Aislar las células madre olfativo nasal de los roedores o los seres humanos

Resumen

Se describe aquí un método para la biopsia de mucosa olfatoria de ratas y humanos cavidades nasales. Estas biopsias se pueden utilizar tanto para la identificación de anomalías moleculares en las enfermedades cerebrales o el aislamiento de células madre adultas multipotentes que pueden ser utilizados para el trasplante de células en modelos animales de trauma cerebral / enfermedad

Resumen

La mucosa olfatoria, que se encuentra en la cavidad nasal, se encarga de detectar olores. También es el único tejido nervioso que se encuentra expuesta al ambiente externo y de fácil acceso en todos los individuos que viven. Como resultado, este tejido es único para cualquier persona con el objetivo de identificar las anomalías moleculares en el cerebro patológico o aislar las células madre adultas para la terapia celular.

Alteraciones moleculares en las enfermedades cerebrales son estudiados a menudo usando muestras de tejido nervioso recogido post-mortem. Sin embargo, este material tiene numerosas limitaciones. Por el contrario, la mucosa olfativa es de fácil acceso y puede hacer una biopsia de forma segura sin ningún tipo de pérdida del sentido del olfato ^1. En consecuencia, la mucosa olfativa ofrece una "ventana abierta" en el adulto humano a través del cual se puede estudiar el desarrollo (autismo, la esquizofrenia, por ejemplo,) ^2-4 o neurodegenerativas (como Parkinson, Alzheimer) enfermedades ^4,5. Mucosa olfatoria se puede utilizar ya sea para estudios comparativos molecular ^4,6 o en experimentos in vitro sobre la neurogénesis ^3,7.

El epitelio olfativo es también un tejido nervioso que produce nuevas neuronas cada día para reemplazar a aquellos que están dañados por la contaminación, bacterias de infecciones virales. Esta neurogénesis permanente se sustenta por los progenitores, sino también las células madre que residen dentro de los dos compartimientos de la mucosa, es decir, la neuroepithelium y el ^10.8 lámina propia subyacente. Recientemente hemos desarrollado un método para purificar las células madre adultas ubicados en la lámina propia y, después de haber demostrado que están estrechamente relacionadas con las células mesenquimales de la médula ósea (BM-MSC), que nombró olfativa ecto-mesenquimal de células madre (OE- MSC) ^11.

Curiosamente, en comparación con el BM-MSC, OE-MSC mostrar una tasa de proliferación de alto, un clonogenicidad elevado y una inclinación de diferenciarse en células neuronales. Nos aprovechamos de estas características para llevar a cabo estudios específicos para dar a conocer nuevos genes candidatos en la esquizofrenia y la enfermedad de Parkinson ^4. Nosotros y otros han demostrado también que la OE-MSC son candidatos prometedores para la terapia celular, después de un traumatismo de la médula espinal ^12,13, un daño coclear en un ¹⁴ o modelos animales de enfermedad de Parkinson ¹⁵ o amnesia ^16.

En este estudio, se presentan los métodos de biopsia de mucosa olfatoria en ratas y humanos. Después de la recolección, la lámina propia es enzimáticamente separada del epitelio y las células madre se purifican mediante un enzimáticos o un método no enzimático. Purificada de células olfativas madre pueden ser cultivadas en grandes cantidades y en bancos en nitrógeno líquido o inducidas a formar esferas o diferenciarse en células neuronales. Estas células madre también se pueden utilizar para ómicas comparativa (genómica, transcriptómica, epigenómico, proteómica) los estudios.

Protocolo

1. Colección de mucosa olfatoria en ratas

1. Empezar por la elaboración de tres placas de Petri de 35 mm llena de DMEM / HAM F12 medio de cultivo en una campana de cultivo limpio.
2. Cualquier método de eutanasia debe ser aprobado previamente por el cuidado de animales de la institución y el uso comisión y llevado a cabo por personal cualificado. Después de la rata ha entrado en una anestesia profunda con el sodio pentobarbital formas inyectables o de otro tipo de anestesia, como la ketamina / xilazina, decapitar y quitar la piel. Anestésicos inhalados deben ser evitados. Adecuación de la anestesia será evaluada por una pizca dedo antes de la decapitación. Retire la mandíbula inferior con unas tijeras y con la ayuda de una gubia, eliminar los músculos faciales en ambos lados.
3. A partir de la parte posterior de los incisivos, retire con una gubia del hueso que cubre la cavidad nasal, de un lado a la vez. Los cornetes olfativa entrar en la vista como el naranja / marrón órganos situados en la parte posterior de la nariz.
4. Delicadamente descartar los cornetes con una pinza. Usando una aguja de calibre 26, aislar la mucosa olfatoria tendido en el tabique al cortar el tejido a lo largo de tres líneas: el arco de la placa perpendicular, la lámina cribiforme y el techo de la cavidad nasal.
5. Recoger las biopsias de ambos lados y la transferencia en un DMEM / HAM F12 lleno de placa de Petri. Este procedimiento no debería tardar más de 10 minutos de la eutanasia inicio.
6. Ahora, con el fin de eliminar la mucosidad, la transferencia de las biopsias de dos veces en medio lleno de placas de Petri.

2. Colección de mucosa olfatoria en los seres humanos

1. Este procedimiento debe ser realizado por un Oído, nariz y garganta (ENT), cirujano, de acuerdo con las disposiciones pertinentes de ética local del comité (s), y todos los pacientes ambulatorios deben firmar un formulario de consentimiento informado.
2. El uso de un 0 ° o 30 ° endoscopio rígido (4 mm de diámetro), inspeccione ambas cavidades nasales y evaluar la presencia putativa de pólipos o de cualquier lesión inflamatoria. Elige la mejor cavidad nasal, teniendo en cuenta la desviación del tabique.
3. Utilizando un aplicador de algodón, aplicar un anestésico local, como la lidocaína con epinefrina, durante 10 minutos.
4. Con unas pinzas etmoidal throughcut, se recoge una biopsia de dos milímetros cuadrados, ya sea en la raíz de la cara medial del cornete medio o en el tabique en la zona dorsomedial.
5. El olfato biopsia se transfiere, utilizando una aguja estéril, en un tubo estéril de 2 ml llena de 1 ml de DMEM / HAM F12. Punta del tubo hacia abajo para asegurarse de que la biopsia se encuentra inmerso en el medio de cultivo.
6. Inserte el tubo en un contenedor refrigerado y transporte al laboratorio de investigación. En esta etapa, la biopsia se puede utilizar por sí mismo para estudios comparados molecular centrado en enfermedades específicas del cerebro o procesados ​​para la generación de células madre.

3. Aislamiento de células madre olfativa de humano y de rata Mucosa

1. Lave las biopsias en DMEM / HAM F12. Incubar las biopsias en una placa de Petri llena con 1 ml de solución dispasa II (2,4 UI / ml), durante 1 hora a 37 ° C.
2. A continuación, en un microscopio de luz invertida con una difracción, el epitelio olfativo se retira de la lámina propia subyacente con una espátula de micro.
3. El epitelio olfativo es más delgada y se ve transparente sobre un fondo negro en comparación con la lámina propia, que es a rayas de color naranja / marrón. Sobre un fondo blanco, el epitelio se ve gris y la lámina propia, marrón.
4. Una vez purificada, la transferencia de la lámina propia en una placa de Petri llena de DMEM / HAM F12.
5. Si el tejido es de un roedor, a continuación, cortar la lámina propia en pequeños trozos con dos agujas de calibre 25. Entonces, la transferencia de las piezas a un tubo de 15 ml llena de 1 ml de colagenasa IA.
6. En el tubo, usando una pipeta de plástico estéril, disociar el tejido. A continuación, se incuba el tubo durante 10 minutos a 37 ° C.
7. Para terminar la disociación, agite con cuidado el tubo y agregar 9 ml de Ca-Mg libre y PBS libre y centrifugar a 200 g durante 5 minutos.
8. Resuspender el botón celular en DMEM / HAM F12 medio de cultivo complementado con suero bovino fetal al 10%, los antibióticos y la placa en placas de cultivo de plástico.
9. Ahora bien, si el tejido es humano, entonces parte de la lámina propia en 3 a 4 piezas con un grosor de entre 200 a 500 micras.
10. Insertar cada tira en su propio plato de 2 cm de diámetro y la cultura cubrir el tejido con hojas estériles 1,3 cm de diámetro cubierta de vidrio.
11. A continuación, añadir 500 l de medio de cultivo (DMEM / HAM F12 suplementado con suero bovino fetal al 10% y antibióticos) para cada placa de cultivo.
12. Para cualquier tipo de tejido, renovar el medio de cultivo cada 2 ó 3 días.
13. De cinco a siete días después, las células madre comienzan a invadir la placa de cultivo y después de dos semanas deben ser confluentes. Cuando se llega a la confluencia, la aprobación y la transferencia de las células a frascos de cultivo.

4. Ámbito de formación y difere neuronalntiation olfativo de las células madre

1. Para generar ámbitos de células madre, se incuban los frascos durante dos horas a 37 ° C, con poli-L-lisina. (TEXTO: 5 g/cm2).
2. Placa de las células a una densidad de 16.000 células por centímetro cuadrado en los frascos tratados.
3. Cada dos días, se alimentan de las células con 0,2 ml por centímetro cuadrado de medio suplementado (DMEM / HAM F12 suplementado con insulina, transferrina, el selenio (ITS-X, 1%), EGF (50 ng / ml) y FGF2 (50 ng / ml)).
4. De dos a cinco días más tarde, recoger esferas flotantes de células y, o bien la placa de re-o se disocian antes de injerto en modelos animales de la terapia celular.
5. Para diferenciar las células madre en neuronas olfativas-como las células, las cultivan durante 21 días en un medio que contiene Neurobasal B-27, la penicilina, la estreptomicina, glutamina y glutamato.
6. De hacer cambios en el medio cada 3 días. Neuronas como células deben aparecer después de dos a tres semanas.

5. Los resultados representativos:

Nasal humano explante, superando las células madre (Figura 2) se dividen rápidamente y se puede llegar a la confluencia en una o dos semanas. Una característica clave de la troncalidad, nestin expresión, fue evaluado (Figura 2B). Cuando se cultiva en poly-L-lisina con un medio de cultivo libre de suero suplementado con EGF (50 ng / ml) y FGF2 (50 ng / ml), las células olfativas madre dan lugar a las esferas (figura 2C). Cuando se cultiva en medio de cultivo que contiene suero recién esferas plateado dar lugar a células que expresan GFAP (~ 50%), las células que expresan la tubulina (~ 10-15%) y O4, que expresan las células (~ 5.2%) ⁹ (Figuras 2D-F). Sin embargo, el destino de las células derivadas de esfera puede ser modificada. Por ejemplo, cuando se cultivan en un medio de cultivo Neurobasal complementado con B27 y el glutamato, la mayoría de las células madre en neuronas olfativas nasal-como las células que expresan β-tubulina III (Figura 2 G) y MAP2 (Figura 2H).

Figura 1. Esquema general del experimento. Biopsias de la mucosa olfativa son extirpados de ratas o de la cavidad nasal humana. Los explantes se puede utilizar por sí mismo para estudios comparativos con el objetivo molecular para identificar los biomarcadores en enfermedades del cerebro. Para aislar las células olfativas del tallo, las interacciones entre la lámina propia y el epitelio neuro-se interrumpió con la enzima dispasa II y, después de 45 minutos, el epitelio se retira con una espátula de micro. Las células madre son roedores olfativo más seleccionados por la disociación de la lámina propia con colagenasa IA. Para los tejidos humanos, pedazos de lámina propia olfatoria son cultivadas en cubreobjetos de vidrio hasta superando las células madre invaden todo bien. Después de la proliferación, utilizando un medio de cultivo adecuado, las células olfativas madre pueden generar esferas o diferenciarse en neuronas como las células. Células olfativas madre se pueden utilizar para: i) las enfermedades de la reparación cerebral o un traumatismo, o ii) la identificación de marcadores moleculares de enfermedades del sistema nervioso. Las ilustraciones están hechas con la ayuda de Servier arte médico.

Figura 2. Cultura y la diferenciación de células madre humanas nasales olfativas. Las células madre humanas que surgen de la lámina propia explante (A) se dividen rápidamente, cuando se cultivan en un medio que contiene suero. Las células madre expresan la troncalidad marcador nestina (B). Cuando se siembran en poli-L-lisina de plástico y se cultivan en un medio de cultivo libre de suero complementado con EGF y FGF2, las células olfativas madre generar ámbitos (C). Esfera células derivadas, cuando se siembran en el medio de cultivo que contiene suero, dan lugar a células que expresan GFAP (~ 50%), las células que expresan la tubulina (~ 10-15%) y O4, que expresan las células (~ 2.5%) ⁹ (DF). Cuando se cultiva en un medio de cultivo Neurobasal complementado con B27 y el glutamato, que se diferencian en neuronas como células que expresan β-tubulina III (G) y MAP2 (H).

Discusión

Las técnicas presentadas aquí hacen los roedores y la mucosa olfativa humana un modelo útil para la investigación clínica sobre las causas de las enfermedades del neurodesarrollo y neurodegenerativos, así como una herramienta para reparar el cerebro patológico o traumatizados. El protocolo es relativamente sencillo y puede ser fácilmente llevados a cabo por un biólogo celular de la experiencia. La tasa de éxito de las técnicas de biopsia y cultivo es alto.

Los pasos críticos

• Para la recogida de la mucosa olfatoria de roedores, se recomienda no exceder un límite de tiempo de 10 minutos entre la eutanasia y la escisión definitiva del tejido olfativo.
• La disociación de la propia lámina de roedores olfativa se logra generalmente después de 10 min. incubación en la colagenasa IA. Si no es así, se recomienda recoger al día siguiente del sobrenadante en el que los bits no disociado de acciones en circulación de la lámina propia, se centrifuga a 200 g y mecánicamente disociar la lámina flotante con una pipeta Pasteur antes de replating las células de un nuevo pozo. El primer pozo que contiene las células ya instalada está llena de medio de cultivo fresco.
• De la lámina propia humana, que es más compacto que el tejido de los roedores, no recomendamos una disociación enzimática. El tejido se corta y cada explante se inserta entre la parte inferior del plato de plástico y un cubreobjetos. Culturas exitosas incluyen explantes cuyo espesor rango 200 a 500 micras.

Posibles modificaciones

• El protocolo actual puede ser ligeramente modificada con el fin de generar neuronas olfativas in vitro. A tal efecto, la neuro-epitelio no se quita y la mucosa olfatoria todo se corta con un helicóptero McIlwain (200 micras de espesor). Cada explante se platea en un plato, parcialmente seco durante una hora y luego rehidratados con medio de cultivo que contienen FCS. Durante el forro días después de la primera, las células epiteliales y mesenquimales surgen de los explantes. Entonces, los progenitores neuronales migrarán en la parte superior de esta capa de células y se diferencian en neuronas.
• Purificación de las células madre olfativa se puede lograr mediante citometría de flujo. Marcadores específicos de superficie puede ser recuperada de la lista publicada en el documento de caracterización ^11.
• Para los experimentos de trasplante, es posible utilizar una cepa de ratones cuyas células olfativas madre son las buenas prácticas agrarias-positivas. Esta cepa de rata (Sprague Dawley, eGFP impulsada por el promotor PGK) está disponible en ITERT (Nantes, Francia). Para insertar el gen de la GFP en las células madre olfativa, se utiliza un método basado en la infección por lentivirus.
• Este documento se centra en las células madre olfativa ecto-mesenquimal. Sin embargo, otro tipo de célula de interés, las células olfativas ensheathing, puede purificar a partir del mismo tejido. Se describe un método para su obtención y purificación de ^1,17 y se utilizaron las células nasales ensheathing de una fase I / IIa de ensayos clínicos en pacientes parapléjicos ^18.
• Como miembro de la superfamilia de las células madre mesenquimales, OE-MSC son capaces, bajo condiciones de cultivo adecuadas, que se diferencian en adipocitos, osteocitos y los miocitos ^11.

Las futuras aplicaciones

• Ya hemos utilizado biopsias humanas olfativas para estudiar las anomalías celulares y moleculares en pacientes con autismo, trastorno bipolar, disautonomía familiar, enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer y la esquizofrenia ^2.7. En teoría, todas las enfermedades del cerebro pueden ser estudiados usando biopsias nasales o células madre periféricas olfativo.
• Roedores y las células madre olfativo nasal ya han sido injertados en modelos animales de la amnesia, la enfermedad de Parkinson, daño coclear y traumatismo de la médula espinal ^12-16. Cabe la posibilidad de trasplantar estas células en modelos animales de enfermedad de Alzheimer, isquemia cerebral, la esclerosis múltiple.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Colección de la mucosa olfatoria en ratas
DMEM / HAM F12	Invitrogen	31331-028
Pentobarbital sódico
Gubia	FST
26 calibre de la aguja	Terumo	NN-2613R
Fórceps
Colección de la mucosa olfatoria en los seres humanos
Endoscopio rígido	Karl Storz o Richard Wolf Médico
Lidocaína
Epinefrina
Throughcut etmoidal fórceps	Karl Storz o Richard Wolf Médico
Aislamiento de células madre olfativo
Dispasa II	Roche	10 295 825 001
Microscopio de disección
Espátula de micro	FST
Colagenasa IA	Sigma-Aldrich	C9891
Ca-free/Mg-free PBS	Invitrogen	14190-250
Suero fetal bovino	Invitrogen	10270098
Cubreobjetos de vidrio	Knittel Glaser	001/35
Ámbito de formación y diferenciación neuronal
Poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P-1274
La insulina de transferrina selenio (ITS)	Invitrogen	51500056
FEAG	R & D Systems	236-EG
FGF2	R & D Systems	233-FB
Medio Neurobasal	Invitrogen	21103-049
B-27 libre de suero Suplemento	Invitrogen	17504-044
Penicilina / estreptomicina	Invitrogen	15140122
Glutamina	Invitrogen	25030024
Glutamato	Sigma-Aldrich