Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum</em

Özet

Burada, kemotaksis soruşturma için ayrıntılı canlı hücre görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır. Biz göç eden hücreleri olayları sinyal Spatiotemporal dinamiklerini izlemek için floresan mikroskobik yöntemler sunuyoruz. Ölçüm sinyal olayların bir GPCR sinyal ağı daha chemoattractants ve kontroller ökaryotik hücrelerin yönlü göç algılama degrade nasıl elde ettiğini anlamak için bize izin verir.

Özet

Birçok ökaryotik hücrelerin kendi ortamlarında kimyasal sinyallerin degradeler algılar ve buna göre ¹ geçirebilirsiniz. Bu güdümlü hücre göçü, bağışıklık hücreleri ve nöronal ^{hücrelerin 2,} 3 desenlendirme ticareti gibi görevleri yürütmek için çeşitli hücreler için gerekli kemotaksis olarak adlandırılır . G-protein reseptörler büyük bir aile (GPCRs), in ^vivo 4, kemokinler olarak bilinen değişken küçük peptidler, hücre göçü doğrudan algılar . Kemotaksis araştırma nihai hedefi, bir GPCR makine duyuları kemokin Degradeleri ve kontrolleri kemotaksis için önde gelen olaylar sinyalizasyon nasıl anlamak için. Bu amaçla, biz kemoatraktan bir degrade chemoattractants, hücre hareketi uzaysal konsantrasyonlarını izlemek için gerçek zamanlı olarak görüntüleme teknikleri kullanmak, GPCR heterotrimeric G-protein aktivasyonu aracılı ve ^5-8 ökaryotik hücrelerin kemotaksis alan hücre içi sinyal olaylar . Basit ökaryot organizma, Diktiyostelyum diskodeyum, lökositlerin benzer chemotaxic davranışlar gösterir, ve D. diskodeyum ökaryotik kemotaksis eğitim için önemli bir model sistem. Serbest yaşayan amipler, D. olarak diskodeyum hücrelerin zengin orta bölün. Açlıktan sonra, hücreler multicullular yapıları oluşturmak cAMP aracılı kemotaksis aracılığıyla toplu bir gelişim programına girmek. D. cAMP kemotaksis dahil birçok bileşenleri tespit edilmiştir diskodeyum. Bir GPCR cAMP bağlama (car1) Gγ ve Gβγ altbirimden ^{7, 9, 10} Fototerapisi heterotrimeric G-proteinleri neden olur. Gβγ altbirimden sırayla aktive PI3K ₃ PIP PIP ₂ hücre zarının ^11-13 dönüştürme Ras etkinleştirin. PIP _3, böylece bu proteinlerin ^{membran 14,} 15 işe pleckstrin Homoloji (PH) etki ile proteinler için bağlanma yerleri olarak hizmet vermektedir . Car1 reseptörlerinin aktivasyonu ₃ PIP PIP ₂ ^{16, 17} dephosphorylates PTEN, membran dernekler de kontrol eder. Moleküler mekanizmaları, evrimsel olarak ^nötrofil 18 gibi insan hücrelerinin kemokin GPCR aracılı kemotaksis korunmuş . D. kemotaksis çalışmak için aşağıdaki yöntemlerden mevcut diskodeyum hücreleri. 1. Kemotaktik bileşeni hücrelerinin hazırlanması. 2. CAMP degrade hücre Görüntüleme kemotaksis. 3. , G-protein heterotrimeric tek canlı hücreler bir GPCR kaynaklı aktivasyon izleme. 4. Görüntüleme kemoatraktan tetiklenen dinamik PIP _3, gerçek zamanlı olarak tek canlı hücrelerinde yanıtlar . Bizim gelişmiş görüntüleme yöntemleri, insan lökositlerin kemotaksis çalışma yapılabilir.

Protokol

1. Diktiyostelyum diskodeyum kemotaktik yetkili hücrelerinin hazırlanması

1. Kemoatraktan cAMP, 22 sallayarak kültürünün zengin medya D3-T hasat büyüyen hücreleri ° C kemotaktik D. diskodeyum hücreleri oluşturmak için
2. (DB tampon 5 mM Na ₂ HPO _4, 5 mM KH ₂ PO _4, 2 mM MgCl _2, ve 0,1 mM CaCl ₂ içeren), besin değeri olmayan gelişim tampon hücreler iki kez yıkayın.
3. 2x10 ⁷ hücre / ml yoğunlukta DB tampon hücreleri yeniden askıya.
4. Bir saat için 100 rpm at 22 ° C 10 ml, 250 ml cam şişe içinde hücreleri iyice çalkalayın.
5. 75 nM cAMP, cAMP darbeli tedavi olarak belirlenmiş bir süreç nihai bir konsantrasyon elde etmek için 6 saat boyunca her altı dakikada bir 10 ml hücre 7.5 mcM cAMP stokunun 100 ul sunun. CAMP pulsing tedavi, D. 5-6 saat sonra diskodeyum hücreleri cAMP degrade doğru yetkili kemotaktik olur.
6. 5 dakika için 200 g santrifüj hücreleri toplamak ve sonra DB tamponu ile tekrar süspansiyon hücreleri 2.5 mM kafein içeren ve 200 rpm'de 22 sallamak ° C'de 20 dakika için kemotaktik bir durum hücre basolate için.

2. Görünür ve manipüle kemoatraktan degrade Görüntüleme chemotaxing hücreleri

1. Dolgu 1 mcM cAMP ve Alexa 594 DB tampon 0.1μg/μl az bir taze hazırlanmış 30 ul çözüm mikropipet.
2. Mikropipet sahibine Femtotip takın ve bir basınç kaynağı aparatları boru, Eppendorf FemtoJet sistemi bağlamak.
3. Istikrarlı bir degrade oluşturmak amacıyla sabit bir basınç sağlamak için mikromanipülatör motorlu bir micromanipulator (Eppendorf TransferMan NK2) mikropipet montaj takın.
4. Mount konfokal mikroskop 40X petrol lensin üzerinden 6 ml DB tampon ile dolu bir iyi LABTEK odasına ve görüş alanı içine alan parlak optik, merkezi Femtotip kullanın.
5. Basınç kaynağı açın ve cAMP / Alexa 594 karışımı bir degrade oluşturmak için 70 hPa tazminat basıncı (Adet).
6. CAMP ve Alexa 594 floresan 543 nm lazer çizgisi ile uyarma kullanarak istenilen konsantrasyon karışımı izlenmesi cAMP degrade gözünüzde canlandırın.
7. Mikromanipülatör otomatik konumlama işlevi istenilen pozisyonlar mikropipet koymak ve Pozisyonu 1 Pozisyon 2 ve 3 numaralı pozisyon için hücre maruz kaldığı degrade işlemek için onları ayarlamak için kullanın.

3. TAŞINMAZ nonpolarized hücre sistemi cAMP degrade algılama dahil görüntüleme sinyalleme olaylarını kolaylaştırır

1. Kafein tedavi 500g az 3 dakika sonra, bir kısım hücreler ve santrifüj çıkarın.
2. Tamponu çıkarın ve 2.5 mM kafein içeren taze DB tamponu ile 5x10 ⁵ hücre / ml hücreleri sulandırmak.
3. Iyi dört odanın her bir kuyu için bir tek iyi oda veya 0.4 ml 1 ml hücre süspansiyonu uygulayın.
4. 10 dakika için, dikkatlice unattached hücreleri çıkarmak ve aynı hacmi ile yerine tampon pipetle hücreleri uyması izin verin.
5. Istenilen hücrelerin mikroskop altında bulun ve görüntüleme başlayın.
6. Istikrarlı bir degrade açığa hücreleri bileşenleri sinyal dinamiklerini izlemek için tasarlanmış bir deney için, deneyler öncesinde 10 dakika süreyle 5.0 mcM (son konsantrasyon) Latrunculin B hücreleri tedavi.

4. Eşzamanlı izleme heterotrimeric G-protein aktivasyonu ve PIP ₃ üretim

1. cAMP hücreleri ortak ifade GαCFP ve YFPGβ (G hücreleri) ve hücreleri PIP ₃ gösterge PH-GFP (PH hücreleri) ⁷ ifade geliştirmek darbeli
2. 1:1 oranında ve plaka bunları tek-iyi ya da 4-kuyu odaları ile bu iki tip hücre karıştırın.
3. Oluşturun ve 10 nm genişliği ile 464 ila 624 nm spektral aralığında Lambda Yığın Acquisition modunu kullanarak emisyon parmak izi referans eğrisi CFP, YFP ve GFP kaydetmek.
4. G hücreleri ve PIP ₃ üretim, 464, 10 nm artışlarla ile 544 nm spektral aralığında aynı Lambda Yığın Toplama modu ile PH hücrelerde aynı anda görüntü G-protein aktivasyonu.
5. G. bireysel kanal içine CFP ve YFP yoğunluğu ayrı matematiksel Lambda Yığın her fluorofor katkısını hesaplamak için kaydedilmiş CFPand YFP ve emisyon parmak izlerini kullanarak Zeiss 510META yazılımı Lineer Karışmama işlevi uygular
6. Aynı strateji ile, matematiksel olarak PH hücreler, GFP yoğunluğunu hesaplamak için kaydedilmiş GFP ve arka plan emisyon parmak izlerini kullanarak doğrusal Karışmama fonksiyonu geçerlidir.

5. Temsilcisi sonuçları:

1. D. mükemmel bir model sistem sosyal bir amip, D. GPCR aracılı kemotaksis diskodeyum. diskodeyum yaşam döngüsü sırasında çarpıcı bir kemotaksis sergiler. Genetik ve biyokimyasal avantajları nedeniyle, D. d güçlü bir sistem kemotaksis çalışma.
2. Görünür ve manipüle chemoattract alanları altında hücreler, Kemotaksis Burada, biz ilk olarak 10 mg / ml ile karıştırılarak 2 mcM cAMP seyreltme dizi cAMP konsantrasyonu ve floresan boya Alexa 594 yoğunluğu arasında doğrusal bir ilişki elde etmek için basit bir yöntem gösterir Alexa 594 (Şekil 2A). Sonra, Alexa 594 (Şekil Şekil 2B) yoğunluğunu bir degrade cAMP konsantrasyonunun kantitatif bir ölçüm kurmak, dahası, degrade görselleştirmek için kolay bir yol sağlar.
3. Hücre hareketi, hücre kutuplaşma ve yön algılama Kuplajsız aktin polimerizasyonu inhibitörü önceden mevcut morfolojik polarite ortadan kaldırır ve hücrelerin yönlü algılama yeteneği (Şekil 3A) korurken aynı zamanda hücre hareketi önler. Örneğin düzgün uygulanan uyarılar veya bir degrade görünür ve manipüle cAMP stimülasyonu İstihdam, giriş garanti eder. Bu yöntem, kantitatif analiz degrade algılama makine anahtar sinyal bileşenlerinin cAMP bağlı yeniden dağıtımı sağlar. Bu sinyal bileşenlerinin Ölçülen Spatiotemporal dinamikleri gradyanlar (Şekil 3B) polarize biyokimyasal tepkileri üretirken sinyalizasyon ağı tek tip uyarılara uyum nasıl elde ettiğini anlamak için izin verir.
4. Istikrarlı bir degrade maruz üzerine sinyalizasyon ağı chemosensing kinetiği Sistemik ölçüm yön-algılama hücreleri ilk degrade karşılaştığınızda, her bir bileşenin hücre içi kutuplaşma kurulmasına nasıl katkıda bileşenleri anlamak için sinyalizasyon dinamikleri / kinetik ölçmek için çok önemlidir. Yüksek bir tempo-uzaysal çözünürlüğü ile canlı hücre görüntüleme uygulaması, ilk olarak sabit bir cAMP gradiyenti (Şekil 4A-C) maruz hücre bifazik PIP3 üretim göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme uygulamak, dinamikleri sistematik olarak ölçülen yön-algılama PIP3 üretim (Şekil 4D, E) cAMP stimülasyon belirli sinyalizasyon ağı.
5. Eşzamanlı izleme şekilde uygulanmaktadır cAMP stimülasyon üzerine heterotrimeric G-protein aktivasyonu ve PIP ₃ üretim. Förster rezonans enerji transferi (kısaltılmış FRET) cAMP stimülasyon üzerine heterotrimeric G protein aktivasyonu (disosiasyon) izlemek için etkili bir yaklaşım sağlar. Burada, değişim ve PIP membran translokasyonu sırasıyla ₃ probu, PH-G ve PH hücreler, GFP, FRET izleme (Şekil 5 heterotrimeric G protein aktivasyonu ve PIP ₃ üretim eşzamanlı ölçümü için bir kolay kolay kabul sistemi tarif .) Bir şekilde uygulanmaktadır cAMP stimülasyon, geçici bir _{PIP 3} üretim tetikleyen ise, kalıcı bir G protein aktivasyonunu tetikler.

Şekil 1: D. mükemmel bir model sistem GPCR aracılı kemotaksis diskodeyum. A. Programı yönlü algılama kısa bir sinyal yolağı gösterir. B. cAMP degrade D. hızlı kemotaksis indükler diskodeyum hücreleri. Hücreler PIP ₃ probu, PH-GFP (Yeşil) ifade eder. Gradient Alexa 594 (Kırmızı) tarafından görüntülenmiştir. Ölçek çubuğu = 50μm.

Şekil 2: görünür ve manipüle chemoattract alanlar altında hücreleri Kemotaksis. Doğrusal bir ilişki bir degrade cAMP konsantrasyonu B. Kantitatif ölçüm A. Grafik 2 mcM cAMP 10 mcg / mL Alexa 594 ile karışık bir seyreltme dizi cAMP konsantrasyonu ve floresan boya Alexa 594 yoğunluğu arasında doğrusal bir ilişki gösterir. A. floresan boya Alexa 594 cAMP konsantrasyonu ve yoğunluğu

Şekil 3: Hücre hücre polarizasyon ve yön algılama ile motilite Kuplajsız. A. Görüntü aktin polimerizasyonu inhibitörü Latrunculin B tedavisi ile hareketsiz hücreler yönlü algılama yeteneği korumak olduğunu göstermektedir. Hücreler PIP ₃ probu, PH-GFP (Yeşil) ifade eder. Gradient Alexa 594 (Kırmızı) tarafından görüntülenmiştir. B. manipüle cAMP uyarılması ve hareketsiz hücre sistemi yönlü algılama anahtar sorular adresi sağlar. Ölçek çubuğu = 10μm.

Şekil 4: istikrarlı bir degrade maruz kalma üzerine sinyalizasyon ağı chemosensing kinetiği Sistemik ölçümleri. A. Montaj C. C sunulan PIP ₃ üretim kinetiği ölçümü için sabit bir cAMP gradiyenti (Kırmızı) maruz kaldığı hücrenin bir bifazik PIP ₃ üretim (Yeşil) B. Görüntü çıkarlarının bölgeler (ROI) gösterir . Kinetik of istikrarlı bir degrade maruz kalan hücrelerde PIP ₃ üretim D. Programı cAMP stimülasyon PIP ₃ üretim yönlü algılama sinyalizasyon ağı gösterir. Onların kinetiği üzerine istikrarlı bir degrade maruz E aynı renk düz çizgiler sunulmuştur.

Şekil 5: GPCR sinyalizasyon ağları aynı anda izleme çoklu olaylar. A. Programı heterotrimeric G protein aktivasyonu ve PIP ₃ üretim değişikliği ve sırasıyla PIP3 probu, G ve PH hücrelerinin PH-GFP, membran translokasyonu FRET izleme eş zamanlı ölçümü gösterir. B. Montaj G ve PH hücreleri gökkuşağı görüntüleri gösterir geçici bir PIP3 üretim tetikleyen ise, düzgün uygulanan cAMP stimülasyon, periferik hücre kalıcı bir G protein aktivasyonunu tetikler. Zaman noktalarında 4.9s, 10.2s ve 20.4s önce (0s) ve stimülasyon sonrası C. G protein aktivasyonu ve düzgün uygulanan cAMP stimülasyon üzerine PIP3 üretim Kinetik.

Tartışmalar

Hücrelerin kemotaktik yetkili sahne ulaşma süreçleri

Vahşi tip D. diskodeyum hücreleri, onu alır, yaklaşık 5 ~ 6 saat oda sıcaklığında geliştirme darbeli, hücreler de kutuplaşmış bir hücresel morfoloji ve hızlı hücre göçü (Şekil 1) görüntüleme sırasında iyi bir kemotaktik yetkili sahne onları ikna etmek için. Nabız gibi atan, sıcaklık ve farklı genetik geçmişleri cAMP konsantrasyonu gibi çeşitli faktörler, kemotaktik yetkili evre ulaşma sürec...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
D3-T Büyüme Medya	KD Tıp
Kafein	Sigma
Latrunculin B	Moleküler Probları
Alexa 594	Moleküler Probları
cAMP	Sigma
ChronTrol XT programlanabilir zamanlayıcı	ChronTrol Corp
Miniplus 3 peristaltik pompa	Gilbson
Platform döner çalkalayıcı
FemtoJet microcapillary basınç kaynağı	Eppendorf
Tek ve dört iyi Lab-Tek II coverglass odaları	Nalge Nunc International
EKK 510 META ya da eşdeğer floresan mikroskop	Zeiss		40X 1.3 NA veya 60X 1.4 NA yağ DIC Plan-Neofluar objektif lens
Olympus X81 veya eşdeğeri	Olympus		100X 1.47 NA TIRF objektif lens gerektirir