXT：5 g/cm2）。
2. プレート治療フラスコで平方センチメートルあたり16000細胞の密度で細胞。
3. 2日ごとに、培地の平方センチメートルあたり0.2ミリリットル（DMEM / HAM F12インスリン、トランスフェリン、セレン（ITS - X、1％）、EGF（50 ng / ml）およびFGF2（を添加した細胞を供給した50 ng / ml）を）。
4. 2〜5日後、浮遊細胞の球とのどちらかに再プレートを収集したり、細胞療法の動物モデルに移植する前にそれらを解離する。
5. ニューロン様細胞への嗅覚幹細胞を区別するには、B - 27、ペニシリン、ストレプトマイシン、グルタミン及びグルタミン酸を含むNeurobasal培地で21日間飼育。
6. その後、3日毎に培地の変更を行います。ニューロン様細胞は2〜3週間後に表示されます。

5。代表的な結果：

鼻人間の外植片- outgrowing幹細胞が（図2A）急速に分裂していると、コンフルエントは1週間から2週間以内で到達できます。 stemnessの主要な機能の1つ、ネスチンの発現は、（図2B）を評価した。 EGF（50 ng / ml）およびFGF2（50 ng / mlの）を添加した無血清培地によるポリ- L -リジンで増殖させた場合、嗅幹細胞は、球体（図2C）を生じさせる。血清含有培地中で増殖させた場合、新たにメッキの球は、GFAP発現細胞を（〜50％）、チューブリン発現細胞（〜10〜15％）とO4 -発現細胞を（〜2から5パーセント^）9（図を生じさせる2D - F）。しかし、球由来細胞の運命を変更することができます。例えば、B27とグルタミン酸、β- IIIチューブリン（図2G）とMAP2（図2H）を発現するニューロン様細胞への鼻の嗅覚幹細胞のほとんどを補充Neurobasal培地で増殖させた場合。

図1実験の全体的なスキーム。嗅粘膜の生検は、ラットやヒトの鼻腔から切除されています。外植片は、脳疾患のバイオマーカーを同定することを目的と比較分子生物学的研究のためにそれ自体使用することができます。嗅覚幹細胞を単離するために、粘膜固有層と神経上皮との相互作用は、ディスパーゼIIの酵素で破砕されていると、45分後、上皮はマイクロスパチュラで削除されます。げっ歯類の嗅覚幹細胞は、さらにコラゲナーゼIAで粘膜固有層を解離によって選択されています。 outgrowing幹細胞がうまく全体を侵略するまで、人間の組織の場合は、嗅粘膜固有層の部分は、ガラスのカバースリップの下に培養される。増殖した後、適切な培地を用いて、嗅覚の幹細胞は、球を生成することができますまたはニューロン様細胞に分化する。嗅覚幹細胞は、iに使用することができます）修理の脳の疾患や外傷、またはii）中枢神経系の疾患の分子マーカーを特定する。イラストは、セルヴィエメディカルアートの助けを借りて作られています。

図2。文化と鼻の人間の嗅覚幹細胞の分化。粘膜固有層の植（）の外に増殖するヒト幹細胞は、血清含有培地で培養したとき、急速に分裂している。幹細胞はstemnessマーカーネスチン（B）を発現。ときにポリ- L -リジンコートしたプラスチックの上にプレーティングし、EGFとFGF2を添加した無血清培地で培養し、嗅覚幹細胞は球体（C）を生成する。球由来の血清を含む培養培地に播種した細胞、GFAP発現を生じさせる細胞を（〜50％）、チューブリン発現細胞（〜10〜15％）とO4 -発現細胞（〜2から5パーセント） ^9（DF）。 B27とグルタミン酸を添加したNeurobasal培養培地中で増殖させた場合、それらはβ- IIIチューブリン（G）とMAP2（H）を発現するニューロン様細胞に分化する。

ディスカッション

テクニックは、げっ歯類とヒトの嗅粘膜神経発達と神経変性疾患の原因だけでなく、病理学や心に傷を負った脳を修復するためのツールへの臨床研究のための有用なモデルを作るここで紹介。プロトコルは比較的簡単であり、容易に経験豊富な細胞生物学者によって行うことができる。生検と培養技術の成功率は高いです。

重要なステップ

• げっ歯類の嗅粘膜のコレクションの場合、それは安楽死と嗅覚組織の最終的な切除の間に10分の時間制限を超過しないことをお勧めします。
• げっ歯類の嗅覚粘膜固有層の解離は、通常、10分後に達成される。コラゲナーゼIAでインキュベーション。そうでない場合、我々は固有層のフロートの解離ビットの上清の翌日に収集することをお勧めします、200 gでそれを遠心分離し、機械的にも新たに細胞を再播種する前にパスツールピペットを用いて浮動ラミナを解離する。すでに付着した細胞を含む最初のウェルは、新鮮な培養液で満たされている。
• げっ歯類の組織よりもコンパクトです、人間の固有層、のために、我々は、酵素的解離はお勧めしません。組織はスライスされ、それぞれの外植片は、プラスチック製の皿の底とガラスのカバースリップの間に挿入されます。成功した文化は、その厚さの範囲は200〜500μmの外植片を含む。

実行可​​能な変更

• 現在のプロトコルは、わずかにin vitroで嗅覚ニューロンを生成するために変更することができます。その目的のために、神経上皮は削除されていないと全体の嗅粘膜は、マッキルウェーンのチョッパー（200μmの厚さ）にスライスする。それぞれの外植片は、シャーレに播種し部分的に1時間乾燥し、FCS含有培地で再水和されています。最初の日のポストプレー中に、上皮と間葉系細胞は、外植片から成長。その後、ニューロンの前駆細胞はこの細胞層の上に移動し、ニューロンに分化する。
• 嗅覚幹細胞の精製は、フローサイトメトリーを用いて達成することができます。特定の表面マーカーは、特性の紙¹¹に発表されたリストから取得することができます。
• 移植実験のために、それは嗅覚幹細胞がGFP陽性のラットの系統を使用することが可能です。このラット系統は、（スプラーグドーリー、eGFPのPGKプロモーターによって駆動される）ITERT（ナント、フランス）で利用可能です。人間の嗅覚幹細胞にGFP遺伝子を挿入するため、我々は、レンチウイルスの感染に基づいてメソッドを使用します。
• 本論文では、嗅覚エクト - 間葉系幹細胞に焦点を当てています。しかし、興味の別のセルのタイプ、嗅覚鞘細胞は、同じ組織から精製することができる。我々は、彼らのコレクションと精製^1,17のための方法を説明し、我々は対麻痺患者¹⁸の段階I / IIaの臨床試験のために人間の鼻鞘細胞を使用していました。
• 間葉系幹細胞のスーパーファミリーのメンバーとして、OE - MSCは、脂肪細胞、骨細胞や心筋細胞¹¹に区別するために、適切な培養条件で、可能です。

将来のアプリケーション

• 我々はすでに自閉症、双極性障害、家族性自律神経失調症、パーキンソン病、アルツハイマー病や統合失調症^2-7患者における細胞と分子の異常を研究するために、人間の嗅覚生検を使用している。理論的には、すべての脳疾患は、鼻生検または末梢嗅幹細胞を用いて研究することができます。
• げっ歯類と人間の鼻の嗅覚幹細胞はすでに健忘症、パーキンソン病、人工内耳の損傷や脊髄の外傷^12月16日の動物モデルに移植されています。それは、アルツハイマー病、脳虚血、多発性硬化症の動物モデルにこれらの細胞を移植することが考えられる。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号
ラットの嗅粘膜のコレクション
DMEM / HAM F12	インビトロジェン	31331-028
ペントバルビタールナトリウム
骨鉗子	FST
26ゲージの針	テルモ	NN - 2613R
鉗子
ヒトの嗅粘膜のコレクション
硬質内視鏡	カールストルツやリチャードウルフ医療
リドカイン
エピネフリン
Throughcut篩骨鉗子	カールストルツやリチャードウルフ医療
嗅覚幹細胞の分離
ディスパーゼII	ロッシュ	10 295 825 001
解剖顕微鏡
マイクロスパチュラ	FST
コラゲナーゼIA	シグマアルドリッチ	C9891
Ca-free/Mg-free PBS	インビトロジェン	14190-250
ウシ胎児血清	インビトロジェン	10270098
ガラスカバースリップ	クニッテルグレイザー	001/35
球の形成と神経分化
ポリ- L -リジン	シグマアルドリッチ	P - 1274
インスリン、トランスフェリン、セレン（ITS）	インビトロジェン	51500056
EGF	R＆Dシステムズ	236 - EG
FGF2	R＆Dシステムズ	233 - FB
Neurobasal培地	インビトロジェン	21103-049
B - 27無血清サプリメント	インビトロジェン	17504-044
ペニシリン/ストレプトマイシン	インビトロジェン	15140122
グルタミン	インビトロジェン	25030024
グルタミン酸	シグマアルドリッチ