Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نحن تصف تفصيلا التصوير الخلية الحية أساليب التحقيق الكيميائي. نقدم أساليب مضان المجهري لرصد ديناميات spatiotemporal من الأحداث يشير في الخلايا المهاجرة. قياس الأحداث يشير يسمح لنا أن نفهم كذلك كيف شبكة النوع من الاختزال ، يشير يحقق التدرج الاستشعار من chemoattractants وضوابط الهجرة الاتجاه من الخلايا حقيقية النواة.

Abstract

ويمكن الكشف عن العديد من الخلايا حقيقية النواة التدرجات الاشارات الكيميائية في بيئاتهم ، وترحيل 1 تبعا لذلك. ويشار إلى هذه الهجرة كما قاد الخلية الكيميائي ، وهو أمر ضروري للخلايا مختلفة لتنفيذ وظائفها مثل الاتجار الخلايا المناعية والخلايا العصبية الزخرفة 2 ، 3. عائلة كبيرة من البروتين G - مستقبلات مقترنة (GPCRs) بالكشف عن الببتيدات الصغيرة متغير ، والمعروفة باسم chemokines ، لتوجيه الهجرة خلية في الجسم الحي 4. الهدف النهائي للبحث الكيميائي هو أن نفهم كيف يمكن لchemokine التدرجات GPCR آلات الحواس وإشارات التحكم الأحداث التي أدت إلى الكيميائي. GPCR بوساطة لتحقيق هذه الغاية ، ونحن نستخدم تقنيات التصوير للمراقبة ، في الوقت الحقيقي ، وتركيزات spatiotemporal الحركة chemoattractants الخلية ، في التدرج من جاذب كيميائي ، وتفعيل heterotrimeric البروتين G ، وإشارات بين الخلايا المشاركة في الأحداث الكيميائي للخلايا حقيقية النواة 5-8 . الكائن بسيطة حقيقية النواة ، Dictyostelium discoideum ، يعرض chemotaxic السلوكيات التي هي مماثلة لتلك الكريات البيض ، ودال. discoideum هو نظام نموذجي لدراسة مفتاح الكيميائي حقيقية النواة. كما حرر المعيشة الأميبات ، D. الخلايا في الانقسام discoideum المتوسط ​​الغنية. عند الجوع ، والخلايا إدخال برنامج التنموي الذي والتجميعية من خلال cAMP في بوساطة الكيميائي لتشكيل هياكل multicullular. وقد تم تحديد العديد من العناصر المشتركة في الكيميائي إلى مخيم في دال discoideum. الربط من المخيم إلى GPCR (cAR1) يدفع تفكك heterotrimeric G - البروتينات إلى وحدات فرعية Gγ Gβγ 7 و 9 و 10. Gβγ مفارز تنشيط رأس ، والذي ينشط في PI3K بدوره تحويل PIP 2 إلى 3 PIP على غشاء الخلية 11-13. 3 PIP بمثابة مواقع ملزم للبروتينات مع التماثل pleckstrin (PH) المجالات ، وبالتالي توظيف هذه البروتينات إلى غشاء 14 و 15. تفعيل مستقبلات cAR1 يتحكم أيضا في الجمعيات غشاء PTEN ، التي dephosphorylates PIP PIP 2 3 إلى 16 و 17. يتم الحفاظ تطويريا الآليات الجزيئية في الكيميائي GPCR chemokine بوساطة الخلايا البشرية مثل العدلات 18. نقدم الطرق التالية لدراسة الكيميائي د. discoideum الخلايا. 1. إعداد الخلايا المكون الكيميائي. 2. التصوير الكيميائي للخلايا في الانحدار المخيم. 3. تراقب تفعيل GPCR الناجم عن heterotrimeric G - البروتين في الخلايا الحية واحد. 4. تصوير جاذب كيميائي عن العوامل الدينامية PIP 3 الردود في الخلايا الحية واحد في الوقت الحقيقي. ويمكن تطبيق أساليب التصوير المتقدمة لدينا لدراسة الكيميائي من الكريات البيض البشرية.

Protocol

1. إعداد الخلايا المختصة الكيميائي من discoideum Dictyostelium

  1. لتوليد الخلايا التي يتم discoideum دال الكيميائي إلى معسكر جاذب كيميائي ، وخلايا الحصاد المتزايد في D3 - T الوسائط الغنية من ثقافة الهز حتى 22 درجة مئوية.
  2. يغسل مرتين في الخلايا غير المغذيات العازلة التنموية (DB العازلة التي تحتوي على 5 مم نا 2 هبو 4 ، 5 مم KH 2 PO 4 ، 2 مم MgCl 2 و 0.1 ملم CaCl 2).
  3. اعادة تعليق الخلايا في DB العازلة في مناطق ذات كثافة الخلايا 2x10 7 / مل.
  4. هزة 10 مل الخلايا في قارورة 250 مل بسعر 100 دورة في الدقيقة عند 22 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
  5. تسليم 100 ميكرولتر من 7.5 ميكرومتر الأسهم المخيم إلى الخلايا 10 مل كل ست دقائق أكثر من 6 ساعات لتحقيق تركيز النهائي من مخيم نانومتر 75 ، وهي عملية تسمى العلاج cAMP في النبض. بعد 5-6 ساعات من العلاج cAMP في النبض ، D. تصبح الخلايا discoideum الكيميائي المختصة الانحدار نحو المخيم.
  6. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 200 غ لمدة 5 دقائق ثم مع الخلايا resuspend العازلة DB تحتوي على مادة الكافيين 2.5 ملم ، ويهز بسرعة 200 دورة في الدقيقة في 22 دقيقة لمدة 20 درجة مئوية لbasolate الخلية إلى حالة الانجذاب الكيميائي.

2. تصوير الخلايا chemotaxing في الانحدار وضوحا وجاذب كيميائي manipulatable

  1. الردم a micropipette بمحلول الطازجة 30 ميكرولتر من مخيم ميكرومتر (1) واليكسا 594 في 0.1μg/μl العازلة في DB.
  2. إرفاق Femtotip إلى حائز micropipette وتوصيل الأنابيب لضغط جهاز العرض ، إيبندورف FemtoJet النظام.
  3. إرفاق التجمع micropipette إلى micromanipulator (إيبندورف TransferMan nk2 إليه) بمحركات micromanipulator لتوفير الضغط المستمر من أجل إقامة التدرج مستقرة.
  4. جبل LabTek غرفة واحدة مليئة جيدا 6 مل من العازلة DB عبر عدسة النفط 40X على مبائر واستخدام المجهر مشرق حقل البصريات ، مركز Femtotip في مجال الرؤية.
  5. بدوره على توريد مجموعة الضغط والضغط التعويض (PC) لمدة 70 هكتوبسكال لإنشاء التدرج من خليط 594 المخيم / اليكسا.
  6. تصور التدرج المخيم رصد خليط من التركيز المطلوب من المعسكر واليكسا 594 مضان به الإثارة مع خط ليزر 543 نانومتر.
  7. استخدام السيارات لتحديد المواقع وظيفة من micromanipulator لوضع micropipette إلى المواقع المطلوبة والمنصوص عليها في المركز 1 ، 2 موقف ، والموقف من 3 إلى التلاعب التدرج الخلية التي يتعرضون إليها.

3. نظام متحرك الخلية nonpolarized يسهل تصوير الأحداث يشير الى المشاركة في مخيم التدرج الاستشعار

  1. بعد العلاج الكافيين ، وإزالة الخلايا وقسامة الطرد المركزي في 500G لمدة 3 دقائق.
  2. إزالة العازلة وتمييع الخلايا إلى خلايا 5x10 5 / مل مع العازلة DB الطازجة التي تحتوي على الكافيين 2.5 مم.
  3. 1 مل من تطبيق تعليق خلية إلى مجلس واحد بشكل جيد أو 0.4 مل لكل جانب من الغرفة أربعة جيدا.
  4. يسمح للخلايا الالتزام لمدة 10 دقيقة ، ماصة بعناية قبالة عازلة لإزالة الخلايا غير مرتبط واستبدالها مع نفس الحجم.
  5. تحديد الخلايا المطلوب تحت المجهر وبدء التصوير.
  6. عن تجربة صممت لرصد ديناميات إشارات المكونات في تعريض الخلايا إلى الانحدار المستمر ، وعلاج الخلايا مع 5.0 ميكرومتر (تركيز النهائي) Latrunculin باء لمدة 10 دقيقة قبل التجارب.

4. في نفس الوقت رصد بروتين G heterotrimeric التنشيط والإنتاج PIP 3

  1. cAMP في تطوير خلايا النبض المشترك معربا عن GαCFP وYFPGβ (خلايا G) والخلايا معربا عن PIP مؤشر PH - 3 GFP (خلايا PH) 7.
  2. مزيج هذين النوعين من الخلايا التي تحتوي على نسبة 1:1 ومنها لوحة واحدة في غرف أو 4 بشكل جيد جيدا.
  3. إنشاء وحفظ المرجع بصمة الانبعاثات منحنى CFP ، وYFP GFP امبدا باستخدام النمط اقتناء المكدس داخل النطاق الطيفي 464-624 نانومتر مع عرض 10 نانومتر.
  4. في وقت واحد من البروتين G تنشيط الخلايا في صورة PIP 3 G والإنتاج في الخلايا باستخدام PH مع نفس النمط امدا المكدس اقتناء ضمن النطاق الطيفي 464-544 نانومتر مع زيادات 10 نانومتر.
  5. تطبيق الدالة الخطية Unmixing البرمجيات 510META زايس به حفظ CFPand YFP وبصمات الأصابع لحساب الانبعاثات رياضيا مساهمة كل fluorophore في المكدس لامدا لفصل CFP وكثافة YFP إلى القنوات الفردية في G.
  6. مع الاستراتيجية ذاتها ، وتطبيق وظيفة Unmixing الخطي باستخدام GFP والبصمات المحفوظة الانبعاثات الخلفية لحساب كثافة حسابيا GFP PH في الخلايا.

5. ممثل النتائج :

  1. نظام نموذجا ممتازا للدال discoideum الكيميائي للتوسط النوع من الاختزال. الاميبا والاجتماعية ، د. المعارض discoideum a الكيميائي ضرب خلال دورة الحياة. نظرا لمزاياه الوراثية والبيوكيميائية ، D. د يوفر بقوتهاystem لدراسة الكيميائي.
  2. الكيميائي للخلايا في إطار مجالات chemoattract المرئية وmanipulatable ، وهنا نعرض أولا منهجية بسيطة للحصول على وجود علاقة خطية بين معسكر اعتقال وكثافة من صبغة الفلورسنت اليكسا 594 سلسلة التخفيف من مخيم 2 ميكرومتر مختلطة مع 10 ميكروغرام / مل الكسا 594 (الشكل 2A). المقبل ، ونحن نقدم وسيلة سهلة لتصور التدرج ، وعلاوة على ذلك ، لإنشاء القياس الكمي للتركيز معسكر متدرجة من شدة اليكسا 594 (الشكل الشكل 2B).
  3. هو uncoupled حركية الخلية مع خلية الاستقطاب والاستشعار عن اتجاهي. مثبط بلمرة أكتين يلغي موجودة من قبل الأقطاب المورفولوجية ويمنع أيضا حركة الخلية مع الحفاظ على قدرة الخلايا الاستشعار عن الاتجاه (الشكل 3A). توظيف cAMP في التحفيز وضوحا وmanipulatable يضمن المدخلات ، والتحفيز على سبيل المثال تطبق بشكل موحد أو التدرج ملف. هذا الأسلوب يسمح التحليل الكمي في مخيم الناجم عن إعادة توزيع المكونات الرئيسية يشير التدرج في آلية الاستشعار عن بعد. ديناميات spatiotemporal يقاس من هذه المكونات إشارة تتيح لنا أن نفهم كيف يمكن للشبكة يشير يحقق التكيف مع التحفيز موحدة في حين تولد ردود البيوكيميائية الاستقطاب إلى التدرجات (الشكل 3B).
  4. القياسات المنتظمة لحركية chemosensing شبكة الإشارات عند التعرض إلى الانحدار ثابتة. ومن المهم للغاية لقياس ديناميكية / حركية الاتجاه الاستشعار إشارات لفهم كيفية مكونات كل عنصر يساهم في إنشاء خلايا الاستقطاب بين الخلايا عند تجربة التدرج الأول. تطبيق التصوير الخلية الحية مع دقة عالية الإيقاع المكاني ، وتبين لنا لأول مرة ثنائي الطور PIP3 إنتاج الخلايا التي تتعرض لcAMP في الانحدار المستمر (الشكل 4A - C). تطبيق الخلية الحية التصوير ، فقد قمنا بقياس منهجية ديناميكية محددة الاتجاه الاستشعار عن التحفيز يشير شبكة المخيم لPIP3 الإنتاج (الشكل 4D ، E).
  5. في نفس الوقت رصد بروتين G heterotrimeric التنشيط والإنتاج 3 PIP على تحفيز cAMP في تطبيقها بشكل موحد. فورستر بالرنين نقل الطاقة (مختصر الحنق) على نهج فعالة لرصد heterotrimeric تنشيط بروتين G (التفكك) على تحفيز المخيم. هنا ، وصفت لدينا خبير مريحة سهلة تعتمد نظام لقياس متزامنة من heterotrimeric تنشيط بروتين G و 3 PIP الإنتاج من خلال رصد التغيير والحنق إزفاء غشاء PIP 3 التحقيق ، PH - G في GFP PH والخلايا ، على التوالي (الشكل رقم 5 ). والتحفيز cAMP في تطبيقها بشكل موحد على بروتين يطلق G التنشيط المستمر الذي يتسبب في حين عابرة PIP 3 الإنتاج.

figure-protocol-8509
الشكل 1 : وجود نظام نموذجا ممتازا للدال discoideum الكيميائي للتوسط النوع من الاختزال. ألف مخطط يبين مسار إشارات موجزة للاستشعار عن اتجاهي. باء cAMP في الانحدار السريع يدفع الكيميائي د. discoideum الخلايا. 3 التعبير عن الخلايا PIP التحقيق ، PH - GFP (الخضراء). التدرج (الأحمر) هو تصور من قبل اليكسا 594. مقياس شريط = 50μm.

figure-protocol-9032
الشكل 2 : الانجذاب الكيميائي للخلايا في إطار مجالات chemoattract المرئية وmanipulatable. رسم بياني يظهر A. وجود علاقة خطية بين معسكر اعتقال وكثافة وجود صبغة الفلورسنت اليكسا 594 سلسلة التخفيف من مخيم 2 ميكرومتر مختلطة مع 10 ميكروغرام / مل اليكسا 594. باء القياس الكمي لمعسكر الاعتقال متدرجة من علاقة خطية تركيز المخيم وكثافة اليكسا صبغة الفلورسنت 594 ألف في

figure-protocol-9578
الرقم 3 : uncoupled حركية الخلية مع خلية الاستقطاب والاستشعار عن اتجاهي. ألف صورة متحركة تظهر أن الخلايا من معاملة المانع أكتين البلمرة Latrunculin باء الحفاظ على القدرة على الاستشعار عن اتجاهي. 3 التعبير عن الخلايا PIP التحقيق ، PH - GFP (الخضراء). التدرج (الأحمر) هو تصور من قبل اليكسا 594. باء Manipulatable الخلية التحفيز ونظام المحتشد متحرك يسمح لمعالجة المسائل الرئيسية للاستشعار عن اتجاهي. مقياس شريط = 10μm.

figure-protocol-10176
الشكل 4 : قياسات الجهازية للحركية chemosensing شبكة الإشارات عند التعرض إلى الانحدار ثابتة. ألف المونتاج يظهر ثنائي الطور PIP 3 الإنتاج (الأخضر) من الخلايا التي تتعرض لcAMP في الانحدار المستمر (الأحمر). باء صورة تظهر مناطق المصالح (رويس) لقياس حركية الإنتاج المقدمة في 3 PIP C C. . حركية سPIP و 3 في إنتاج الخلايا المعرضة للتدرج لوني ثابت. دال مخطط يوضح شبكة الإشارات الاستشعار عن الاتجاه من المخيم إلى تحفيز إنتاج 3 PIP. ويرد حركية سفرهم عند التعرض لالانحدار المستمر في خطوط نفس اللون الصلبة في البريد.

figure-protocol-10963
الشكل 5 : رصد متعددة في وقت واحد من الأحداث يشير الى شبكات النوع من الاختزال. ألف مخطط يبين قياس المتزامن لتنشيط بروتين G heterotrimeric PIP والإنتاج 3 عن طريق رصد التغيير والحنق إزفاء غشاء التحقيق PIP3 ، PH - G في GFP PH والخلايا ، على التوالي. باء مونتاج للصور من مجموعة قوس قزح والخلايا PH معارض ان تحفيز cAMP في تطبيقها بشكل موحد على بروتين يطلق G التنشيط المستمر على طرفي الخلية ، في حين أن الذي يتسبب في إنتاج PIP3 عابرة. النقاط وقت قبل (0s) وبعد لتحفيز 10.2s ، 4.9s و20.4s جيم حركية تنشيط بروتين G PIP3 وبناء على تحفيز الانتاج cAMP في تطبيقها بشكل موحد.

Discussion

العمليات للوصول إلى مرحلة من الخلايا المختصة الكيميائي

لنوع البرية D. discoideum الخلايا ، فإنه يأخذ حوالي 5 ~ 6 ساعات ينبض التنمية في درجة حرارة الغرفة لدفعهم الى مرحلة جيدة الكيميائي المختصة خلال الخلايا التي تعرض التشكل جيدا الخل...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

ويؤيد هذا العمل من قبل صندوق جماعية من NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات
وسائط النمو D3 - T دك الطبية
كافيين سيغما
Latrunculin B المسابر الجزيئية
الكسا 594 المسابر الجزيئية
cAMP في سيغما
ChronTrol XT الموقت للبرمجة ChronTrol كورب
Miniplus مضخة تمعجية 3 Gilbson
شاكر منصة دوارة
FemtoJet إمدادات الضغط microcapillary إيبندورف
واحد وأربعة جيدا مختبر تيك الثاني ساترة الغرف Nalge نونك الدولية
LSM 510 META المجهر الفلورسنت أو ما يعادلها زايس a 40X 60X أو 1.3 NA NA النفط 1.4 خطة مدينة دبي للإنترنت ، Neofluar الهدف العدسة
اوليمبوس X81 أو ما يعادلها اوليمبوس يتطلب 100X 1.47 NA عدسة الهدف TIRF

References

  1. Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469-469 (2002).
  2. Murphy, P. M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).
  3. Devreotes, P. N. G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium. Neuron. 12, 235-235 (1994).
  4. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-1 (2008).
  5. Meier-Schellersheim, M. Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method. PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).
  6. Xu, X. Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Sci Signal. 3, 71-71 (2010).
  7. Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).
  8. Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing. J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).
  9. Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis. Science. 287, 1034-1034 (2000).
  10. Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2408 (2001).
  11. Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium. J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).
  12. Li, Z. Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction. Science. 287, 1046-1046 (2000).
  13. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).
  14. Meili, R. Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium. EMBO J. 18, 2092-2092 .
  15. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells. Cell. 95, 81-81 (1998).
  16. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis. Cell. 109, 611-611 (2002).
  17. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients. Cell. 109, 599-599 (2002).
  18. Haastert, P. J. V. a. n., Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

55 PCR G Dictyostelium discoideum

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved