Изоляция Носовые Обонятельные стволовых клеток от грызунов и человека

Резюме

Мы опишем здесь метод biopsying обонятельной выстилки из крысы и человека полости носа. Эти биопсии могут быть использованы как для идентификации молекулярных аномалий заболеваний мозга или изоляции мультипотентных взрослых стволовых клеток, которые могут быть использованы для трансплантации клеток на животных моделях травмы мозга / болезнь.

Аннотация

The olfactory mucosa, located in the nasal cavity, is in charge of detecting odours. It is also the only nervous tissue that is exposed to the external environment and easily accessible in every living individual. As a result, this tissue is unique for anyone aiming to identify molecular anomalies in the pathological brain or isolate adult stem cells for cell therapy.

Molecular abnormalities in brain diseases are often studied using nervous tissue samples collected post-mortem. However, this material has numerous limitations. In contrast, the olfactory mucosa is readily accessible and can be biopsied safely without any loss of sense of smell¹. Accordingly, the olfactory mucosa provides an "open window" in the adult human through which one can study developmental (e.g. autism, schizophrenia)^2-4 or neurodegenerative (e.g. Parkinson, Alzheimer) diseases^4,5. Olfactory mucosa can be used for either comparative molecular studies^4,6 or in vitro experiments on neurogenesis^3,7.

The olfactory epithelium is also a nervous tissue that produces new neurons every day to replace those that are damaged by pollution, bacterial of viral infections. This permanent neurogenesis is sustained by progenitors but also stem cells residing within both compartments of the mucosa, namely the neuroepithelium and the underlying lamina propria^8-10. We recently developed a method to purify the adult stem cells located in the lamina propria and, after having demonstrated that they are closely related to bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC), we named them olfactory ecto-mesenchymal stem cells (OE-MSC)¹¹.

Interestingly, when compared to BM-MSCs, OE-MSCs display a high proliferation rate, an elevated clonogenicity and an inclination to differentiate into neural cells. We took advantage of these characteristics to perform studies dedicated to unveil new candidate genes in schizophrenia and Parkinson's disease⁴. We and others have also shown that OE-MSCs are promising candidates for cell therapy, after a spinal cord trauma^12,13, a cochlear damage¹⁴ or in an animal models of Parkinson's disease¹⁵ or amnesia¹⁶.

In this study, we present methods to biopsy olfactory mucosa in rats and humans. After collection, the lamina propria is enzymatically separated from the epithelium and stem cells are purified using an enzymatic or a non-enzymatic method. Purified olfactory stem cells can then be either grown in large numbers and banked in liquid nitrogen or induced to form spheres or differentiated into neural cells. These stem cells can also be used for comparative omics (genomic, transcriptomic, epigenomic, proteomic) studies.

протокол

1. Сборник обонятельной выстилки у крыс

1. Начните с подготовки трех 35 мм чашки Петри, заполненные DMEM / HAM F12 культуральной среде в чистом капот культуры.
2. Любой способ эвтаназии должен быть заранее утверждены животных учреждение по уходу и использованию комитет и осуществляется квалифицированным персоналом. После крыса вошла глубокого наркоза натрия фенобарбитала или других инъекционных форм анестезии, такие как кетамин / ксилазина, обезглавить и снимите кожу. Ингалянтами анестетиков следует избегать. Адекватность анестезии будет оцениваться носок щепотку до обезглавливания. Снимите нижнюю челюсть с ножницами и с помощью костные кусачки, устраняют мимические мышцы с обеих сторон.
3. Начиная с задней резцы, удалить с костные кусачки кости покрытие носовой полости, одна сторона за один раз. Обонятельных раковин появиться как оранжевый / коричневый органов, расположенных в задней части носа.
4. Деликатно отказаться от раковин с щипцами. Использование 26 иглы, изолировать обонятельной выстилки лежал на перегородки резки ткани по трем направлениям: дуги перпендикулярно пластине, пластинка решетчатой ​​и потолок полости носа.
5. Сбор биопсии с обеих сторон и передача их в DMEM / HAM F12 заполненные чашке Петри. Эта процедура не должна занять больше времени, чем на 10 минут от начала эвтаназии.
6. Теперь, для того, чтобы удалить слизь, передача биопсии два раза в среднесрочной заполнены чашках Петри.

2. Сборник обонятельной выстилки у людей

1. Эта процедура должна осуществляться нос уха и горла (ЛОР) Хирург, в соответствии с соответствующим местным этическим комитетом (ы), и каждый амбулаторно должны подписать форму информированного согласия.
2. Использование 0 ° или 30 ° жесткий эндоскоп (4 мм), проверьте оба носовые полости и оценить предполагаемые наличие полипов или любого воспалительного поражения. Выберите лучший полости носа, с учетом отклонения перегородки.
3. Использование хлопка аппликатор, нанесите местной анестезии, такие как лидокаин с адреналином, в течение 10 минут.
4. С throughcut решетчатой ​​щипцами, собираем два квадратных миллиметра биопсия либо в корне медиальной средней раковины или на перегородку в дорзомедиальном области.
5. Обонятельные биопсия затем передаются, используя стерильную иглу, в стерильный 2 мл трубки, заполненной 1 мл DMEM / HAM F12. Совет трубки вверх дном, чтобы убедиться, что биопсия погружается в культуральной среде.
6. Вставьте трубку в рефрижераторный контейнер и транспортируют его к научно-исследовательской лаборатории. На данном этапе, биопсия может быть использован как таковой для сравнительных молекулярных исследований сосредоточено на конкретных заболеваниях головного мозга или обработанные для получения стволовых клеток.

3. Выделение стволовых клеток обонятельного от человека и крысы слизистой оболочки

1. Вымойте биопсии в DMEM / HAM F12. Инкубируйте биопсии в чашке Петри заливается 1 мл dispase II решение (2,4 МЕ / мл), в течение 1 часа при температуре 37 ° C.
2. Далее, при вскрытии микроскоп с перевернутой дифрагированного света, обонятельным эпителием удаляется из основных собственная пластинка использованием микро-шпателем.
3. Обонятельный эпителий тоньше и выглядит полупрозрачным на черном фоне по сравнению с собственной пластинки которого разделяются оранжевый / коричневый. За белым фоном, эпителий выглядит серым и собственной пластинки, коричневый.
4. Как только очищенную, передача собственной пластинки в чашке Петри заполнены DMEM / HAM F12.
5. Если ткань от грызунов, а затем вырезать собственную пластинку на мелкие кусочки с двумя иглами 25 калибра. Затем перенесите штук 15 мл трубки, заполненной 1 мл коллагеназы IA.
6. В трубке, с помощью стерильной пипетки пластиковые, диссоциируют ткани. Затем, инкубировать трубку в течение 10 минут при температуре 37 ° C.
7. Для прекращения диссоциации, мягко рок трубки и добавить 9 мл Ca-Mg свободными и без PBS и центрифуга со скоростью 200 г в течение 5 минут.
8. Ресуспендируют осадок клеток в DMEM / HAM F12 питательной среде с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, антибиотики и пластину на пластиковой посуды культуры.
9. Теперь, если ткани человека, то ломтик собственную пластинку в 3 до 4 штук с мощностью от 200 до 500 мкм.
10. Вставьте каждой полосы в свои 2 см блюдо культуры диаметра и покрывают стерильной ткани с 1,3 см в диаметре скользит стеклянной крышкой.
11. Затем добавьте 500 мкл культуральной среды (DMEM / HAM F12 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков) для каждой культуры блюдо.
12. Для любого типа ткани, обновить культуральной среды каждые 2 до 3 дней.
13. Через пять-семь дней после того, стволовые клетки начинают вторгаться культуры блюдо и через две недели они должны быть вырожденным. Когда слияния будет достигнут, прохождения и передачи клеткам культуры колб.

4. Формирование сферы и нейронов Differentiation обонятельного стволовых клеток

1. Для создания сфер стволовых клеток, инкубировать колбы в течение двух часов при температуре 37 ° C с поли-L-лизин. (ТЕКСТ: 5 г/см2).
2. Пластина клеток при плотности 16000 клеток на квадратный сантиметр в обработанной колб.
3. Каждые два дня, кормить клеток с 0,2 мл на квадратный сантиметр дополнена средой (DMEM / HAM F12 дополнить инсулин, трансферрин, селен (ITS-X, 1%), ЭФР (50 нг / мл) и FGF2 (50 нг / мл)).
4. От двух до пяти дней, собрать плавающие сферы клеток и либо повторно пластины или отделить их перед прививкой на животных моделях клеточной терапии.
5. Чтобы дифференцировать обонятельных стволовых клеток в нейрон-подобные клетки, культивировать их в течение 21 дней в Neurobasal среде, содержащей B-27, пенициллин, стрептомицин, глутамина и глутамата.
6. Затем сделайте среда меняется каждые 3 дня. Нейрон-подобные клетки должны появиться через две-три недели.

5. Представитель Результаты:

Носовые человека эксплантов-перерастает стволовые клетки (рис. 2А) делятся быстро и слияния может быть достигнута в течение одной-двух недель. Одной из ключевых особенностей stemness, нестин выражения, была оценена (рис. 2В). При росте на поли-L-лизин с бессывороточной культуральной среде дополнен ЭФР (50 нг / мл) и FGF2 (50 нг / мл), обонятельные стволовые клетки приводят к сфере (рис. 2С). При выращивании в сыворотке крови, содержащей культуральной среде вновь покрытием сферы порождают GFAP-клеток, экспрессирующих (~ 50%), тубулина-клеток, экспрессирующих (~ 10-15%) и O4-клеток, экспрессирующих (~ 2-5%) ⁹ (рис. 2D-F). Тем не менее, судьба сфере клеток, полученных могут быть изменены. Например, при выращивании в Neurobasal культуральной среде дополнен B27 и глутамата, большую часть носовых обонятельных стволовых клеток в нейроподобных клеток, экспрессирующих β-III тубулина (рис. 2G) и MAP2 (рисунок 2H).

Рисунок 1. Общая схема эксперимента. Обонятельные биопсии слизистой оболочки вырезали из крысы или человека носовой полости. Эксплантов можно использовать как таковой для сравнительных молекулярных исследований в целях выявления биомаркеров в заболеваний головного мозга. Для выделения обонятельных стволовых клеток, взаимодействие между собственная пластинка и нервно-эпителия нарушается с dispase II фермент, и после 45 минут, эпителий удаляется с микро-шпателем. Грызунов стволовые клетки обонятельной далее выбран диссоциирующего собственную пластинку с коллагеназы IA. Для человеческой ткани, кусочков обонятельной собственная пластинка культивируют под стекло покровное, пока перерастает стволовые клетки проникают в целом хорошо. После распространения, с использованием подходящей культуральной среде, обонятельные стволовые клетки могут генерировать сфер или дифференцируются в нейрон-подобных клеток. Обонятельные стволовые клетки могут быть использованы для я) ремонт заболеваний мозга или травм или II) идентифицировать молекулярные маркеры заболеваний центральной нервной системы. Иллюстрации сделаны с помощью искусства Servier Medical.

Рисунок 2. Культуры и дифференциации носового обоняния человека стволовые клетки. Человека стволовые клетки, растущие из собственной пластинки эксплантов () делятся быстро, при культивировании в сыворотке содержащей среде. Стволовые клетки экспрессируют маркер stemness нестин (B). При посеве на поли-L-лизин покрытием пластика и культивируется в бессывороточной культуральной среде дополнен ЭФР и FGF2, обонятельных стволовых клеток генерировать сфер (С). Сфера клеток, полученных, при посеве в сыворотке содержащих культуральной среде, приводит к GFAP-клеток, экспрессирующих (~ 50%), тубулина-клеток, экспрессирующих (~ 10-15%) и O4-клеток, экспрессирующих (~ 2-5%) ⁹ (DF). При выращивании в Neurobasal культуральной среде дополнен B27 и глутамата, они дифференцируются в нейроподобных клеток, экспрессирующих β-III тубулина (G) и MAP2 (H).

Обсуждение

Методы, представленные здесь делают грызунов и человека обонятельной выстилки полезную модель для клинических исследований причин развития нервной системы и нейродегенеративных заболеваний, а также инструмент для ремонта патологических или травмирован мозг. Протокол относительно проста и может быть легко осуществляется опытный биолог клетки. Успеха для биопсии и культуры методов является высокой.

Критические шаги

• Для сбора грызунов обонятельной выстилки, рекомендуется не превышать лимит времени в 10 минут между эвтаназией и окончательное удаление обонятельной ткани.
• Диссоциации грызунов обонятельных собственная пластинка обычно достигается через 10 мин. инкубации в коллагеназы IA. Если нет, то мы рекомендуем собирать на следующий день после супернатант, в котором недиссоциированных бит пластинки плавают собственная, центрифуги его на 200 г и механически отделить плавающей пластинки С помощью пипетки Пастера до replating клеток в новой скважины. Первая скважина содержащих уже подключен клетками заполняется свежей питательной среды.
• Для человека собственная пластинка, которая является более компактным, чем грызунов ткань, мы не рекомендуем ферментативной диссоциации. Ткань нарезанный и каждый эксплантов вставляется между нижней части пластиковой тарелки и стекло покровное. Успешное культур включают эксплантов, толщина которых варьируется от 200 до 500 мкм.

Возможные изменения

• Текущий протокол может быть слегка изменен для того, чтобы генерировать обонятельных нейронов в пробирке. Для этой цели, нейро-эпителия не удаляется и вся обонятельной выстилки разрезается с вертолета McIlwain (200 мкм, толщина). Каждый эксплантов покрыт в блюдо, частично сушат в течение одного часа и затем регидратации с FCS-содержащих культуральной среде. В течение первых дней после покрытия, эпителиальных и мезенхимальных клетках растут из эксплантов. Затем, нейрон прародителей будут мигрировать на вершине этой слой клеток и дифференцируются в нейроны.
• Очистка обонятельных стволовые клетки могут быть достигнуты с помощью проточной цитометрии. Специальные маркеры поверхности может быть получен из списка, опубликованного в характеристике бумаги ^11.
• Для трансплантации экспериментов, можно использовать штамм крыс, обонятельных стволовых клеток GFP-положительных. Это крыса деформации (Sprague Dawley, EGFP управляется промоутер ПГК) можно ознакомиться на ITERT (Нант, Франция). Для вставки GFP ген обоняния человека стволовые клетки, мы используем метод, основанный на лентивирус инфекции.
• Эта статья сосредоточена на обонятельные экто-мезенхимальных стволовых клеток. Однако, другой тип клеток интересов, обонятельные вкладывающийся клеток, могут быть очищены от той же ткани. Мы описали метод их сбора и очистки ^1,17 и мы использовали человеческие клетки носовых вкладывающийся для фазы I / II клинических испытаний в страдающий параличом нижних конечностей пациентов ^18.
• Как член мезенхимальных стволовых клеток суперсемейства, OE-МСК способны при соответствующих условиях культуры, к дифференцировке в адипоциты, остеоциты и миоцитов ^11.

Будущие приложения

• Мы уже использовали обоняния человека биопсию для исследования клеточных и молекулярных аномалий у пациентов, страдающих аутизмом, биполярное расстройство, семейные Dysautonomia, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и шизофрения ^2-7. Теоретически, все заболевания головного мозга могут быть изучены с помощью носового биопсии или периферических стволовых клеток обонятельного.
• Грызунов и человека носовых обонятельных стволовых клеток уже были привиты на животных моделях амнезия, болезнь Паркинсона, повреждения и кохлеарные травмы спинного мозга ^12-16. Вполне возможно, чтобы пересадить этих клеток в животных моделях болезни Альцгеймера, ишемия мозга, рассеянный склероз.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Сборник обонятельной слизистой у крыс
DMEM / HAM F12	Invitrogen	31331-028
Натрий пентобарбитал
Костные кусачки	FST
26 иглы	Terumo	NN-2613R
Щипцы
Сборник обонятельной слизистой оболочки у человека
Жесткий эндоскоп	Karl Storz или Richard Wolf Медицинские
Лидокаин
Адреналин
Throughcut решетчатой ​​щипцы	Karl Storz или Richard Wolf Медицинские
Выделение стволовых клеток обонятельного
Dispase II	Roche	10 295 825 001
Препаровальная лупа
Micro шпателем	FST
Коллагеназа И. А.	Sigma-Aldrich	C9891
Ca-free/Mg-free PBS	Invitrogen	14190-250
Фетальной телячьей сыворотки	Invitrogen	10270098
Стекло покровное	Книттель Глейзер	001/35
Формирование сферы и дифференциация нейронов
Поли-L-лизин	Sigma-Aldrich	P-1274
Инсулин трансферрина селена (ИТС)	Invitrogen	51500056
ЭФР	R & D Systems	236-EG
FGF2	R & D Systems	233-FB
Neurobasal среда	Invitrogen	21103-049
B-27 бессывороточной Дополнение	Invitrogen	17504-044
Пенициллин / стрептомицин	Invitrogen	15140122
Глутамин	Invitrogen	25030024
Глутамат	Sigma-Aldrich