في ضوء بارد التصوير حيوية الجسم الحي من نقص الأكسجة ورم من الدماغ الانبثاث سرطان الثدي في نموذج الفأر

Summary

يتم تطبيق تلألؤ بيولوجي التصوير من نقص الأكسجة النشاط عامل محرض 1α لرصد نقص الأكسجة الورم داخل القحف التنمية في الدماغ سرطان الثدي نموذج الفأر الانبثاث.

Abstract

ومن المعروف جيدا أن نقص الأكسجة الورم يلعب دورا هاما في تعزيز التقدم الخبيثة والتي تؤثر سلبا على استجابة علاجية. هناك القليل من المعرفة حول في الموقع ، ونقص الأكسجين ، فيفو ورم داخل الجمجمة من خلال تطوير أورام الدماغ الخبيثة بسبب الافتقار إلى وسائل فعالة لرصد ذلك في هذه الأورام العميقة الجذور مثلي. التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI) ، استنادا إلى الكشف عن الضوء المنبعث من الخلايا الحية التي تعبر عن الجين luciferase ، اعتمد بسرعة لأبحاث السرطان ، وخاصة لتقييم نمو الأورام أو التغيرات في حجم الورم الاستجابة للعلاج في الدراسات الحيوانية قبل السريرية. علاوة على ذلك ، معربا عن الجين مراسل تحت سيطرة تسلسل المروج ، يمكن رصد الجينات المحددة غير جراحية بواسطة BLI. تحت ضغط نقص الأوكسجين ، وتوسط الاستجابات يشير أساسا عن طريق عامل محرض نقص الأكسجة 1α (مؤسسة الحرمين ، 1α) لمحرك النسخ من الجينات المختلفة. ولذلك ، فقد استخدمنا بناء مؤسسة الحرمين مراسل - 1α ، 5HRE ونيف لوك ، transfected ستابلي في سرطان الثدي البشرية MDA - MB231 يتم تنفيذ الخلايا (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc) ، وفي الفحص المختبري تلألؤ بيولوجي مؤسسة الحرمين ، التي 1α تفرخ الخلايا transfected ميتة في غرفة (0.1 ٪ O ₂₎ لمدة 24 ساعة قبل BLI ، في حين أن الخلايا في normoxia (21 ٪ O ₂₎ بمثابة السيطرة. تدفق الفوتون أعلى بكثير لوحظ نقص الأكسجة الخلايا تحت تقترح زيادة مؤسسة الحرمين - 1α ملزمة لمروج والخمسين (HRE العناصر) ، بالمقارنة مع تلك الموجودة في normoxia. يتم حقن الخلايا مباشرة في مخ الفأر لإنشاء نموذج الدماغ سرطان الثدي ثانوي لورم خبيث. التصوير في تلألؤ بيولوجي فيفو ديناميات نقص الأكسجة الورم يبدأ 2 أسبوعا بعد زرع وكرر مرة واحدة في الاسبوع. BLI يكشف زيادة الإشارات الضوئية من الدماغ كما تقدم الورم ، مشيرا الى زيادة نقص الأكسجة الورم داخل القحف. وتستخدم الدراسات النسيجية والمناعية لتأكيد نتائج التصوير في الجسم الحي. هنا ، سوف نقدم للمناهج في فحص المختبر تلألؤ بيولوجي - 1α مؤسسة الحرمين ، وإنشاء الجراحي للورم خبيث في الدماغ سرطان الثدي في ماوس عارية وتطبيقها في مجال التصوير تلألؤ بيولوجي المجراة داخل الجمجمة لرصد نقص الأكسجة الورم.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل الحيوان رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية استخدام جامعة تكساس جنوب غرب المركز الطبي.

1. فحص المختبر وفي تلألؤ بيولوجي مؤسسة الحرمين - 1α

1. المواد والطرق :
   • وكان سرطان الثدي النقيلي الإنسان خط الخلية MDA - MB231 transfected مع الجينات رواية مراسل مؤسسة الحرمين - 1 - تعتمد ، ولدت ونيف 5HRE لوك هارادا بواسطة د.
   • في حالة نقص الأوكسجين ، هو الدافع وراء التعبير تعزيز نطاق التدهور التي تعتمد على الأكسجين (ODD) - Luciferase انصهار بروتين بنسبة 5 نسخ من نقص الأكسجين للاستجابة عنصر (5HRE). وجود ODD أسباب تدهور ODD لوك البروتين منخفضة للغاية مما أدى إلى نشاط الخلفية في ظروف luciferase normoxic. ولذلك ، يمكن استخدام هذا النظام رواية للكشف عن مناطق ميتة في الورم عن طريق التصوير في الوقت الحقيقي. وقد تم الإبلاغ عن بناء هذا التعبير ناقلات 5HRE ونيف من قبل لوك ^1،2 هارادا آخرون.
2. ثقافة الخلايا أو نقص الأكسجين تحت normoxia :
   • الحفاظ على المؤتلف MDA - MB231 الخلايا في مصل بقري جنيني من 10 ٪ (FBS) - DMEM المتوسط ​​تحتوي على 1 ٪ الجلوتامين ، والمضادات الحيوية من 400 ميكروغرام / مل من G418 و 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين.
   • لفحص المختبري في تلألؤ بيولوجي - 1α مؤسسة الحرمين ، لوحة 3 × 10 ⁵ MDA - MB231 الخلايا معربا عن 5HRE ونيف لوك النواقل في كل بئر من صحن الستة مواطنان جيدا.
   • يسمح للخلايا إرفاق الجدار الطبق بعد الحضانة بين عشية وضحاها ومن ثم نقل طبق واحد في غرفة نقص الأكسجة (بيلوبس - روتنبرغ ، وشركة ديل مار ، كاليفورنيا) للدراسات نقص الأكسجين ، في حين تبقي الطبق الأخرى بموجب شرط normoxic (21 ٪ O _2).
   • يحشدوا الغرفة وغرفة الغاز بنسبة 0.1 ٪ O ₂ من خلال ربط أنابيب مدخل الميناء مع اسطوانة الغاز.
     ملاحظة : كل مدخل ومخرج منفذ المشابك يجب أن تكون مفتوحة خلال هذا الإجراء.
   • قطع مصدر للغاز بعد أن تم تطهير غرفة غرفة وختم عن طريق إغلاق المشابك البلاستيكية.
   • المكان غرفة في الحاضنة 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO _2.
     ملاحظة : يجب أن تكون غرفة ترطيب لمنع التبخر المفرط للثقافات. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق وضع 10-20 مل ماء معقم في الغرفة.
3. تلألؤ بيولوجي مقايسة :
   • بعد 24 ساعة الحضانة ، إزالة المتوسطة وغسل الخلايا بسرعة مع الثلج الباردة PBS (2X).
   • إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة مع 100 ميكرولتر من Luciferin (الذهب التكنولوجيا الحيوية ، وسانت لويس ، MO).
   • اكتساب BL التصوير (IVIS نظام الطيف ، العلوم الحياتية الفرجار ، Hopkinton ، MA) مع أوقات التعرض مختلف (1 ، 30 ، 60 ، 180 ق).
   • قياس شدة الضوء في كل جيدا باستخدام البرنامج صورة حية (الفرجار علوم الحياة).

2. إنشاء نموذج الانبثاث الدماغ سرطان الثدي

1. إعداد الخلايا MDA-MB231/5HRE-ODD-luc
   • استرداد والثقافة الخلايا MDA-MB231/5HRE-ODD-luc في المتوسط ​​تحتوي على 10 ٪ ديم FBS ، 1 الجلوتامين ٪ و 1 ٪ البنسلين / الستربتوميسين.
   • استبدال المتوسط ​​كل 2-3 أيام. Tripsinize وغسل الخلايا عندما تصل إلى نقطة التقاء 80 ٪.
   • عد عدد مناسب من الخلايا وresuspend لهم في مصل المتوسطة ديم الحرة مع Matrigel 25 ٪ دينار بحريني (العلوم البيولوجية ، وسان خوسيه ، كاليفورنيا) مع التركيز النهائي للخلايا في 4 ⁵ 10 حجم ميكرولتر.
   • مكان الخلايا على الجليد قبل الحقن داخل القحف.
2. الجراحية زرع
   • وتستخدم في 4-6 أسابيع من العمر في هذه الدراسة ؛ عارية الفئران الإناث (المعهد الوطني للسرطان في بيثيسدا ، دكتوراه في الطب BALB / ج نو / نو).
   • تخدير (3 ٪ isoflurane / O2 في غرفة التحريض ؛ isoflurane من باكستر انترناشيونال ، ديرفيلد ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية) والمحافظة على الحيوانات مع isoflurane (1 ٪) في الأكسجين (1 دسم ³ / دقيقة) خلال العملية الجراحية ^3.
   • وينبغي هيأهم الجلد الجدارية اليمنى مع betadine ثم 70 ٪ كحول قبل شق.
   • استخدام تدريبات عالية السرعة ، ولدغ حفرة 1 مم في النصف الأيمن من الجمجمة ، 1MM الأمامي إلى الدرز الإكليلي و 2 مم الجانبي لخياطة saggital.
   • رسم 4 خليط الخلية ميكرولتر (10 ⁵ خلايا) باستخدام حقنة 10 ميكرولتر هاميلتون (هاميلتون شركة رينو ، NV). حقن الخلايا مباشرة الى الدماغ البيني الذيلية الحق ، و 1.5 ملم تحت الأم الجافية باستخدام إبرة مصنوعة خصيصا هاميلتون 32G. الحفاظ على الإبرة في مكانها لمدة 30 ثانية قبل الانسحاب. استخدام إبر غرامة 32G يقلل تلف الأنسجة.
   • ملء الحفرة لدغ بالشمع العظام وإغلاق فروة الرأس مع الغرز للامتصاص.
   • تعد منطقة شق مع الكحول 70 ٪.
   • البوبرينورفين تطبيق تسكين كل ساعة 12 لمدة يومين.

3. المجراة في التصوير تلألؤ بيولوجي ديناميات نقص الأكسجة ورم في المخ الانبثاث سرطان الثدي

• بدء التصوير الطولي تلألؤ بيولوجي (IVIS نظام الطيف) بعد اسبوعين من زرع داخل القحف وكرر مرة واحدة في الأسبوع لمدة 8-10 أسابيع.
• تخدير three الفئران في وقت واحد (3 ٪ isoflurane / O ₂ في غرفة الاستقراء)
• إدارة حلا مد luciferin (120 ملغم / كغم في برنامج تلفزيوني في الحجم الإجمالي من 80 ميكرولتر ؛ التكنولوجيا الحيوية الذهب) تحت الجلد في منطقة الرقبة من كل الماوس كما هو موضح بالتفصيل سابقا ^4.

D - luciferin غير سامة ، ولقد ثبت أن تكون قادرة على اختراق دروع سليمة حاجز الدم في الدماغ (BBB) ​​و ^3،5 أغشية الخلايا.

• مكان الفئران 3 في غرفة التصوير وصيانتها مع isoflurane (1 ٪) في الأكسجين (1 دسم ³ / دقيقة) أثناء التصوير.
• بعد خمس دقائق من الحقن luciferin واكتساب BL التصوير مع مجموعة من وقت التعرض مختلفة (1 ، 30 ، 60 ، 180 ق).

ملاحظاتنا تبين أن وقت الذروة انبعاث الضوء حوالي 5 دقائق بعد تناوله تحت الجلد من luciferin في منطقة الرقبة ^3،4.

• تحليل البيانات مع البرامج الحية التصوير (الفرجار العلوم الحياتية) باستخدام تعول مطلقة الفوتون (الفوتونات / ثانية) في المنطقة ذات الاهتمام (ROI) ، رسمها يدويا لمخطط إشارة BLI من الدماغ.
• منحنى مؤامرة دوام الفوتون من التهم تشير إلى ديناميات نقص الأكسجة الورم.
• مباشرة بعد BLI الماضي ، إدارة pimonidazole ، علامة نقص الأكسجة و 1 ساعة في وقت لاحق ، والتضحية في الفئران وتشريح أدمغة. تضمين العقول كلها في درجة الحرارة المثلى للقطع (أكتوبر) والمتوسطة وتجميد المجمد -80 درجة مئوية. النسيجي لاحقة تلطيخ البنفسج Cresyl وتلطيخ المناعى ضد luciferase ، pimonidazole علامة نقص الأكسجين ، ومؤسسة الحرمين 1α - يؤديها للتحقق من صحة الملاحظات التصوير.

4. ممثل النتائج :

وكما هو مبين في Fig.1 ، لاحظ زيادة كبيرة بعد إشارة BLI الخلايا transfected المحتضنة في غرفة ميتة (1 ٪ O ₂₎ لمدة 24 ساعة. ولوحظ ضعف انبعاث ضوء من الخلايا تحت السيطرة normoxia. قد يكون هذا نتيجة من السكان زنزانة مكتظة بعد ساعة الثقافة 24 من 3 × ⁵ 10 الخلايا التي يسببها الإجهاد إشارة إلى الخلايا لمؤسسة الحرمين overexpress - 1α. ومع ذلك ، في نتائج BLI فيفو والتصديق عليها من قبل تلطيخ المناعى تظهر colocalization بين الورم نقص الأكسجة والتعبير luciferase.

صفيف الآلي مرات التعرض المستمر للتمكن اقتناء سلسلة من الصور ، مما يسهل التقاط إشارة ضعيفة مع التعرض قتا أطول ، وإشارات قوية باستخدام أقصر وقت دون تشبع اتفاقية مكافحة التصحر.

الرقم (1) في المختبر فحص تلألؤ بيولوجي مؤسسة الحرمين ، 1α الصف الأعلى : 3 × 10 ⁵ خلايا MDA-MB231/5HRE-ODD-luc المحتضنة في كل بئر 6 - صحن بشكل جيد في غرفة نقص الأكسجين (O ₂ 0.1 ٪) لمدة 24 قبل ساعة والمتوسطة وإزالتها ، وتغسل واستبدالها PBS 1 مل. ومباشرة بعد تمت إضافة 100 luciferin ميكرولتر في كل بئر ، استحوذت BLI مع مجموعة من التعرض مرات (1 ، 30 ، 60 ، 180 ق). ولوحظ التلألؤ قوية من الآبار ممثل الصف السفلي : ونتيجة لسيطرتها ، 3 × 10 ⁵ الخلايا المحتضنة تحت normoxia (21 ٪ O ₂₎ ينبعث الضوء الضعيف.

الرقم 2 في التصوير تلألؤ بيولوجي فيفو ديناميات نقص الأكسجة الورم. وكان أ) إشارة ضوئية ضعيفة من الجانب الأيمن من الدماغ الماوس first تصور بعد 5 أسابيع من زرع داخل القحف MDA-MB231/5HRE-ODD-luc خلايا سرطان الثدي. وقد لوحظ زيادة إشارة ضوئية على مدى الأسابيع 6 إضافية ، مشيرا إلى زيادة نقص الأكسجة الورم. B) والمؤامرة وأظهرت منحنى دوام الفوتون من التهم كمية من الإشارات الضوئية.

الشكل 3 Colocaliztion luciferase من نقص الأكسجين والكشف عنها بواسطة immunohisto الكيميائية تلطيخ. وكان من مخ الفأر المجمدة تحمل ورم خبيث من سرطان الثدي MDA-MB231/5HRE-ODD-luc مضمن في أكتوبر مقطوع. immunostained قسم ميكرومتر مع 10 علامة ميتة ، pimonidazole ، كشفت عدم التجانس intratumoral من نقص الأكسجين ، الذي عثر عليه لربط مكانيا مع التعبير luciferase الكشف عن الألغام المضادة للluciferase تلطيخ. شريط النطاق ، 100 ميكرون.

Discussion

ورم خبيث في الدماغ سرطان الثدي يحدث في 30 ٪ من مرضى سرطان الثدي في المرحلة الرابعة. يترافق ذلك مع ارتفاع معدلات المراضة والوفيات ومتوسط ​​البقاء على قيد الحياة لديه 13 شهرا ^6. هناك حاجة إلى نماذج حيوانية مناسبة لتقليد هذا المرض المدمر سريريا من أجل تسهيل فهمنا لل?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات (اختياري)
D - luciferin	الذهب التكنولوجيا الحيوية	L - 123	120 ملغ / كغ في برنامج تلفزيوني في وحدة تخزين ما مجموعه 80 ميكرولتر للدراسة في الجسم الحي
Isoflurane	باكستر انترناشيونال	1001936060
Matrigel	العلوم البيولوجية دينار بحريني	354234
هاميلتون حقنة	شركة هاملتون	1701
هاميلتون 32G إبرة	شركة هاملتون	7803-04
نقص الأكسجة الغرفة	بيلوبس - روتنبرغ ، وشركة	MIC - 101
تلألؤ بيولوجي نظام التصوير	الفرجار العلوم الحياتية	IVIS نظام الطيف
G418	فيشر العلمية	SV3006901