В естественных условиях Биолюминесценция изображения опухоли Гипоксия Динамика груди метастазы рака мозга у мышей

Резюме

Биолюминесценция визуализации гипоксии индуцируемый фактор-1α деятельности применяется для контроля внутричерепного развития опухоли гипоксии мозга рака молочной железы мыши модель метастазов.

Аннотация

Хорошо известно, что опухолевые гипоксия играет важную роль в развитии злокачественных прогрессии и влияющие терапевтический ответ отрицательно. Существует мало знают о на месте, в естественных условиях, опухоли гипоксии при внутричерепной развития злокачественных опухолей головного мозга из-за отсутствия эффективных средств для контроля его в этих глубинных ортотопической опухоли. Биолюминесценция томография (BLI), основанный на обнаружении света, излучаемого жизни клеток, экспрессирующих ген люциферазы, был быстро принят для исследования рака, в частности, для оценки роста опухоли или опухоли изменения размера в ответ на лечение в доклинических исследованиях на животных. Более того, выражая ген репортер под контролем промотора, конкретное выражение гена можно контролировать неинвазивным путем BLI. Под гипоксического стресса, сигнализации ответы опосредованы основном через гипоксии индуцируемый фактор-1α (HIF-1α) для управления транскрипции различных генов. Поэтому мы использовали HIF-1α репортер построить, 5HRE-ODD-Люк, стабильно трансфицированных в человеческий рака молочной железы MDA-MB231 клеток (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). Экстракорпоральное HIF-1α биолюминесценции анализа осуществляется инкубации трансфекции клеток в гипоксической камере (0,1% O ₂₎ в течение 24 часов, прежде чем BLI, в то время как клетки в нормоксии (21% O ₂₎ служить в качестве контроля. Значительно более высокая потока фотонов наблюдается клетки в условиях гипоксии предлагает увеличить HIF-1α привязки к его промотор (HRE элементов), по сравнению с теми в нормоксии. Клетки вводят непосредственно в мозг мыши, чтобы установить мозга метастазами рака молочной железы модели. В естественных изображений биолюминесценции опухолевых динамики гипоксии инициируется 2 недель после имплантации и повторяется один раз в неделю. BLI показывает увеличение световые сигналы из мозга, как опухоль прогрессирует, что указывает на повышение внутричерепного гипоксии опухоли. Гистологическое и иммуногистохимическое исследования используются для подтверждения результатов в естественных изображений. Здесь мы познакомим подходы в пробирке HIF-1α биолюминесценции анализа, хирургическое создание мозга рак молочной железы метастазы в обнаженном мыши и применение в естественных изображений биолюминесценции для контроля внутричерепного гипоксии опухоли.

протокол

Все животные процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Университета Техаса Юго-западного медицинского центра.

1. В пробирке HIF-1α биолюминесценции анализа

1. Материалы и методы:
   • Человек метастатическим раком молочной железы клеточной линии MDA-MB231, трансфицированных роман HIF-1-зависимого гена-репортера, 5HRE-ODD-Люк был сгенерирован Доктор Харада.
   • В гипоксического состояния, повышенной экспрессии кислородно-зависимой деградации домена (ODD)-люциферазы слитого белка обусловлена ​​5 экземпляров гипоксии-ответ элемент (5HRE). Наличие оптического причины деградации ODD-Люк белка приводит к крайне низкой активности люциферазы фон в гипоксическим условиям. Таким образом, эта новая система может быть использован для обнаружения гипоксических регионов в опухоли реальными изображениями времени. Строительство этого 5HRE-ODD-Люк вектора экспрессии, как сообщается на ^1,2 Харада и соавт.
2. Культуры клеток под нормоксии или гипоксии:
   • Поддерживать рекомбинантный MDA-MB231 клеток в 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS)-DMEM среде, содержащей 1% глютамина, антибиотиков 400 мкг / мл G418 и 1% пенициллина / стрептомицина.
   • Для в пробирке HIF-1α биолюминесценции анализа, плиты 3 х 10 ⁵ MDA-MB231 клеток, экспрессирующих 5HRE-ODD-Люк вектора в каждой лунке двух шесть хорошо блюдо.
   • Разрешить клеткам придают блюду стены после инкубации в течение ночи, а затем передать одно блюдо в камере гипоксии (Биллапс-Ротенберг, Inc Дель Мар, Калифорния) для гипоксии исследования, в то время держать другое блюдо под гипоксическим условия (21% O _2).
   • Соберите камеры и газовые камеры с 0,1% O _2, соединяя впускной трубы порт с газовой камерой.
     Примечание: Оба входе и выходе зажимы порт должен быть открыт во время этой процедуры.
   • Отключите источник газа после камеры были очищены и уплотнительной камеры, закрыв пластиковых зажимов.
   • Место камеры в 37 ° C инкубаторе с 5% CO _2.
     Примечание: камера должна быть увлажненной, чтобы предотвратить чрезмерное испарение культур. Это может быть достигнуто путем размещения 10 - 20 мл стерильной воды в камере.
3. Биолюминесценция анализа:
   • После 24 ч инкубации удалить средних и мыть клетки быстро с ледяной PBS (2х).
   • Добавьте 1 мл холодного PBS 100 мкл люциферин (Gold биотехнологии, Сент-Луис, Миссури).
   • Приобретать BL томография (ИВИС спектра системы, суппорт Life Sciences, Хопкинтон, MA) с различными время экспозиции (1, 30, 60, 180 сек).
   • Мера интенсивности света в каждую лунку с помощью программного обеспечения Жизнь изображения (суппорт Life Sciences).

2. Создание мозга груди модель метастазов рака

1. Подготовка MDA-MB231/5HRE-ODD-luc клетки
   • Получить и культуры MDA-MB231/5HRE-ODD-luc клеток в ДЕМЕ среде, содержащей 10% FBS, 1 глютамин% и 1% пенициллина / стрептомицина.
   • Замените среду каждые 2-3 дня. Tripsinize и промыть клетки, когда они достигают 80% слияния.
   • Граф соответствующее число клеток и их ресуспендируют в бессывороточной среде ДЕМЕ с 25% Матригель (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния) с конечной концентрации 10 ^{5 клеток} в 4 мкл.
   • Место клетки на льду до внутричерепных инъекций.
2. Хирургическая имплантация
   • Женский безволосых мышей (BALB / с ню / ню, Национальный институт рака, Bethesda, MD) на 4-6 недель используются в данном исследовании.
   • Обезболить (3% изофлуран / O2 в индукционной камере; изофлуран от Baxter International Inc, Дирфилд, штат Иллинойс, США) и сохранить животных с изофлуран (1%) в кислороде (1 дм ³ / мин) во время хирургического вмешательства ^3.
   • Право кожи теменной должны быть нацелен с бетадин, а затем 70% спиртом до разреза.
   • Использование высокоскоростных дрель, заусенцев 1 мм отверстие в правом полушарии черепа, 1 мм кпереди от венечного шва и 2 мм латеральнее сагиттального шва.
   • Draw 4 мкл смеси ячейки (10 ^{5 клеток),} используя 10 мкл Hamilton шприца (Hamilton компании, Рино, штат Невада). Inject клеток непосредственно в правый хвостовой промежуточного мозга, 1,5 мм под твердую мозговую оболочку использованием заказных 32G Гамильтон иглы. Держите иглу на месте в течение примерно 30 секунд до выхода. Использование тонкой иглой 32G сводит к минимуму повреждение тканей.
   • Заполните отверстие заусенцев с костью воска и закрыть головы с рассасывающиеся нити.
   • Подготовка разрез региона с 70% спиртом.
   • Применение бупренорфина обезболивания каждые 12 часов в течение двух дней.

3. В естественных изображений биолюминесценции опухолевой гипоксии динамика в груди метастазы рака мозга

• Инициировать продольных изображений биолюминесценции (ИВИС спектра системы) через две недели после имплантации внутричерепных и повторять раз в неделю в течение 8-10 Недель.
• Обезболить три мыши на время (3% изофлуран / O ₂ в индукции камеры)
• Администрирование решение D-люциферин (120 мг / кг в PBS в общем объеме 80 мкл; Золотая биотехнологии) подкожно в область шеи каждой мыши, как подробно описано ранее ^4.

D-люциферин не токсичен и было показано, что способны проникать нетронутыми гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) и клеточных мембран ^3,5.

• Место 3 мышей в камеру изображения и поддерживать с изофлуран (1%) в кислороде (1 дм ³ / мин) во время съемки.
• Через пять минут после инъекции люциферин, приобретать BL изображений с множеством различных времени экспозиции (1, 30, 60, 180 сек).

Наши наблюдения показывают, что пик светлое время выбросов составляет около 5 минут после подкожного введения люциферин в области шеи ^3,4.

• Анализ данных с помощью программного обеспечения Жизнь Imaging (суппорт науки о жизни) с помощью абсолютного фотоотсчетов (фотонов / с) в области интереса (ROI), вручную обращено наброски BLI сигнала головного мозга.
• Участок время курс кривой фотоотсчетов, чтобы указать, опухоли динамики гипоксии.
• Сразу же после последнего BLI, администрирования pimonidazole, гипоксия маркер и 1 час позже, жертву мышей и препарировать мозг. Добавить целом мозги в оптимальной температуры резки (октябрь) средние и заморозить в -80 ° C морозильнике. Последующее гистологическое окрашивание крезиловый фиолетовый и иммуногистохимического окрашивания против люциферазы, гипоксия маркер pimonidazole и HIF-1α производится для проверки изображений наблюдений.

4. Представитель результаты:

Как показано на рисунке 1, что значительно выше BLI сигнала наблюдалось после трансфекции клетки инкубировали в гипоксической камере (1% O ₂₎ в течение 24 часов. Слабое свечение наблюдалось из-под контроля клеток под нормоксии. Это может быть результатом переполненных популяции клеток через 24 ч культуры 3 х 10 ⁵ клеток, которые индуцированной стрессом сигнал к клеткам гиперэкспрессией HIF-1α. Тем не менее, в естественных результатах BLI были подтверждены иммуногистохимического окрашивания показывает колокализации между опухолевой гипоксии и люциферазы выражения.

Автоматизированные массив экспозиции обеспечивает непрерывную приобретения серии изображений, что облегчает захват слабого сигнала путем увеличения выдержки, а сильные сигналы, используя более короткие сроки без насыщения ПЗС.

Рисунок 1 В пробирке HIF-1α биолюминесценции анализа Верхний ряд:. 3 х 10 ⁵ MDA-MB231/5HRE-ODD-luc клетки инкубировали в каждую лунку 6-хорошо блюдо в камере гипоксии (0,1% O ₂₎ в течение 24 часа до среду удаляли, промывали и заменяли 1 мл PBS. Сразу же после 100 мкл люциферин был добавлен в каждую лунку, BLI был приобретен с массивом выдержек (1, 30, 60, 180 сек). Сильные люминесценции наблюдался с представителем скважин Нижний ряд:. В качестве контроля, 3 х 10 ^{5 клеток} инкубировали при нормоксии (21% O _2), испускаемых слабый свет.

Рисунок 2 В естественных изображений биолюминесценции опухолевых динамики гипоксии.) Слабый сигнал свет от правой стороны мозга мыши была впервые визуализируется через 5 недель после имплантации внутричерепных MDA-MB231/5HRE-ODD-luc клеток рака молочной железы. Увеличение оптического сигнала наблюдалось в течение еще ​​6 недель, что указывает на увеличение опухоли гипоксии. B) показали сюжет кривой времени хода количественных фотоотсчетов светового сигнала.

Рисунок 3 Colocaliztion люциферазы и гипоксии обнаружено immunohisto-химического окрашивания. Замороженного мозга мыши подшипников метастазов рака молочной железы MDA-MB231/5HRE-ODD-luc встроенные в октябре была разделена. 10 мкм разделе immunostained с гипоксически маркер, pimonidazole, показал неоднородность внутриопухолевые гипоксии, которая коррелирует с пространственно люциферазы выражение обнаружены анти-люциферазы окрашивания. Шкала бар, 100 мкм.

Обсуждение

Рак молочной железы метастазы в головной мозг возникает у 30% больных раком молочной железы на стадии IV. Это связано с высокой заболеваемостью и смертностью и медиана выживаемости 13 месяцев ^6. Существует необходимость иметь соответствующие модели на животных, чтобы имитировать эт...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
D-люциферин	Золото биотехнологии	L-123	120 мг / кг в ФБР в общем объеме 80 мкл для исследования в естественных условиях
Изофлюрана	Бакстер Интернэшнл Инк	1001936060
Матригель	BD Biosciences	354234
Гамильтон шприц	Компания Hamilton	1701
Гамильтон 32G иглу	Компания Hamilton	7803-04
Гипоксия камеры	Биллапс-Ротенберг, Inc	MIC-101
Система визуализации Биолюминесценция	Суппорт наук о жизни	ИВИС спектра системы
G418	Fisher Scientific	SV3006901