설치류 또는 인간의 네이절 강한 줄기 세포를 분리

요약

우리는 여기서 쥐, 인간의 비강 충치의 후각 점막 조직 검사로 연구를 해왔하는 방법을 설명합니다. 이러한 biopsies은 뇌 질환의 분자 변이를 식별하거나 뇌 손상 / 질병의 동물 모델에 세포 이식을 위해 활용할 수 multipotent 성인의 줄기 세포를 분리하거나 사용할 수 있습니다.

초록

비강에있는 후각 점막은 감지 냄새 담당하고있다. 또한 외부 환경에 노출된 모든 살아있는 개인에 쉽게 액세스할 수있는 유일한 신경 조직이다. 결과적으로,이 조직은 병리 두뇌의 분자 변이를 식별하거나 세포 치료 성인 줄기 세포를 분리 목표로 사람에 대해 고유합니다.

뇌 질환의 분자 이상은 종종 사후 수집 신경 조직 샘플을 사용하여 연구하고 있습니다. 그러나,이 물질은 여러 가지 제한 사항이 있습니다. 반면, 후각 점막이 쉽게 액세스할 수 있으며 냄새 ¹ 감각의 손실없이 안전하게 biopsied 수 있습니다. 따라서, 후각 점막 하나 개발 공부를 할수있는 성인 인간 (예 : 자폐증, 정신 분열증) ^2-4 또는 neurodegenerative (예 : 파킨슨병, 알츠하이머) ^4,5 질병에 '열린 창문'을 제공합니다. 후각 점막은 neurogenesis ^3,7에 비교 분자 연구 ^4,6 또는 체외 실험에서 중 사용할 수 있습니다.

후각 상피는 또한 바이러스성 감염의 세균 오염에 의해 손상되는 이들을 대체하기 위해 매일 새로운 뉴런을 생산하는 신경 조직이다. 이것은 영구적인 neurogenesis는 progenitors에 의해 지속뿐만 아니라 즉 점막, neuroepithelium 및 기본 라미나 propria의 ^80-10의 두 구획 내에 거주하는 세포를 줄기입니다. 우리는 최근 라미나의 propria에있는 성인 줄기 세포를 정화하는 방법을 개발하고, 그들이 밀접하게 골수 mesenchymal 줄기 세포 (BM - MSC)와 관련된 것을 증명하는 데 후, 우리는 (그들 후각 외의 뜻 mesenchymal 줄기 세포라는 OE - MSC) ^11.

흥미롭게도, BM - MSCS 비교할 때, OE - MSCS는 높은 확산 속도, 고가 clonogenicity 및 신경 세포로 차별화하는 경향을 표시합니다. 우리는 정신 분열증과 파킨슨병 ^4의 새로운 후보 유전자를 공개하기 위해 전담 연구를 수행하는 이러한 특성을 이용했다. 우리와 다른 사람도 OE - MSCS는 척수의 외상 ^12,13, 달팽이 피해가 ¹⁴ 후 또는 파킨슨병 ¹⁵ 기억 상실 ¹⁶ 동물 모델에 세포 치료에 대한 후보자를 보증하는 것으로 나타났습니다.

본 연구에서는, 우리는 쥐가과 인간의 후각 점막을 생검하는 방법을 제시한다. 수집 후, 얇은 판의 propria은 효소 효소 또는 효소 이외의 방법을 사용하여 정화하는 상피와 줄기 세포를 분리합니다. 후각 줄기 세포를 정화하는 것은 다음 중 다수 재배하고 액체 질소에 틀었 또는 분야를 형성 유도 또는 신경 세포로 구분하실 수 있습니다. 이러한 줄기 세포는 또한 비교 omics (proteomic, 게놈 transcriptomic, epigenomic) 연구에 사용될 수 있습니다.

프로토콜

1. 쥐에 강한 점막 수집

1. 깨끗한 문화 모자 DMEM / 햄 F12 배지로 가득 세 35mm 페트리 요리를 준비하여 시작합니다.
2. 안락사의 방법은 기관의 동물 관리 및 사용위원회의 사전 승인 및 자격을 갖춘 직원에 의해 수행되어야합니다. 쥐의 이러한 마취제 / xylazine으로 마취의 나트륨 pentobarbital 또는 기타 주사용 형태와 깊은 마취를 입력한 후, 참살하고 피부를 제거합니다. 흡입 anesthetics은 피해야한다. 마취의 타당성이 잘린하기 전에 발끝 핀치에 의해 평가됩니다. 가위로 아래턱을 제거하고 rongeur의 도움으로, 양쪽에있는 얼굴 근육을 제거합니다.
3. incisors의 뒷면에서 시작 rongeur 비강, 한 번에 하나의 측면을 덮고있는 뼈 제거합니다. 오렌지 / 브라운 기관은 코 뒤쪽에 위치한으로 후각 turbinates가 보이기 시작하다.
4. 정교한 포셉로 turbinates 폐기하십시오. 수직 판, 소공 질의 판과 비강의 천장의 아크 : 26 게이지 바늘을 사용하여 세 줄을 따라 조직을 절단하여 심장에 누워 후각 점막을 분리.
5. 양쪽에 biopsies를 수집하고 DMEM / 햄 F12 - 가득한 페트리 접시에서 그들을 전송합니다. 이 절차는 발병 안락사에서 10 분 이상 안 걸릴 것입니다.
6. 자, 가래를 제거하기 위해, 중간 가득한 배양 접시에 biopsies 두 번 전송합니다.

2. 인간의 강한 점막 수집

1. 이 절차는 해당 지역 윤리위원회 (S)에 따라, 귀 코 스로트 (ENT) 외과 의사에 의해 실시되어야하고, 모든 외래는 정보 동의서에 서명해야합니다.
2. 0 ° 또는 30 ° 단단한 내시경 (4mm 직경)를 사용, 코와 충치를 모두 검사하고 폴립이나 염증성 병변의 putative 존재를 평가. 계정에 심장의 편차를 복용, 최고의 비강을 선택합니다.
3. 면화 작은 주걱을 사용하여 10 분, 에피네프린과 같은 lidocaine과 같은 국소 마취제를 적용할 수 있습니다.
4. throughcut 사골 집게와 가운데 turbinate의 중간 부분의 루트 또는 dorsomedial 지역에서 심장에 중 두 평방 밀리미터 생검를 수집합니다.
5. 후각 생검은 다음 DMEM / 햄 F12 1 ML 가득 살균이 ML 관에, 멸균 바늘을 사용하여 전송됩니다. 생검이 문화 매체에 잠겨 있는지 확인하기 위해 거꾸로 튜브를 팁.
6. 냉장 컨테이너에 튜브를 삽입하고 연구실에 수송. 이 단계에서는 생검은 특정 뇌 질환에 초점을 맞춘 또는 줄기 세포 생성에 대한 처리 비교 분자 연구 글 사용할 수 있습니다.

3. 인간과 쥐 점막에서 강한 줄기 세포의 분리

1. DMEM / 햄 F12에 biopsies 씻으십시오. 37 1 시간, dispase II 솔루션 (2.4 IU / ML) 1 ML 가득한 페트리 접시에 biopsies을 품어 ° C.
2. 다음 diffracted 거꾸로 조명과 해부 현미경, 후각 상피는 마이크로 주걱을 사용하여 기본 라미나의 propria에서 제거됩니다.
3. 후각 상피는 스트 라이프입니다 라미나의 propria에 비해 얇은이며 검은 배경 위에 반투명 보이는 주황색 / 갈색. 흰색 배경에 걸쳐 상피는 회색과 라미나의 propria, 갈색 보인다.
4. 일단 정화, DMEM / 햄 F12 가득한 페트리 접시에 얇은 판의 propria를 전송할 수 있습니다.
5. 조직은 설치류에서있다면,이 25 게이지 바늘로 작은 조각으로 라미나의 propria 잘라. 그런 다음, collagenase IA 1 ML 가득 15 ML 튜브에 조각을 전송합니다.
6. 튜브에서 멸균 플라스틱 피펫을 사용하여 조직을 떼어 놓다. 그렇다면, 37에서 10 분 동안 튜브를 품어 ° C.
7. 분리를 종료하려면, 부드럽게 튜브를 바위와 구 CA - 무료 MG - 무료 PBS의 ML과 5 분 200g에 원심 분리기를 추가합니다.
8. 플라스틱 문화 요리 10 % 태아 송아지 혈청, 항생제 및 플레이트와 함께 보충 DMEM / 햄 F12 배지에서 세포 펠렛을 Resuspend.
9. 이제 조직 인간있다면, 그때 200-500 μm의 이르는 두께 3-4 조각으로 라미나의 propria를 슬라이스.
10. 자체 2cm 직경 문화 요리에 각 스트립을 삽입하고 무균 1.3 cm 직경의 유리 커버 풀렸는데로 조직을 커버.
11. 그런 다음, 각 문화 요리에 배지 500 μl (DMEM / 햄 F12 10% 소태아 혈청과 항생제로 보충)을 추가합니다.
12. 어느 조직 유형에 대한 모든 2-3일 문화 매체를 갱신.
13. 5 ~ 7 일 후에, 줄기 세포는 문화 접시를 침공하기 시작하고 2 주 후에 그들이 합류한다. , 통로에 도달하고 문화 flasks에 전지를 전송할 때 confluency.

4. 영역의 형성과의 연결 Differe강한 줄기 세포의 ntiation

1. 줄기 세포 분야를 생성하려면, 37 두 시간 동안 flasks을 품어 ° 폴리 - L - 라이신과 C. (텍스트 : 5 g/cm2).
2. 취급 flasks에 cm2 당 16,000 세포의 밀도에 플레이트는 세포.
3. 이틀, 보충 매체 cm2 당 0.2ml (DMEM / 햄 F12 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄 (ITS - X, 1 %), EGF (50 NG / ML)과 FGF2 (와 보충으로 세포를 공급 50 NG / ML)).
4. 2 ~ 5 일 후, 부유 세포 분야 및 중 다시 플레이트를 수집하거나, 세포 치료의 동물 모델에 이식하기 전에 그들을 떼어 놓다.
5. 신경 세포와 같은 세포에 후각 줄기 세포를 차별화하는 데, B - 27, 페니실린, 스트렙토 마이신, 글루타민 및 글루 탐 산염을 포함 Neurobasal 매체를 21 일 동안 그들을 육성.
6. 그렇다면 매 3 일마다 중간 변경합니다. 신경 세포와 같은 세포 두 시간 3 주 후에 나타납니다.

5. 대표 결과 :

비강 인간 explant - 뚫고 나올 때까 줄기 세포 것은 (그림 2A) 급속도로 나누어하고 confluency가 1-2주 이내에 도달할 수 있습니다. stemness 중 하나는 주요 기능 nestin 발현은 (그림 2B) 평가했습니다. EGF (50 NG / ML)과 FGF2 (50 NG / ML)로 보충 혈청이없는 배지와 폴리 - L - 라이신에 성장하면 후각 줄기 세포 분야 (그림 2C)을 일으키다. 혈청 함유 배지에서 재배하면 새로 도금 분야는 GFAP - 표현 세포 (~ 50 %), tubulin - 표현 전지 (~ 10-15%)과 O4 - 표현 세포 (~ 2~5%) ⁹ (그림을 일으키다 2D - F). 그러나, 구체 파생 세포의 운명을 수정할 수 있습니다. 예를 들어, B27 및 글루 탐 산염, β - III의 tubulin (그림 2G)와 MAP2 (그림 2 시간)를 표현하는 신경 세포와 같은 세포로 비강 후각 줄기 세포의 대부분과 함께 보충 Neurobasal 배지 재배시.

그림 1. 실험의 전체 계획. 후각 점막의 biopsies는 쥐 또는 인간의 비강에서 excised 수 있습니다. Explants는 뇌 질환의 생체를 식별하는 목표 비교 분자 연구 글 사용할 수 있습니다. 후각 줄기 세포를 분리 들어, 라미나의 propria 및 신경 상피 사이의 상호 작용 45 분 후에 상피가 마이크로 주걱과 제거, dispase II 효소를 방해하고 있습니다. 쥐 후각 줄기 세포는 더욱 collagenase 아이오와 라미나의 propria를 dissociating으로 선택됩니다. 뚫고 나올 때까 줄기 세포가 아니라 전체를 침략하기 전까지 인간의 조직을 위해, 후각 라미나의 propria 조각은 유리 coverslip 아래 양식입니다. 증식 후, 적절한 배지를 사용하여 후각 줄기 세포 분야를 생성할 수 있습니다 또는 신경 세포와 같은 세포로 구분. 후각 줄기 세포는 내가하는 데 사용할 수있는) 수리 뇌 질환이나 외상 또는 II)는 중추 신경계 질환의 분자 마커를 식별합니다. 삽화는 Servier 의료 예술의 도움으로 만들어집니다.

그림 2. 문화와 비강 인간의 후각 줄기 세포의 분화. 혈청 함유 배지 재배시 라미나 propria explant (A) 밖으로 성장하는 인간의 줄기 세포가 빠른 속도로 나누어 있습니다. 줄기 세포는 stemness 마커 nestin (B)를 표현한다. 폴리 - L - 라이신 - 코팅 플라스틱에 도금 및 EGF와 FGF2와 보충 혈청이없는 배지에서 재배 때, 후각 줄기 세포 분야 (C)를 생성합니다. 영역 - 파생 세포, 혈청 함유 배지에서 도금 때 상승을주고 GFAP - 표현 세포 (~ 50 %), tubulin - 표현 전지 (~ 10~15%)과 O4 - 표현 세포 (~ 2~5%) ⁹ (DF). B27 및 글루 탐 산염과 보충 Neurobasal 문화 매체 재배 때, 그들은 β - III의 tubulin (G)와 MAP2 (H)를 표현하는 신경 세포와 같은 세포로 구분.

토론

기술 neurodevelopmental 및 neurodegenerative 질병뿐만 아니라 병적인이나 상처를 입었 머리를 수리하기위한 도구의 원인으로 설치류와 인간의 후각 점막 임상 연구에 유용한 모델을 만들고 제시. 프로토콜은 비교적 간단하고 쉽게 경험 세포 생물학에 의해 수행하실 수 있습니다. 생검과 문화 기술에 대한 성공률이 높습니다.

중요 단계

• 쥐 후각 점막의 수집을 위해, 그것은 안락사와 후각 조직의 최종 절단 사이에 10 분 시간 제한을 초과하지 않는 것이 좋습니다.
• 쥐 후각 라미나의 propria의 분리는 일반적으로 10 분 후에 이루어집니다. collagenase IA의 인큐베이션. 그렇지 않다면, 우리는 라미나의 propria 플로트의 undissociated 비트, 200g에 그것을 원심 분리기 및 기계식 잘 새에있는 세포를 replating 전에 파스퇴르 피펫을 사용하여 부동 라미나을 떼어 놓다있는 뜨는 다음날 수집하는 것이 좋습니다. 이미 첨부된 세포가 들어있는 첫 번째 잘은 신선한 문화 매체로 가득 차 있습니다.
• 쥐 조직보다 작고있는 인간 라미나의 propria을 위해, 우리는 효소 분해를하지 않는 것이 좋습니다. 조직은 슬라이스하고 각 explant은 플라스틱 접시의 바닥과 유리 coverslip 사이에 삽입됩니다. 성공적인 문화 그의 두께 범위는 200에서 500 μm의에 explants를 포함합니다.

가능한 수정

• 현재 프로토콜은 약간 체외에서 후각 신경을 생성하기 위해 수정할 수 있습니다. 그 목적은 신경 상피가 제거되지 않고 전체 후각 점막은 맥일웨인 헬기 (200 μm의 두께)와 슬라이스입니다. 각 explant는 접시에 도금 부분적으로 한 시간 만이라도 말린 후 FCS 함유 배지와 rehydrated 있습니다. 첫 번째 일 게시 도금 동안, 상피와 mesenchymal 세포는 explant 밖으로 성장. 그러면 신경 세포의 progenitors이 세포 레이어의 상단에있는 마이 그 레이션 및 신경으로 구분됩니다.
• 후각 줄기 세포의 정화는 유동세포계측법를 사용하여 얻을 수 있습니다. 특정 표면 마커는 특성화 용지 ¹¹ 출판 목록에서 검색할 수 있습니다.
• 이식 실험을 위해, 그것은 후각 줄기 세포 GFP - 양성 쥐의 변형을 사용할 수 있습니다. 이 쥐의 스트레인 (스프 라그 돌리, eGFP PGK 프로 모터에 의해 구동)는 ITERT (낭트, 프랑스)에서 사용할 수 있습니다. 인간의 후각 줄기 세포에 GFP 유전자를 삽입을 위해, 우리는 lentivirus 감염을 기반으로 메서드를 사용합니다.
• 본 논문은 후각 외의 뜻 mesenchymal 줄기 세포에 초점을 맞추고 있습니다. 그러나,이자, 후각​​ ensheathing 세포의 다른 세포 유형은 동일한 조직에서 정화 수 있습니다. 우리는 그들의 수집 및 정화 ^1,17위한 방법을 설명하고 우리는 하반신 마비 환자 ¹⁸ 단계 I / IIa 임상 시험에 대한 인간의 비강 ensheathing 세포를 사용합니다.
• mesenchymal 줄기 세포의 superfamily의 일원으로서, OE - MSCS는 adipocytes, osteocytes 및 myocytes ^11로 차별화하는 데 적절한 문화 조건 하에서 수 있습니다.

미래 애플 리케이션

• 우리는 이미 자폐증, 양극성 장애, 가족 dysautonomia, 파킨슨병, 알츠하이머 질환과 정신 분열증 환자의 ^2-7 세포와 분자 이상 현상을 연구하기 위해 인간의 후각 biopsies를 사용했습니다. 이론적으로, 모든 뇌 질환은 비강 biopsies 또는 주변 후각 줄기 세포를 사용하여 공부하실 수 있습니다.
• 설치류와 인간의 비강 후각 줄기 세포는 이미 기억 상실증, 파킨슨병, 달팽이 손상 및 척수의 외상 ^12-16의 동물 모델에 이식할되었습니다. 그것은 알츠하이머 질환, 뇌 국소 빈혈, 다중 경화증의 동물 모델에 이들 세포를 이식하는 상상할 수있다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
쥐에서 후각 점막 수집
DMEM / 햄 F12	Invitrogen	31331-028
Pentobarbital 나트륨
Rongeur	FST
26 게이지 바늘	Terumo	NN - 2613R
집게
인간의 후각 점막 수집
딱딱한 내시경	칼 Storz 또는 리차드 울프 의료
Lidocaine
에피네프린
Throughcut 사골 포셉	칼 Storz 또는 리차드 울프 의료
후각 줄기 세포의 분리
Dispase II	로체	10 295 825 001
해부 현미경
마이크로 주걱	FST
Collagenase IA	시그마 - 알드리치	C9891
Ca-free/Mg-free PBS	Invitrogen	14190-250
태아 송아지 혈청	Invitrogen	10270098
유리 coverslip	Knittel 글레이저	001/35
영역의 형성과 분화의 연결
폴리 - L - 리신	시그마 - 알드리치	P - 1274
인슐린 트랜스페린 셀레늄 (ITS)	Invitrogen	51500056
EGF	R & D 시스템	236 - EG
FGF2	R & D 시스템	233 - FB
Neurobasal 매체	Invitrogen	21103-049
B - 27 세럼 - 무료 보충	Invitrogen	17504-044
페니실린 / 스트렙토 마이신	Invitrogen	15140122
글루타민	Invitrogen	25030024
글루 탐 산염	시그마 - 알드리치