קולטן הדמיה G-חלבון יחד (GPCR) בתיווך אירועים איתות כי הפיקוח של Chemotaxis Discoideum Dictyostelium</em

Summary

כאן אנו מתארים מפורט לחיות הדמיה תא שיטות החקירה chemotaxis. אנו מציגים שיטות מיקרוסקופיות הקרינה לפקח על הדינמיקה של spatiotemporal איתות אירועים בתאים נודדות. מדידה של אירועים איתות מאפשר לנו עוד להבין כיצד רשת GPCR-איתות משיגה שיפוע חישה של chemoattractants בקרות כיווני ההגירה של התאים האיקריוטים.

Abstract

התאים האיקריוטים רבים ניתן לזהות הדרגתיים של אותות כימיים בסביבה שלהם ולהעביר בהתאם ^1. הגירה זו תא מודרך הוא כאמור chemotaxis, שהוא חיוני עבור תאים שונים כדי לבצע את תפקידם כגון סחר של תאים חיסוניים דפוסים של תאים עצביים ^{2, 3.} משפחה גדולה של חלבון ה-G-מצמידים קולטנים (GPCRs) מזהה פפטידים קטנים משתנה, המכונה chemokines, לכוון את נדידת תאים in vivo ^4. המטרה הסופית של chemotaxis המחקר היא להבין כיצד החושים מכונות GPCR chemokine הדרגתיים בקרות אירועים איתות המובילים chemotaxis. לשם כך אנו משתמשים בטכניקות הדמיה לפקח, בזמן אמת, ריכוזי spatiotemporal התנועה, chemoattractants תא שיפוע של chemoattractant, בתיווך GPCR הפעלה של חלבון ה-G-heterotrimeric, ואירועים איתות תאיים המעורבים chemotaxis של התאים האיקריוטים ^5-8 . האורגניזם אוקריוטים פשוטה, discoideum Dictyostelium, מציג התנהגויות chemotaxic הדומים לאלה של לויקוציטים, וד ' discoideum היא מערכת מודל מפתח לחקר chemotaxis האיקריוטים. כפי חופשית חיים אמבות, ד תאים discoideum לחלק במדיום עשיר. עם רעב, תאים להזין תוכנית התפתחותית שבה הם מצטברים דרך המחנה בתיווך chemotaxis כדי ליצור מבנים multicullular. רכיבים רבים מעורבים chemotaxis למחנה זוהו ד discoideum. הכריכה של המחנה GPCR (cAR1) גורמת ניתוק של heterotrimeric G-חלבונים לתוך Gγ ואת יחידות משנה Gβγ ^{7, 9, 10.} יחידות משנה Gβγ להפעיל ראס, אשר בתורו מפעיל PI3K, המרת PIP ₂ לתוך PIP ₃ על קרום התא ^11-13. PIP ₃ לשמש אתרי קישור החלבונים עם הומולוגיה pleckstrin (PH) תחומים, ובכך לגייס אלו חלבונים בקרום ^{14, 15.} ההפעלה של רצפטורים cAR1 שולט גם עמותות הממברנה של PTEN, אשר dephosphorylates PIP PIP ₂ ל ₃ ^{16, 17.} מנגנונים מולקולריים הם באבולוציה ב chemotaxis chemokine GPCR בתיווך של תאים אנושיים כגון נויטרופילים ^18. אנו מציגים מהשיטות הבאות לחקר chemotaxis ד discoideum תאים. 1. הכנת התאים המרכיבים chemotactic. 2. Chemotaxis הדמיה של תאים מפל cAMP. 3. ניטור הפעלת GPCR המושרה של heterotrimeric G-חלבון בתאים חיים אחת. 4. הדמיה chemoattractant-PIP מופעלות דינמי ₃ תגובות בתאים חיים יחיד בזמן אמת. שיטות שפותחו שלנו הדמיה ניתן ליישם מחקר chemotaxis של לויקוציטים אנושיים.

Protocol

1. הכנת התאים המוסמכת chemotactic של discoideum Dictyostelium

1. כדי לייצר תאים ד discoideum כי הם chemotactic למחנה chemoattractant, תאים הקציר הגוברת D3-T מדיה עשירה מתרבות רועד ב 22 ° C.
2. לשטוף את התאים פעמיים חיץ שאינו מזין התפתחותי (חיץ DB המכיל 5 mM Na ₂ HPO _4, 5 מ"מ KH ₂ PO _4, 2 מ"מ MgCl _2, 0.1 מ"מ CaCl _2).
3. Re-להשעות תאים חיץ DB בצפיפות של 2x10 ⁷ תאים / מ"ל.
4. Shake 10 תאים מ"ל בבקבוק 250 מ"ל ב 100 סל"ד ב 22 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
5. ספק 100 μl של המניה 7.5 מיקרומטר cAMP ל 10 תאים מ"ל כל שש דקות מעל 6 שעות כדי להשיג הריכוז הסופי של מחנה 75 ננומטר, תהליך המיועד לטיפול cAMP פועם. לאחר 5-6 שעות של טיפול cAMP פועם, ד תאים discoideum להיות chemotactic המוסמכת שיפוע לכיוון המחנה.
6. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה ב 200 גרם במשך 5 דקות ואז התאים resuspend עם חיץ DB המכיל קפאין 2.5 מ"מ, וללחוץ על 200 סל"ד ב 22 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי basolate התא למצב chemotactic.

2. הדמיה chemotaxing תאים צבע chemoattractant גלוי למניפולציה

1. למילוי micropipette עם פתרון מוכן טרי 30 μl של מחנה 1 מיקרומטר ו אלקסה 594 ב 0.1μg/μl במאגר DB.
2. צרף את Femtotip לבעל micropipette ולחבר את צינורות אל מנגנון אספקת הלחץ, מערכת Eppendorf FemtoJet.
3. צרף את הרכבה micropipette כדי micromanipulator (Eppendorf TransferMan NK2) ממונע micromanipulator לתת לחץ קבוע על מנת ליצור שיפוע יציב.
4. הר תא אחד טוב LabTek מלא 6 מ"ל של חיץ DB על העדשה שמן 40X על מיקרוסקופ confocal ולהשתמש בהיר בתחום האופטיקה, במרכז Femtotip לשדה הראייה.
5. הפעל את אספקת הלחץ ולהגדיר את הלחץ פיצוי (PC) עבור 70 hPa להקים שיפוע של התערובת 594 cAMP / Alexa.
6. דמיינו מפל cAMP על ידי ניטור תערובת של הריכוז הרצוי של המחנה אלקסה 594 הקרינה באמצעות עירור עם קו 543 ננומטר לייזר.
7. שימוש אוטומטי מיצוב תפקידו של micromanipulator לשים micropipette לעמדות הרצוי ולהגדיר אותם 1 מיקום, מיקום 2, ומיקום 3 לתפעל את שיפוע אשר תא חשופים.

3. תא נייח מערכת nonpolarized מקלה אירועים הדמיה איתות מעורבים במחנה שיפוע חישה

1. לאחר הטיפול בקפאין, להסיר aliquot של תאים צנטריפוגות ב 500 גרם במשך 3 דקות.
2. הסר חוצץ ו לדלל התאים 5x10 ⁵ תאים / מ"ל עם חיץ DB טרי המכיל קפאין 2.5 מ"מ.
3. החל 1 מ"ל של השעיה תא לתא בודד טוב או 0.4 מ"ל היטב בכל תא ארבעה באר.
4. אפשר לדבוק תאים עבור 10 דקות, בזהירות פיפטה את החיץ להסיר תאים פנויים ולהחליף עם נפח זהה.
5. אתר את התאים תחת מיקרוסקופ הרצוי ולהתחיל הדמיה.
6. לצורך ניסוי שנועד לפקח על הדינמיקה של איתות רכיבים בתאים לחשוף את שיפוע יציב, לטיפול בתאים עם 5.0 מיקרומטר (הריכוז הסופי) Latrunculin ב 10 דקות לפני הניסויים.

4. ניטור סימולטני heterotrimeric חלבון G הפעלה PIP ₃ הייצור

1. cAMP פועם לפתח תאים שיתוף להביע GαCFP ו YFPGβ (תאים G) ותאי להביע PIP ₃ אינדיקטור PH-GFP (תאים PH) ^7.
2. מערבבים את שני סוגי תאים עם יחס 1:1 ו צלחת אותם לתאי אחד טוב או 4-היטב.
3. צור ושמור את טביעת האצבע פליטת התייחסות עקומת CFP, YFP ו-GFP באמצעות רכישת Lambda מצב סטאק בטווח הספקטרום מ 464 ל 624 ננומטר עם רוחב של 10 ננומטר.
4. במקביל תמונה חלבון G הפעלה בתאים G _ו-3-PIP ייצור תאים עם PH באמצעות רכישת אותו במצב Lambda סטאק בטווח הספקטרום 464-544 ננומטר עם 10 ננומטר במרווחים.
5. החל לתפקד unmixing שכבות של תוכנת 510META Zeiss באמצעות הציל CFPand YFP ואת טביעות אצבעות פליטת מתמטית כדי לחשב את התרומה של כל fluorophore בערימה Lambda להפריד את CFP ועוצמת YFP לאפיקים בודדים G.
6. עם אסטרטגיה דומה, להחיל unmixing פונקציה לינארית באמצעות GFP ניצלו פליטה טביעות אצבעות רקע מתמטי לחישוב עוצמת ה-GFP בתאים PH.

5. נציג התוצאות:

1. מערכת מודל מצוינת של ד discoideum עבור chemotaxis GPCR בתיווך. אמבה חברתיים, ד discoideum תערוכות chemotaxis בולט במהלך מחזור החיים. בשל יתרונות גנטיים ביוכימיים שלה, ד ד מספק של עוצמהystem ללמוד chemotaxis.
2. Chemotaxis של תאים תחת שדות chemoattract גלוי למניפולציה. הנה, אנחנו הראשונים להראות מתודולוגיה פשוטה כדי להשיג קשר לינארי בין מחנה הריכוז לבין עוצמת צבע פלואורסצנטי אלקסה 594 על ידי שורה דילול של מחנה 2 מיקרומטר מעורבב עם 10 מיקרוגרם / מ"ל Alexa 594 (איור 2 א). הבא, אנחנו מספקים דרך קלה כדי להמחיש את שיפוע יתר על כן, להקים מדידה כמותית למחנה הריכוז של צבע מעוצמת Alexa 594 (איור איור. 2B).
3. תנועתיות התא הוא זוגיים עם הקיטוב תא חישה כיוונית. מעכב פילמור אקטין מבטלת קיימים הקוטביות מורפולוגיים גם מונע תנועת התא תוך שמירה על יכולת של התאים של חישה כיוונית (איור 3A). התעסוקה של גירוי cAMP גלוי למניפולציה ערבויות קלט, למשל גירויים אחיד או שיפוע. שיטה זו מאפשרת ניתוח כמותי של חלוקה מחדש cAMP-Induced של רכיבים איתות מפתח במנגנון שיפוע חישה. הדינמיקה spatiotemporal מדודים של רכיבים אלה איתות מאפשרים לנו להבין כיצד רשת איתות משיגה הסתגלות גירויים אחיד תוך יצירת תגובות ביוכימיות מקוטב אל הדרגתיים (איור 3B).
4. מדידות מערכתית של קינטיקה של chemosensing רשת איתות בחשיפה שיפוע קבוע. זה קריטי על מנת למדוד את הדינמיקה / קינטיקה של כיוונית חישה איתות רכיבים להבין איך כל מרכיב תורם להקמת קיטוב תאיים, כאשר התאים חווים שיפוע הראשון. יישום של הדמיה תא חי עם החלטה הקצב מרחבית גבוהה, אנחנו הראשונים מראים ייצור biphasic PIP3 של התא שבו הוא נחשף מפל cAMP יציב (איור 4A-C). יישום הדמיה תא חי, יש לנו למדוד באופן שיטתי את הדינמיקה של כיוונית חישה רשת איתות ספציפיים גירוי cAMP לייצור PIP3 (איור 4D, E).
5. ניטור סימולטני heterotrimeric חלבון G הפעלה PIP ₃ הייצור על גירוי cAMP אחיד. פורסטר תהודה העברת אנרגיה (מקוצר סריג) מספק גישה יעילה לעקוב heterotrimeric הפעלת חלבון G (דיסוציאציה) על גירוי המחנה. כאן, אנו תיאר מערכת נוח וקל לאמץ מדידה בו זמנית של הפעלת חלבון G heterotrimeric ₃ הייצור PIP על ידי ניטור סריג שינוי טרנסלוקציה בממברנה של PIP ₃ בדיקה, PH-GFP בסול ותאי PH, בהתאמה (איור 5 ). גירוי cAMP אחיד מעורר הפעלת חלבון G בעוד מתמשך אשר מעורר ייצור חולף ₃ PIP.

איור 1: מערכת מודל מצוינת של ד discoideum עבור chemotaxis GPCR בתיווך. א Scheme מציגה מסלול איתות קצר של חישה כיוונית. שיפוע ב cAMP גורם chemotaxis המהירה של ד discoideum תאים. תאים להביע ₃ PIP בדיקה, PH-GFP (ירוק). צבע (אדום) הוא מדמיין על ידי אלכסה 594. בר סולם = 50μm.

איור 2: Chemotaxis של תאים תחת שדות chemoattract גלוי למניפולציה. גרף א 'מציג מערכת יחסים בין ליניארי למחנה הריכוז והעוצמה של פלורסנט לצבוע אלקסה 594 על ידי שורה דילול של מחנה 2 מיקרומטר מעורבב עם 10 מיקרוגרם / מ"ל אלקסה 594. מדידה כמותית ב למחנה הריכוז של צבע על ידי הקשר הליניארי למחנה הריכוז והעוצמה של פלורסנט לצבוע אלקסה 594 א '

איור 3: תנועתיות התא הוא זוגיים עם הקיטוב תא חישה כיוונית. תמונה א 'מראה כי התאים ללא תנועה על ידי טיפול של פילמור אקטין מעכב Latrunculin B לשמור על יכולת חישה של כיווניות. תאים להביע ₃ PIP בדיקה, PH-GFP (ירוק). צבע (אדום) הוא מדמיין על ידי אלכסה 594. B. למניפולציה גירויים תנועה cAMP מערכת התא מאפשר לענות על שאלות המפתח של חישה כיוונית. בר סולם = 10μm.

איור 4: מדידות מערכתית של קינטיקה של chemosensing רשת איתות בחשיפה שיפוע קבוע. א מונטאז' מראה PIP biphasic ₃ הייצור (ירוק) של התא, אשר נחשף מפל cAMP יציב (אדום). B. תמונה המציגה את האזורים של אינטרסים (ROIs) למדידת קינטיקה של ייצור PIP ₃ הציג ב C. C . קינטיקס oו ₃ ​​PIP ייצור התאים נחשפים שיפוע קבוע. ד Scheme מראה את רשת איתות של חישה כיוונית מן גירוי cAMP לייצור PIP _3. קינטיקה שלהם בחשיפה שיפוע קבוע מוצג הקווים באותו צבע מוצק E.

איור 5: ניטור סימולטני רב אירועים של רשתות איתות GPCR. תוכנית א 'מראה מדידה בו זמנית של הפעלת חלבון G heterotrimeric ₃ הייצור PIP על ידי ניטור סריג שינוי טרנסלוקציה בממברנה של PIP3 בדיקה, PH-GFP בסול ותאי PH, בהתאמה. מונטאז' של תמונות ב קשת של G ו-PH מראה תאים כי גירוי cAMP אחיד מעורר הפעלת חלבון G מתמשך על התא הפריפריה, בעוד אשר מעורר ייצור חולף PIP3. נקודות הזמן הן לפני (0s) ואחרי גירוי עבור 4.9s, 10.2s ו 20.4s. ג קינטיקה של הפעלת חלבון G ו PIP3 הייצור על גירוי מחנה אחיד.

Discussion

תהליכי להגיע לשלב המוסמכת chemotactic של תאים

עבור סוג ד בר תאים discoideum, זה לוקח בערך 5 ~ 6 שעות פועם פיתוח בטמפרטורת החדר כדי לגרום להם לשלב היטב chemotactic מוסמך שבמהלכו התאים להציג מורפולוגיה הסלולר מקוטב היטב נדידת תאים מהיר (איור ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
D3-T צמיחה מדיה	KD רפואי
קפאין	סיגמא
Latrunculin B	מולקולרית בדיקות
אלכסה 594	מולקולרית בדיקות
cAMP	סיגמא
ChronTrol XT לתכנות טיימר	ChronTrol קורפ
Miniplus 3 peristaltic משאבה	Gilbson
פלטפורמה רוטרי שייקר
FemtoJet אספקת הלחץ microcapillary	Eppendorf
סינגל וארבע היטב Lab-Tek II coverglass לתאי	Nalge Nunc הבינלאומי
LSM 510 META או מיקרוסקופ פלואורסצנטי המקבילה	Zeiss		40X 1.3 NA או 60x 1.4 NA-DIC שמן תוכנית Neofluar אובייקטיבי עדשה
אולימפוס X81 או שווה ערך	אולימפוס		דרוש 100x 1.47 NA העדשה TIRF אובייקטיבי