בידוד באף גזע תאים חוש הריח של מכרסמים או בני אדם

Summary

אנו מתארים כאן שיטה לביופסיה של רירית חוש הריח של העכברים וחללים האף האנושי. ביופסיות אלו יכולים לשמש גם לזיהוי חריגות מולקולרי במחלות מוח או בידוד multipotent גזע בוגרים לתאי כי יכול להיות מנוצל עבור השתלת תאים בבעלי חיים טראומה מוחית / מחלה.

Abstract

רירית ההרחה, הממוקמת בחלל האף, הוא אחראי על זיהוי ריחות. זהו גם רקמת העצבים רק כי הוא חשוף לסביבה החיצונית ונגיש בקלות כל אדם חי. כתוצאה מכך, רקמה זו היא ייחודית לכל אדם במטרה לזהות אנומליות מולקולריים במוח פתולוגי או לבודד בתאי גזע בוגרים לטיפול בתא.

ליקויים מולקולרית במחלות מוח נלמדים לעתים קרובות באמצעות דגימות רקמה שנאספו העצבים שלאחר המוות. עם זאת, חומר זה יש מגבלות רבות. לעומת זאת, רירית ההרחה הוא נגיש וניתן ביופסיה בבטחה ללא אובדן חוש הריח ^1. לפיכך, רירית ההרחה מספקת "חלון פתוח" על האדם המבוגר דרכו ניתן ללמוד התפתחותית (כגון סכיזופרניה, אוטיזם) ^2-4 או ניווניות (כגון פרקינסון, אלצהיימר) מחלות ^4,5. רירית חוש הריח יכול לשמש גם מחקרים מולקולריים השוואתי ^4,6 או בניסויים במבחנה על neurogenesis ^3,7.

אפיתל הריח הוא גם רקמת העצבים שמייצר נוירונים חדשים כל יום כדי להחליף את אלה שנפגעו זיהום, חיידקי של זיהומים נגיפיים. Neurogenesis זה קבע שנגרמו אבות, אלא גם בתאי גזע המתגוררים בתוך שני תאים של רירית, כלומר neuroepithelium ו lamina propria ^8-10 הבסיסית. אנחנו לאחרונה פיתחה שיטה לטיהור בתאי גזע בוגרים ממוקם lamina propria ו, לאחר הוכיחו כי הם קשורים באופן הדוק מח עצם mesenchymal בתאי גזע (BM-MSC), קראנו להם חוש הריח חיצוני mesenchymal בתאי גזע (OE- MSC) ^11.

מעניין לציין, כי בהשוואה BM-MSCs, OE-MSCs להציג קצב התפשטות גבוה, clonogenicity מוגבה נטייה להתמיין תאים עצביים. ניצלנו את המאפיינים הללו לבצע מחקרים מוקדש לחשוף גנים מועמדים חדשים סכיזופרניה ⁴ מחלת פרקינסון. אנו ואחרים הראו גם כי OE-MSCs מבטיחים המועמדים טיפול בתא, לאחר טראומה חוט השדרה ^{12,13, 14} נזק שבלול או במודלים של בעלי חיים של מחלת פרקינסון ¹⁵ או ¹⁶ אמנזיה.

במחקר זה, אנו מציגים שיטות ביופסיה של רירית ההרחה אצל חולדות ובני אדם. לאחר איסוף, propria lamina מופרדת enzymatically מן האפיתל ותאי גזע הם מטוהרים באמצעות אנזימטית או שיטה שאינה האנזימטית. מטוהר בתאי גזע הריח אז יכול להיות גדל גם במספרים גדולים, ובנתה בחנקן נוזלי או המושרה ליצור כדורים או מובחן לתוך תאים עצביים. תאים אלה גזע יכול לשמש גם עבור omics (גנומי, transcriptomic, epigenomic, proteomic) מחקרים השוואתיים.

Protocol

1. אוסף של רירית חוש הריח בחולדות

1. בגין על ידי הכנת מנות three 35 מ"מ פטרי מלאות בינוני F12 DMEM / HAM תרבות במנדף תרבות נקייה.
2. כל שיטה של ​​המתת חסד חייב לקבל אישור מראש על ידי טיפול בבעלי חיים של המוסד והוועדה להשתמש ובוצע על ידי טכנאי מוסמך. אחרי החולדה נכנסה הרדמה עמוקה עם צורות נתרן pentobarbital או אחר בזריקות הרדמה כגון קטמין / xylazine, לערוף ולהסיר את העור. הרדמה נשימתית יש להימנע. הלימות של הרדמה יוערכו על ידי צביטה הבוהן לפני עריפת ראש. הסר את הלסת התחתונה עם מספריים בעזרת rongeur, לחסל את שרירי הפנים משני הצדדים.
3. החל מהחלק האחורי של השיניים החותכות, הסר עם rongeur העצם המכסה את חלל האף, בצד אחד בכל פעם. Turbinates הריח נכנס מראה כמו כתום / חום באיברים הממוקם בחלק האחורי של האף.
4. בעדינות להתעלמות turbinates עם מלקחיים. בעזרת מחט מד 26, לבודד את רירית ההרחה שוכב על מחצה על ידי חיתוך הרקמה לאורך שלושה קווים: קשת הצלחת בניצב, את הצלחת cribriform ואת התקרה של חלל האף.
5. איסוף ביופסיות משני הצדדים ולהעביר אותם מנה DMEM / HAM פטרי F12 מלא. הליך זה לא אמור לקחת יותר מ 10 דקות המתת חסד את התחלתה.
6. כעת, על מנת להסיר את רירית, העברת ביופסיות פעמיים בינוני מלא בצלחות פטרי.

2. אוסף של רירית חוש הריח בבני אדם

1. הליך זה צריך להתבצע על ידי אף אוזן גרון (אא"ג) המנתח, בהתאם רלוונטי ועדה אתית מקומית (ים) ו חוץ כל צריך לחתום על טופס הסכמה מדעת.
2. שימוש 0 ° או 30 ° אנדוסקופ קשיח (4 מ"מ קוטר), לבדוק את שני החללים באף להעריך את נוכחות המשוערת של פוליפים או נגעים דלקתיים. בחר את חלל האף הטובה ביותר, תוך התחשבות חריגה של מחיצת האף.
3. באמצעות מטוש צמר גפן, להחיל הרדמה מקומית, כמו לידוקאין עם אפינפרין, במשך 10 דקות.
4. בעזרת מלקחיים כברתי throughcut, לאסוף שני ביופסיה מילימטר מרובע או בשורש היבט המדיאלי של חלזוני באמצע או על מחצה באזור dorsomedial.
5. ביופסיה של חוש הריח הוא הועבר לאחר מכן, באמצעות מחט סטרילית, לתוך צינור 2 מ"ל סטרילי מלא 1 מ"ל של DMEM / HAM F12. עצה הצינור הפוך לוודא כי הביופסיה הוא שקוע בתוך המדיום לתרבות.
6. הכנס את הצינור במיכל בקירור ולהעביר אותה למעבדת מחקר. בשלב זה, ביופסיה יכולה לשמש כשלעצמה עבור מחקרים מולקולריים השוואתית מתמקדת במחלות מוח ספציפיים או מעובד להפקת בתאי גזע.

3. בידוד של גזע תאים רירית חוש הריח של האדם עכברוש

1. שטפו את ביופסיות ב DMEM / HAM F12. דגירה ביופסיות בצלחת פטרי מלאות מ"ל 1 של dispase II פתרון (2.4 IU / ml), במשך שעה 1 ב 37 ° C.
2. לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ לנתח באור הפוך diffracted, אפיתל ההרחה יוסר lamina propria הבסיסית באמצעות מרית מיקרו.
3. אפיתל הריח הוא דק יותר נראה שקוף על רקע שחור לעומת lamina propria אשר פסים כתום / חום. במהלך רקע לבן, האפיתל נראה אפור lamina propria, חום.
4. מטוהרים פעם אחת, להעביר את lamina propria לתוך צלחת פטרי מלאות DMEM / HAM F12.
5. אם הרקמה של מכרסם, ואז לחתוך את lamina propria לחתיכות קטנות עם שתי 25 מחטים מד. ואז, להעביר את חתיכות צינור 15 מ"ל מלא 1 מ"ל של collagenase IA.
6. בתוך הצינור, בעזרת פיפטה פלסטיק סטרילית, לנתק את הרקמה. ואז, דגירה הצינור במשך 10 דקות על 37 ° C.
7. כדי לסיים את הניתוק, בעדינות הסלע צינור ולהוסיף 9 מ"ל של Ca-Mg חופשית ללא PBS ו צנטריפוגות ב 200 גר 'במשך 5 דקות.
8. Resuspend התא גלולה במדיום F12 DMEM / HAM תרבות בתוספת סרום 10% עגל, אנטיביוטיקה העובר על צלחת צלחות תרבות הפלסטיק.
9. עכשיו, אם הרקמה האנושית, אז הפרוסה lamina propria לתוך 3-4 חתיכות עם עובי הנע 200-500 מיקרומטר.
10. הכנס כל רצועה 2 לתוך צלחת משלו בקוטר ס"מ תרבות לכסות את הרקמה עם סטרילי בקוטר 1.3 ס"מ תלושי זכוכית המכסה.
11. ואז, להוסיף 500 μl של המדיום תרבות (DMEM / HAM F12 בתוספת סרום 10% עגל אנטיביוטיקה עוברי) כדי בצלחת כל תרבות.
12. עבור סוג או רקמות, לחדש את המדיום תרבות כל 2 עד 3 ימים.
13. חמישה עד שבעה ימים אחרי, בתאי גזע יחלו לפלוש צלחת תרבות ואחרי שבועיים הם צריכים להיות ומחוברות. Confluency כאשר הוא הגיע, מעבר ולהעביר את התאים צלוחיות תרבות.

4. כדור גיבוש Differe העצביתntiation בתאי גזע של חוש הריח

1. כדי ליצור תא גזע התחומים, דגירה צלוחיות במשך שעתיים על 37 מעלות צלזיוס עם פולי-L-ליזין. (טקסט: 5 g/cm2).
2. פלייט התאים בצפיפות של 16,000 תאים לסנטימטר מרובע של צלוחיות טיפול.
3. כל יומיים, להאכיל את התאים עם 0.2ml לסנטימטר מרובע של המדיום שיושלם (DMEM / HAM F12 בתוספת אינסולין, transferrin, סלניום (X-ITS, 1%), EGF (50 ng / ml) ו FGF2 (50 ng / מ"ל)).
4. יומיים עד חמישה ימים מאוחר יותר, לאסוף כדורים תא צף מחדש או צלחת או לנתק אותם לפני השתלת במודלים של בעלי חיים טיפול בתא.
5. להבדיל מתאי גזע הריח לתוך נוירון כמו תאים, לטפח אותם במשך 21 ימים בתווך Neurobasal המכיל B-27, פניצילין, סטרפטומיצין גלוטמין ו - גלוטמאט.
6. ואז לבצע שינויים בינוני כל 3 ימים. Neuron דמויי תאים אמור להופיע לאחר שבועיים עד שלושה שבועות.

5. נציג תוצאות:

באף האנושי explant-התבגרות בתאי גזע (איור 2 א) מתחלקים במהירות confluency ניתן להגיע בתוך שבוע עד שבועיים. אחת התכונות העיקריות של stemness, הביטוי nestin, הוערך (2B איור). כאשר גדל על פולי-L-ליזין בינוני עם סרום ללא תרבות בתוספת EGF (50 ng / ml) ו FGF2 (50 ng / ml), בתאי גזע הריח להצמיח התחומים (דמות 2C). כאשר גדל בינוני סרום המכיל התרבות החדש התחומים מצופה להצמיח GFAP-להביע תאים (~ 50%), טובולין-להביע תאים (~ 10-15%) ו-O4 להביע תאים (~ 2-5%), ⁹ (איורים 2D-F). עם זאת, גורלו של כדור הנגזרות תאים יכול להיות שונה. לדוגמה, כאשר גדל בינוני תרבות Neurobasal בתוספת B27 ו גלוטמט, רוב התאים לאף גזע הריח לתוך תא העצב, כמו תאים להביע β-III טובולין (איור 2G) ו MAP2 (איור 2H).

באיור 1. תכנית כוללת של הניסוי. חוש הריח ביופסיות רירית הם נכרת מן החולדה או חלל האף האנושי. Explants יכולה לשמש כשלעצמה עבור מחקרים מולקולריים השוואתי במטרה לזהות סמנים ביולוגיים במחלות מוח. לבידוד בתאי גזע חוש הריח, אינטראקציות בין lamina propria ואת נוירו אפיתל הם שיבשו עם השנייה dispase האנזים, ואחרי 45 דקות, אפיתל יוסר עם מרית המיקרו. חוש הריח מכרסם בתאי גזע שנבחרו נוספת על ידי dissociating lamina propria עם collagenase IA. עבור רקמה אנושית, פיסות lamina propria חוש הריח הם תרבותי תחת זכוכית coverslip עד בתאי גזע התבגרות לפלוש כולו טוב. לאחר התפשטות, באמצעות המדיום המתאים תרבות, בתאי גזע חוש הריח יכול ליצור כדורים או להתמיין נוירון דמויי תאים. חוש הריח בתאי גזע שניתן להשתמש בהם כדי i) המוח לתקן מחלות או טראומה או ii) לזהות סמנים מולקולריים של מחלות מערכת העצבים המרכזית. איורים נעשים בעזרת אמנות רפואי Servier.

איור 2. התרבות והתמיינות של תאים אנושיים האף גזע חוש הריח. בתאי גזע האדם גדל מתוך lamina propria explant (א) מתחלקים במהירות, כאשר מעובדות בינוני סרום המכיל. בתאי גזע לבטא את stemness סמן nestin (B). כאשר מצופה פלסטיק על פולי-L-ליזין מצופה וטיפח במדיום סרום ללא תרבות בתוספת EGF ו FGF2, בתאי גזע הריח ליצור כדורים (C). כדור הנגזרות תאים, כאשר מצופה במדיום סרום המכיל תרבות, להצמיח GFAP-להביע תאים (~ 50%), טובולין-להביע תאים (~ 10-15%) ו-O4 להביע תאים (~ 2-5%) ⁹ (DF). כאשר גדל בינוני תרבות Neurobasal בתוספת B27 ו גלוטמט, הם להתמיין לתאי עצב, כמו הבעת β-III טובולין (G) MAP2 (H).

Discussion

הטכניקות שהוצגו כאן להפוך את המכרסמים רירית ההרחה האנושית מודל שימושי עבור מחקר קליני על הגורמים מחלות התפתחותיות ו ניווניות, כמו גם כלי תיקון מוח פתולוגי או טראומה. הפרוטוקול היא פשוטה יחסית, יכול להתבצע בקלות על ידי הביולוג תא מנוסים. שיעור ההצלחה של שיטות ביופסיה ותרבות גבוהה.

צעדים קריטיים

• עבור אוסף של רירית ההרחה מכרסם, מומלץ שלא יעלה על מגבלת זמן של 10 דקות בין המתת חסד לבין כריתה הסופי של רקמת ההרחה.
• הניתוק של lamina propria הריח מכרסם מושגת בדרך כלל לאחר 10 דקות. הדגירה ב collagenase IA. אם לא, אנו ממליצים לאסוף יום לאחר supernatant שבו פיסות undissociated של לצוף lamina propria, צנטריפוגה זה ב 200 גר 'ו - מכנית לנתק את lamina צף בעזרת פיפטה פסטר לפני replating התאים באר חדשה. גם הראשון המכיל את התאים מחוברים כבר מתמלא בינוני תרבות טריים.
• עבור lamina propria האדם, היא קומפקטית יותר רקמת מכרסם, אנחנו לא ממליצים דיסוציאציה האנזימטית. רקמה היא פרוסים בכל explant מוכנס בין החלק התחתון של צלחת פלסטיק זכוכית coverslip. תרבויות מוצלח כוללים explants אשר עובי בטווח 200-500 מיקרומטר.

שינויים אפשריים

• הפרוטוקול הנוכחי יכול להיות שונה מעט על מנת לייצר נוירונים הריח במבחנה. לשם כך, נוירו אפיתל אינו מוסר את רירית ההרחה כולו פרוס עם המסוק McIlwain (200 מיקרומטר עובי). Explant כל מצופה בצלחת, מיובשים חלקית במשך שעה אחת ו rehydrated אז עם המדיום FCS המכילים תרבות. במהלך ציפוי בימים הראשונים שלאחר, תאים אפיתל mesenchymal לצמוח מתוך explant. ואז, אבות נוירון יעברו על החלק העליון של שכבה זו של תאים להתמיין לנוירונים.
• טיהור בתאי גזע חוש הריח יכולה להיות מושגת באמצעות cytometry הזרימה. סמנים ספציפיים השטח ניתן לאחזר מהרשימה שפורסם בעיתון אפיון ^11.
• על הניסויים השתלה, ניתן להשתמש זן של חולדות אשר הריח בתאי גזע ה-GFP חיובי. זה זן עכברים (ספראג Dawley, eGFP מונע על ידי האמרגן PGK) זמין בכתובת ITERT (נאנט, צרפת). עבור החדרת הגן GFP בבני אדם בתאי גזע חוש הריח, אנו משתמשים בשיטה המבוססת על זיהום lentivirus.
• מאמר זה מתמקד חיצוני mesenchymal גזע לתאי חוש הריח. עם זאת, סוג תא אחר של עניין, התאים ensheathing חוש הריח, יכול להיות מטוהרים מרקמות זהה. אנו תיאר שיטה אוסף שלהם טיהור ^1,17 והיינו האדם תאים ensheathing האף לניסוי שלב I / IIa קליניים בחולים משותק ^18.
• כחבר של superfamily גזע mesenchymal התא, OE-MSCs יכולים, בתנאים המתאימים תרבות, להתמיין adipocytes, osteocytes ו myocytes ^11.

יישומים עתידיים

• יש לנו כבר בשימוש ביופסיות חוש הריח האנושי ללמוד אנומליות תאית ומולקולרית בחולים עם אוטיזם, הפרעה דו קוטבית, לדיסאוטונומיה משפחתית, מחלת פרקינסון, אלצהיימר וסכיזופרניה ^2-7. תיאורטית, כל המחלות במוח ניתן ללמוד באמצעות ביופסיות האף או היקפית בתאי גזע חוש הריח.
• מכרסמים אדם בתאי גזע האף הריח כבר מורכבים במודלים של בעלי חיים של אמנזיה, מחלת פרקינסון, נזק שבלול וטראומה חוט השדרה ^12-16. זה מתקבל על הדעת להשתיל את התאים האלה לתוך מודלים של בעלי חיים של מחלת אלצהיימר, איסכמיה, טרשת נפוצה.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי
אוסף של רירית חוש הריח בחולדות
DMEM / HAM F12	Invitrogen	31331-028
Pentobarbital נתרן
Rongeur	FST
26 מחט מד	Terumo	NN-2613R
מצבטים
אוסף של רירית ההרחה בבני אדם
אנדוסקופ קשיח	קרל Storz או ריצ'רד וולף לרפואה
לידוקאין
אפינפרין
Throughcut כברתי מלקחיים	קרל Storz או ריצ'רד וולף לרפואה
בידוד בתאי גזע חוש הריח
Dispase II	רוש	10 295 825 001
הביתור מיקרוסקופ
מיקרו מרית	FST
Collagenase IA	סיגמא אולדריץ	C9891
Ca-free/Mg-free PBS	Invitrogen	14190-250
עגל עוברית בסרום	Invitrogen	10270098
זכוכית coverslip	Knittel גלזר	001/35
היווצרות כדור והבחנה עצבית
פולי-L-ליזין	סיגמא אולדריץ	P-1274
אינסולין transferrin סלניום (ITS)	Invitrogen	51500056
EGF	R & D מערכות	236-EG
FGF2	R & D מערכות	233-FB
Neurobasal בינוני	Invitrogen	21103-049
B-27 סרום ללא תוספת	Invitrogen	17504-044
פניצילין / סטרפטומיצין	Invitrogen	15140122
גלוטמין	Invitrogen	25030024
גלוטמט	סיגמא אולדריץ