Electroporation في الجسم الحي من الشبكية ماوس النامية

Summary

وهناك طريقة لدمج الحمض النووي في خلايا الشبكية البلازميد الفئران لغرض تنفيذ إما مكسب أو خسارة للدراسات وظيفة في الجسم الحي هو المقدمة. هذا الأسلوب تستفيد من زيادة عابرة في نفاذية الأغشية البلازمية الخلية الناجمة عن تطبيق حقل كهربائي خارجي.

Abstract

توصيف وظيفي من الجينات التي أعرب عنها خلال تطوير شبكية الثدييات لا يزال يشكل تحديا كبيرا. استهداف الجينات لتوليد خسارة التأسيسية أو المشروط بالضربة القاضية وظيفة لا تزال التكاليف وكثيفة العمالة ، فضلا عن مضيعة للوقت. إضافة إلى هذه التحديات ، وأعرب الشبكية الجينات قد يكون خارج أدوار أساسية في شبكية العين مما يؤدي إلى يفند غير مقصودة عند استخدام النهج خروج المغلوب. وعلاوة على ذلك ، يمكن أن القدرة على التعبير عن ectopically الجين في اكتساب التجربة وظيفة تكون ذات قيمة للغاية عند محاولة تحديد دور في تحديد مصير الخلايا و / أو تمايز المحطة.

نقدم طريقة لدمج سريعة وفعالة من الحمض النووي البلازميدات في شبكية العين بواسطة الفأرة الولدان electroporation. تطبيق نبضات كهربائية قصيرة فوق نتائج حقل قوة معينة في زيادة عابرة في نفاذية غشاء البلازما ، وتسهيل نقل المواد عبر الغشاء ^1،2،3،4. أظهر العمل الرائد الذي يمكن استخدامه electroporation كوسيلة لنقل الجينات في خلايا الثدييات بالتحريض على تشكيل ماء المسام غشاء البلازما السماح بالعبور من الحمض النووي مشحونة من خلال طبقة ثنائية المادة الدهنية ^5. وقد أدى التطور التقني المستمر في جدوى electroporation كوسيلة لنقل الجينات في الجسم الحي في الأنسجة الماوس متعددة بما في ذلك الشبكية ، الأسلوب الذي يوصف هنا ^{6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10.}

يتم حقن الحمض النووي حل في الفضاء تحت الشبكية بحيث يتم وضع أن الحمض النووي بين ظهارة الصباغية في شبكية العين والشبكية للفأرة (P0) الولدان والنبضات الكهربائية يتم تطبيقها باستخدام الملقط الكهربائي. الموضع الأفقي للعيون في الماوس يسمح للتوجه من السهل القطب منتاش اللازمة لمواءمة سلبية القطب القطب الحمض النووي شبكية إيجابية. يمكن التعرف على دمج واسعة والتعبير عن الجينات التي تنقل يوميا ما بعد الولادة 2 (P2). نظرا لعدم وجود هجرة كبيرة من الوحشية الخلايا في شبكية العين ، ويتم إنشاء مناطق electroporated وغير electroporated. يجوز لغير electroporated المناطق بمثابة الضوابط الداخلية النسيجي عند الاقتضاء.

ويمكن استخدام electroporation الشبكية للتعبير عن الجينات تحت المروج في كل مكان ، مثل المساعدة النقدية ، أو لتعطيل وظيفة الجين به لجنة المساواة العرقية أو يبني shRNA recombinase. لا يمكن أن يتحقق التعبير أكثر استهدافا من خلال تصميم يبني الخلية مع المروجين جين معين. ويتم تحقيق التصور من الخلايا باستخدام electroporated يبني bicistronic معربا عن GFP أو شارك في electroporating تعبير GFP بناء. وعلاوة على ذلك ، قد يكون electroporated بنيات متعددة لدراسة تأثيرات الجين اندماجي أو كسب وقت واحد وفقدان وظائف الجينات المختلفة. ويمكن أيضا أن تستخدم electroporation الشبكية لتحليل عناصر التنظيم الجيني لرابطة الدول المستقلة من خلال توليد بنيات التعبير المناسب والمسوخ الحذف. ويمكن استخدام مثل هذه التجارب لتحديد المناطق التنظيمية لرابطة الدول المستقلة ، أو ما يكفي من الخلايا المطلوبة للتعبير جين معين ^11. تجارب محدودة فقط من توافر إمكانات بناء.

Protocol

1. البلازميد استعدادا لelectroporation

تركيز الحمض النووي المطلوبة لelectroporation هو 5μg/μl. وهذا يتطلب عادة أن تكون ضخمت البلازميدات المطلوب باستخدام ماكسي الإعدادية (Qiagen) أو ما يعادلها الأسلوب يتبعه تنقية وتركيز الحمض النووي لكمية العمل. وتصف الخطوات التالية في إعداد الحمض النووي لكمية العمل.

1. قسامة 100 ميكروغرام من الحمض النووي (من ماكسي - الإعدادية أو ما يعادلها) ، ويخفف من حجم إلى 100 ميكرولتر لسهولة التلاعب.
2. إضافة الفينول ، وينبغي أن تحسب مقدار الفينول للحصول على نحو 60 ٪ الحمض النووي / حجم نسبة (DNA ميكروغرام : الحجم الكلي) أي : 100 ميكروغرام الحمض النووي (في 100 ميكرولتر) ، بالإضافة إلى 67 ميكرولتر الفينول (100 ميكروغرام : 167 ميكرولتر). مزيج دقيق ؛ لا ماصة صعودا وهبوطا ، فقد يؤدي هذا القص المفرط في الحمض النووي.
3. تدور في الحمض النووي لمدة 5 دقائق على 14000 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. جمع وإضافة كلوروفورم طاف به على نفس الحمض النووي : المجموع نسبة حجم في الخطوة 1.2 ؛ خليط كما هو موضح في الخطوة 1.2 وتدور في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. جمع طاف ، إضافة حجم طاف 10 ٪ من 3 خلات الصوديوم M في حل الحمض النووي ، والمزيج بلطف وإضافة 2.5 X حجم طاف من الإيثانول بنسبة 100 ٪. مزيج بواسطة انقلاب. وينبغي أن الحمض النووي تترسب من المحلول خلال الخلط.
6. تدور الحمض النووي في 4 درجات مئوية لمدة 10 دقيقة في 14000 دورة في الدقيقة.
7. شطف مع 350 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 70 ٪ ، وتدور في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
8. الهواء الجاف وبيليه تذوب ثم الحمض النووي في برنامج تلفزيوني X 1 (خلية أحياء الصف) ل5μg/μL. لا overdry العينة لأن هذا سيجعل من الصعب جدا أن يذوب في برنامج تلفزيوني.
9. إضافة الصبغة الخضراء سريعة (10 ٪ أسهم) إلى حل الحمض النووي ، وتركيز الصبغة النهائية لتبلغ 0.1 ٪ ، ليكون بمثابة التتبع الحقن.

2. الحقن تحت الشبكية من الحمض النووي

يتم تنفيذ الخطوات التالية مع مساعدة من stereomicroscope. يمارس مرة واحدة في عملية فتح العين ، والشق ، والحقن تستغرق أقل من 1.5 دقيقة وهو ما لا يكفي من الوقت لتخدير الجرو بشكل صحيح لاسترداد. باستخدام أداة حادة من عيار 30 إبرة ، وفتح العين بعناية من خلال خفض طول صلي على ظهارة تنصهر (الشكل 1C). لا تنطبق القوة المفرطة لأن هذا قد يؤدي إلى قطع من العين الكامنة. تجنب القطع خارج نطاق تقاطع جفن لأن هذا سيؤدي إلى النزيف الذي يمكن أن يحجب الحقن.

1. تخدير الفئران حديثي الولادة على الجليد لعدة دقائق (الشكل 1A) ، لا الجراء دفن في الجليد لأن هذا قد يؤدي إلى الوفاة. طول الوقت على الجليد لمتغير من الجرو الجرو ، 5 دقائق كافية عادة ولكن ينبغي رصدها بعناية الفئران كأفراد قد يستجيب بسرعة للغاية أو قد يتطلب فترة أطول من التعرض لضمان التخدير المناسب. إجراء قرصة مخلب مع المرقأة للتحقق من الانسحاب المنعكس.
2. ويجب من أجل تسهيل حقن الحمض النووي في الفضاء تحت الشبكية لأول مرة يتم فتح العين. مسحة العين ليتم حقنه مع الإعدادية 70 ٪ ايزوبروبيل (تايكو للرعاية الصحية) وتحديد ظهارة صلي تنصهر فيها الجفون اثنين معا (الشكل 1B).
3. باستخدام أداة حادة من عيار 30 إبرة ، وفتح العين بعناية من خلال خفض طول صلي على ظهارة تنصهر (الشكل 1C). لا تنطبق القوة المفرطة لأن هذا قد يؤدي إلى قطع من العين الكامنة. تجنب القطع خارج نطاق تقاطع جفن لأن هذا سيؤدي إلى النزيف الذي يمكن أن يحجب الحقن.
4. لتسهيل اختراق للعين من قبل حقن إبرة حادة انتهت استخدام غيض من إبرة 30 guage إجراء شق صغير في الصلبة بالقرب من تقاطع مع القرنية (الشكل 1E). لا تخترق عميقا جدا لأن هذا قد يؤدي إلى ثقب العدسة.
5. تعادل 0.3 ميكرولتر من محلول الحمض النووي إلى 33 إبرة حقن قياس حادة انتهت باستخدام التدرجات حقنة لقياس حجم فردي لكل حقن (إبرة قطرها الخارجي 0.52 ملم ، وقطرها الداخلي 0.13 مم ؛ Exmire microsyringe ؛ ايتو كورب). ادخال الإبرة في شق حتى يشعر مقاومة الجدار الصلبة المعارضة. نتوخى الحذر لتجنب اختراق عدسة كما يتم تمرير الإبرة من خلال الغرفة الزجاجية (الشكل 2B).
6. حقن ببطء 0.3 ميكرولتر من محلول الحمض النووي في الفضاء تحت الشبكية باستخدام السبابة أو الإبهام إلى كساد الغطاس المحاقن. يجب أن نكون حذرين المجرب للسيطرة على سرعة المكبس الاكتئاب بحيث المعدل الذي يتم حقن المحلول الحمض النووي في الفضاء تحت الشبكية لا يتجاوز المعدل الذي حل الحمض النووي ينتشر داخل مساحة تحت الشبكية (الشكل 2C). الحمض النووي هو الحل لزجة لذا فمن المهم أن لا يتم الضغط على إبرة مسرف ضد الجدار الصلبة المعارضة لأن هذا قد يؤدي في الحمض النووي لم يتم حقنه أو لا ينتشر بشكل متساو. وهناك حقن نتيجة ناجحة حتى فيانتشار الحمض النووي في حل جزء من المساحة تحت الشبكية. وينبغي أن مناطق الشبكية مع وبدون الكامنة التتبع الخضراء يكون واضحا عندما تناوب حقن الحيوان.

3. Electroporation

1. يتم تنفيذ Electroporation باستخدام قطرها 10 مم القطب منتاش (النموذجي # 522 ؛ آلات BTX). نقع القطب منتاش في برنامج تلفزيوني من أجل تعظيم الموصلية الكهربائية من القطب للحيوان ومكان رئيس الجرو حقن بين الأقطاب مع حقن العين المتاخمة للقطب القطب الموجب والعين غير حقن المتاخمة للقطب سلبية قطب كهربائي (الشكل 3B).
2. تطبيق five البقول مربع باستخدام مولد النبض : كل نبضة هو 80 فولت و 50 مللي ثانية في المدة مع فاصل زمني بين 950 ملي ثانية البقول.
3. ولا بد الآن من أن تكون درجة حرارة electroporated الجراء حتى يشفى من التخدير الجليد. يمكن القيام بذلك عن طريق وضع الجراء في ظل ارتفاع درجات الحرارة أو مصباح على رأس أكثر دفئا الشريحة. اذا كنت تستخدم أكثر دفئا الشريحة ضمان أن يتم وضع وسادة مناسبة بين سطح المعدن والجرو للشفاء. بعد شفائهم عودة الجراء electroporated إلى الأم.

4. إعداد العينين للتحليل

1. يتم تنفيذ وقت الحصاد وتحليل لشبكية العين electroporated تخضع لأهداف التجربة. ويمكن التعبير GFP يمكن تصور بشكل فاضح بعد 3 أيام electroporation. لcryoembedding sectioning والمضي قدما على النحو التالي.
2. التضحية الحيوانات electroporated في timepoint المطلوب. Disect خارج العين electroporated والإصلاح في بارافورمالدهيد 4 ٪ في 4 لمدة 50 دقيقة درجة مئوية.
3. إزالة بعناية في شبكية العين من العين عن طريق الجزئي تشريح بعيدا الصلبة والقرنية ، العدسة ، والمشيمية والشبكية ظهارة الصباغية. ويمكن تحليل شبكية العين تحت مضان تشريح لتحديد حد كبير كفاءة electroporation. نقل شبكية العين إلى حل السكروز 30 ٪ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
4. تجميد شبكية العين في أكتوبر البرد تضمين درجة مئوية وسائل الإعلام (ساكورا Finetek الولايات المتحدة) وتخزينها في -80 شبكية العين قد يكون الآن على مقطوع مبضع بردي واستولت على الشرائح الزجاجية.

5. ممثل النتائج :

وتعرض أمثلة على شبكية العين P0 الولدان electroporated مع تعبير pCAG - EGFP البلازميد في 3 أيام التالية electroporation (P3) و 14 يوما التالية electroporation (P14) في الشكل 4. مجال الأنسجة الشبكية electroporated هو متغير من تجربة لتجربة اعتمادا على مدى تلف الأنسجة التي تكبدتها خلال الحقن والتوزيع المتساوي للانتشار حل الحمض النووي في الفضاء تحت الشبكية. وعادة 9-10 ٪ من خلايا شبكية العين electroporated الميزة التي أدرجت بنجاح ، وأعرب عن البلازميد قدم. ومع ذلك ، عندما والعوملة في مورفولوجيا الأنسجة والكفاءة electroporation فقط 40-60 ٪ من شبكية العين electroporated تكون مناسبة لإجراء تحليل مقارن. تشكيل ريدة وانفصال الشبكية في موقع اختراق الإبرة تقريبا لاحظ دائما ويجب أن لا يتم استخدام هذه المنطقة لتحليلها. الحمض النووي انتشار ناجحة خلال النتائج microinjection في الأنسجة electroporated بكفاءة الوحشي لموقع اختراق الإبرة وريدات خالية من مفرزة. دباق هو أيضا مصدر قلق هام التجريبية ودائما تقريبا يحدث في موقع اختراق الإبرة. ومع ذلك ، كما هو الحال مع تشكيل ريدة وانفصال الشبكية ، دباق هو عادة ليست كبيرة في الأنسجة electroporated أفقيا. ويمكن استخدام علامات المناعى مثل الدبقية بروتين لييفي الحمضية (GFAP) لتحديد ما إذا كانت مستويات دباق رد الفعل في مناطق تقع ضمن تحليل عتبات مقبولة. مقطوع شبكية العين مما يدل على أن مورفولوجية الشبكية electroporated لا تزال سليمة والتسميات التي ترد التعبير EGFP electroporated الخلايا الفردية. أمثلة ترد بعد 3 أيام electroporation P0 (الشكل 4A - C) و 14 يوما عقب electroporation P0 (الشكل 4D - F).

في شبكية العين P3 تقع الغالبية العظمى من الخلايا في طبقة electroporated neuroblastic (NBL) من شبكية العين ، وعدم إظهار الخصائص المورفولوجية متميزة من أي من الخلايا العصبية أو الدبقية متباينة من شبكية العين (الشكل 4B ، C). يمكن أن تكون وجدت من قبل P14 الخلايا في طبقة electroporated النووية الخارجي (y. قل) ، وطبقة داخلية النووي (INL) من شبكية العين. علاوة على ذلك ، خلايا مختلفة المسمى الآن عرض بصمات مميزة المورفولوجية للخلايا العصبية بما في ذلك interneurons متباينة من INL ، مبصرات ، والدبقية مولر (الشكل 4E ، F).

الشكل 1. التخدير للماوس (P0) الجرو الوليد وفتح العين للحقن تحت الشبكية من محلول الحمض النووي. أ) توضع على الجرو الوليدسرير من الثلج المجروش للتخدير. وضعت وجها ليتم حقنه انخفض مقابل الجليد. ب) أن تكون قطعت موقع ظهارة وصلي تنصهر (B ، السهم) في الأجفان لفتح العين. ج) قطع في الأجفان وصلي على طول ظهارة تنصهر (C ، السهم) لكشف العين. D) وفتح العين القطع التالية عند تقاطع تنصهر. E) يتم إجراء شق في العين تحت الصلبة في أسفل القرنية لتسهيل الإدراج سهلة للحقنة المنتهية في الدقيقة حقن حادة. أشرطة النطاق ، B ، C ، D ، E : 4mm.

انتهت الشكل 2. الإدراج في كليلة الدقيقة حقن حقنة وحقن محلول الحمض النووي البلازميد في الفضاء تحت الشبكية. أ) التخطيطي الكرتون يدل على الإدراج الصحيح للحقن حقنة صغيرة في العين ، وتسوية طرف الحقنة في الفضاء تحت الشبكية. حقن محلول الحمض النووي في الغرفة الزجاجية ، سوف مرور الحقنة عن طريق العين في المقبس ، أو الحقن في العدسة نتيجة في التجارب الفاشلة مع عدد قليل وجدت خلايا electroporated. ب) الاختراق من الحقنة في شق في جدار أدلى الصلبة وتسوية طرف الحقنة في الفضاء تحت الشبكية. C) من الحل حقن الحمض النووي في الفضاء تحت الشبكية. أشرطة النطاق ، B ، C : 4mm. الاختصارات على النحو التالي : R - شبكية العين ، ولام عدسة ، والخامس الزجاجي ، مساحة SRS - تحت الشبكية ، BES - حادة انتهت المحاقن.

الشكل 3. الاتجاه من القطب منتاش على الماوس لelectroporation. أ) التخطيطي الكرتون مما يدل على اتجاه المجاذيف الإيجابية والسلبية للالقطب منتاش النسبية للعين electroporated. الأخضر يمثل الموقع من الحمض النووي حقنها في الفضاء تحت الشبكية. سهام متقطع تمثل حركة الكهربي من حقن الحمض النووي سالبة الشحنة نحو القطب الموجب. رحلان DNA يحدث من المساحة تحت الشبكية المتاخمة للقطب سلبية في شبكية العين التي هي موجهة نحو القطب الموجب. ب) يتم وضع مجداف الإيجابية للمنتاش المتاخمة للالحمض النووي microinjected العين ويتم وضع مجداف السلبية المتاخمة للعين غير المحقونة. C) صورة التكبير العليا موضع القطب منتاش على الماوس الولدان. الخطوط المتقطعة تمثل اتجاه حركة الكهربي من الحمض النووي في اتجاه القطب الموجب. مقياس شريط ، C : 5mm.

الشكل 4. الوليدية شبكية العين الماوس (P0) electroporated مع pCAG - EGFP وتحليلها في يوم ما بعد الولادة 3 (P3) وبعدها يوم 14 (P14). AC) صور متحد البؤر لشبكية العين P3 مقطوع electroporated مع pCAG - EGFP في P0. غالبية الخلايا electroporated الجلوس في طبقة الشبكية neuroblastic (NBL). (مدافع) وصور لشبكية العين متحد البؤر P14 مقطوع electroporated مع pCAG - EGFP في P0. ويمكن تحديد الخلايا في طبقة Electroporated النووية الخارجي (y. قل) ، وطبقة داخلية النووي (INL) من شبكية العين. أشرطة النطاق ، AF : 50 ميكرون.

Discussion

في الجسم الحي electroporation يمثل طريقة سريعة وفعالة لتحويل خلايا الشبكية مع التعبير البلازميدات الحمض النووي. هذا الأسلوب يسمح للمجرب لأداء وظيفة الحصول على الدراسات من خلال إدخال الجين ectopically الفائدة في ظل سيطرة المروج أعرب بتواجد مطلق أو لإجراء دراسات فقدان وظيفة ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف	شركة	رقم كتالوج	تعليقات
العازلة المشبعة الفينول	Invitrogen	15513-039	N / A
كلوروفورم	JT بيكر	9180-03	N / A
خلات الصوديوم	JT بيكر	3470-05	3 M الأسهم
الأخضر سريع FCF	فيشر في مجال التكنولوجيا الحيوية	BP123 - 10	10 ٪ الأسهم
ايزوبروبيل الإعدادية	تايكو للرعاية الصحية	6918	N / A
30 guage إبرة	Terumo الطبية كورب	SG2 - 3013	N / A
Exmire microsyringe	شركة ايتو	MS * E05	N / A
Tweezertrode (منتاش مسرى)	BTX الصك ، شركة Genetronics	522	N / A
ساحة Porator الكهربائية (electroporator)	BTX الصك ، شركة Genetronics	ECM 830	N / A
مجمع أكتوبر	ساكورا Finetek الولايات المتحدة الأمريكية.	4583	N / A