유방암 뇌 전이의 종양 Hypoxia 역학 생체내의 Bioluminescence 이미징에서는 마우스 모델에서

요약

hypoxia inducible 인자 - 1α 활동 Bioluminescence 이미징은 유방암 뇌 전이의 마우스 모델에서 종양 intracranial hypoxia 개발을 모니터에 적용됩니다.

초록

이곳은 종양 hypoxia은 악성 진행을 촉진하고 부정적인 치료 반응에 영향을 미치는에 중요한 역할을 것을 인식됩니다. 때문에 이러한 뿌리 깊은 orthotopic 종양에서 모니터링하는 효율적인 수단의 부족 악성 뇌 종양의 intracranial 개발하는 동안 생체내, 종양 hypoxia의 현장에 대한 약간의 지식이있다. 루시페라제 유전자를 표현하는 살아있는 세포에 의해 방출되는 빛의 감지에 따라 Bioluminescence 이미징 (BLI)는, 빠르게 잠복기 동물 연구에서 치료에 대한 응답으로 종양의 성장이나 종양 크기 변화를 평가하기 위해, 특히 암 연구에 채택되었습니다. 또한, 발기인 순서의 제어하에 기자의 유전자를 표현하여, 특정 유전자 발현이 BLI에 의해 비 invasively 모니터링할 수 있습니다. hypoxic 스트레스에서 신호 응답은 여러 유전자의 전사를 드라이브에 주로 hypoxia inducible 인자 - 1α (HIF - 1α)를 통해 중재 수 있습니다. 따라서, 우리는 안정적으로 인간 유방암 세포 MDA - MB231 (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). 체외 HIF - 1α bioluminescence 분석에 의해 수행에 transfected HIF - 1α 기자 구조, 5HRE - ODD 룩을 사용한 normoxia에있는 세포 (21 % O ₂₎ 제어 역할을하면서, BLI 전에 24 시간을위한 hypoxic 챔버 (0.1 % O _2)에 transfected 세포를 잠복기. hypoxia에서 세포에 대한 관찰 상당히 높은 광자 플럭스은 normoxia 이들에 비해 자사의 발기인으로 증가 HIF - 1α 바인딩 (HRE 요소)을 제안합니다. 셀은 유방암 뇌 전이 모델을 수립하기 위해 마우스 두뇌에 직접 주입됩니다. 종양 hypoxia 역학의 생체내 bioluminescence 이미징에서 주입 후 2 wks을 시작하고 일주일에 한 번 반복됩니다. BLI는 증가 intracranial 종양의 hypoxia을 나타내는, 종양 진행으로 두뇌에서 빛을 신호를 증가 보여줍니다. Histological과 immunohistochemical 연구는 생체내 이미징 결과를 확인하는 데 사용됩니다. 여기, 우리는 체외 HIF - 1α bioluminescence 분석, intracranial 종양의 hypoxia를 모니터링하는 생체내 bioluminescence 이미징에의 누드 마우스와 응용 프로그램에서 유방암 뇌 전이의 수술 설립의 방법을 소개합니다.

프로토콜

모든 동물의 절차는 텍사스 대학의 남서부 의료 센터의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. 체외 HIF - 1α bioluminescence 분석에서

1. 재료 및 방법 :
   • 인간 전이성 유방암 세포주 MDA - MB231은 소설 HIF - 1 - 의존 리포터 유전자로 transfected, 5HRE - ODD 룩은 박사 하라다에 의해 생성되었다.
   • hypoxic 조건에서 산소에 의존 열화 도메인 (ODD) 루시페라제 융합 단백질의 향상된 표현은 hypoxia - 응답 요소 5 부 (5HRE)에 의해 구동됩니다. ODD의 존재는 normoxic 조건에서 매우 낮은 배경 루시페라제 활동 결과 ODD 룩 단백질의 저하가 발생합니다. 따라서이 소설의 시스템은 실시간 영상으로 종양의 hypoxic 영역을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 이 5HRE - ODD 룩 표현 벡터의 공사 하라다 외 ^1,2에 의해보고되었습니다.
2. normoxia 또는 hypoxia에 따라 문화 세포 :
   • 10% 태아 소 혈청 (FBS) DMEM의 1 % 글루타민, 400 μg / G418의 ML의 항생제, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함하는 배지에서 재조합 MDA - MB231 세포를 유지합니다.
   • 체외 HIF - 1α bioluminescence 분석, 플레이트 3에 대한 X 10 2 백 6 자 요리의 각 우물에 5HRE - ODD 룩 벡터를 표현 ⁵ MDA - MB231 세포.
   • normoxic 조건 (21 % O _2)에 따라 다른 접시를 유지하면서 세포가 하룻밤 배양 후 접시 벽을 첨부하고 hypoxia 연구 hypoxia 챔버 (Billups - 로텐버그 주식 델마, CA) 하나의 요리를 전송할 수 있습니다.
   • 가스 실린더와 입구 포트 튜빙을 연결하여 0.1 % O ₂ 챔버 및 가스 챔버를 재조 립.
     참고 : 입구와 출구 포트 클램프 모두가이 절차를 수행하는 동안 열려 있어야합니다.
   • 챔버가 플라스틱 클램프를 닫아 정화 및 인감 챔버 후 가스 소스를 분리하십시오.
   • 5% CO _2와 37 ° C 배양기에서 챔버를 놓습니다.
     참고 : 챔버는 문화의 과도한 증발을 방지하기 위해 humidified해야합니다. 챔버 20 ML 멸균 물 - 이것은 10 배치하여 수행할 수 있습니다.
3. Bioluminescence 분석 :
   • 24 시간 보육 후, 미디어를 제거하고 얼음 차가운 PBS (2X)로 빠르게 세포를 씻으십시오.
   • Luciferin 100 μl (골드 생명 공학, 세인트 루이스, MO)와 차가운 PBS 1 ML을 추가합니다.
   • 다양한 노출 시간 (1, 30, 60, 180 s)와 BL 영상 (IVIS 스펙트럼 시스템, 캘리퍼스 생명 과학, Hopkinton, MA) 취득.
   • 각각이 잘 살아있는 이미지 소프트웨어 (캘리퍼스 생명 과학)를 사용하여 빛의 강도를 측정합니다.

2. 유방암 뇌 전이 모델의 구축

1. MDA-MB231/5HRE-ODD-luc 세포의 준비
   • 10% FBS, 1 %의 글루타민, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 포함 DEME 매체 MDA-MB231/5HRE-ODD-luc 세포를 검색과 문화.
   • 2~3일 모든 매체를 교체합니다. Tripsinize들이 80 % 합류에 도달하면 세포를 씻으십시오.
   • 세포의 적절한 숫자를 카운트 4 μl 볼륨 10 ⁵ 세포의 최종 농도 25 %의 Matrigel (BD Biosciences, 산호세, CA)와 혈청 무료 DEME 매체에서 그들을 resuspend.
   • intracranial 주사하기 전에 얼음 장소 세포.
2. 외과 이식
   • 여성 누드 마우스 (BALB / C 뉴 / 뉴, 국립 암 연구소, 베데스다, MD) 이전 4~6주에서이 연구에 사용됩니다.
   • 마취 (유도 챔버에서 O2 / isoflurane 3%; 박스터 인터내셔널, 디어 필드, IL, 미국에서 isoflurane)와 산소 (1 DM ³ / 분) (1 %) isoflurane 수술 ³ 중에있는 동물을 유지합니다.
   • 오른쪽 정수리 피부 betadine 후 이전 절개 70 %의 알코올로 준비되어야합니다.
   • 고속 드릴을 사용 버는 코로나 봉합과 saggital 치료 측면 2mm로 두개골, 1mm 앞쪽에의 오른쪽 반구의 1mm 구멍.
   • 4 μl 세포 혼합물 (10 ⁵ 셀) 10 μl 해밀턴 주사기를 (해밀턴 회사, 리노, NV) 사용하여 그립니다. 바로 바로 꼬리 diencephalon, 맞춤 제작 32G 해밀턴 바늘을 사용하여 경질의 mater 아래 1.5 mm로 세포를 주사. 탈퇴하기 전에 약 30 s에 대한 장소에서 바늘 보관하​​십시오. 32G 좋은 바늘의 사용은 조직 손상을 최소화합니다.
   • 뼈 왁스로 버는 구멍을 입력하고 흡수성 봉합과 두피를 닫습니다.
   • 70 % 알코올로 절개 지역을 준비합니다.
   • buprenorphine 진통제에게 이틀 동안 매 12 시간을 적용합니다.

3. 유방암 뇌 전이에 종양 hypoxia 역학 생체내 bioluminescence 이미징에서

• 세로 bioluminescence 이미징을 개시 (IVIS 스펙트럼 시스템) 이주 8 주일에 한번 intracranial 주입 반복 후-10 주.
• 한 번에 세 생쥐 (3 % 유도 챔버에서 O ₂ / isoflurane)를 마취
• 이전 ⁴ 자세히 설명한대로 각 마우스의 목 지역에서 subcutaneously, D - luciferin (골드 바이오 120, 최저 80 μl의 총 볼륨의 PBS에서 MG / kg)의 솔루션을 관리할 수 있습니다.

D - luciferin는 무독성이며 그대로 혈액 뇌 장벽 (BBB)와 세포 ^세포막을 관통 ^3,5 수있는 것으로 표시되었습니다.

• 이미지 챔버에서 3 쥐를 장소와 산소 (1 DM ³ / 분) (1 %) isoflurane 이미징 동안 같이 유지.
• luciferin 주입 후 5 분 동안은 다양한 노출 시간의 배열 (1, 30, 60, 180 s)와 BL 영상을 획득.

우리의 관측 피크 발광 시간이 목에 지역 ^3,4에서 luciferin의 피하 관리 후 5 분 관한 것을 보여줍니다.

• 관심 영역에 절대 광자 카운트 (광자 / 초)를 사용하여 생활 이미징 소프트웨어 (캘리퍼스 생명 과학)와 데이터를 분석 (ROI), 수동으로 뇌의 BLI 신호를 대략적으로 그려.
• 광자 카운트의 플롯 시간 코스 곡선 종양 hypoxia 역학을 나타낼 수 있습니다.
• 바로 지난 BLI 후, pimonidazole, hypoxia 마커 나중에 1 시간을 관리 쥐를 희생하고 두뇌를 해부하다. 최적의 절단 온도 (-10 월) -80에서 중간 및 동결 ° C의 냉장고에있는 모든 두뇌를 삽입할 수 있습니다. 이후 histological Cresyl 보라색 얼룩과 루시페라제, hypoxia 마커 pimonidazole에 대한 immunohistochemical 얼룩과 HIF - 1α는 영상 관찰을 검증하기 위해 수행.

4. 대표 결과 :

마찬가지로 Fig.1에 나타난, 상당히 높은 BLI 신호는 24 시간을위한 hypoxic 챔버 (1 % O ₂₎ incubated transfected 세포 후에 관찰되었다. 약한 빛의 방출은 normoxia 아래의 제어 세포에서 관찰되었다. 이것은 HIF - 1α를 overexpress 수있는 세포 스트레스 신호를 유도 3 × 10 ⁵ 세포의 24 시간 문화 후 콩나물 세포 인구에서 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 생체내 BLI 결과 종양 hypoxia와 루시페라제 표현 사이 colocalization을 보여주 immunohistochemical 얼룩에 의해 확인되었다.

노출 시간의 자동 배열은 긴 노출 시간과 약한 신호의 포착을 용이하게 이미지의 시리즈, 그리고 포화 CCD없이 짧은 시간을 사용하여 강한 신호를 지속적으로 인수 가능합니다.

체외 HIF - 1α bioluminescence 분석에서는 그림 1 끝줄 :. 24 hypoxia 챔버에서 6 - 잘 요리 (0.1 % O _2)의 각 우물에 incubated 3 × 10 ⁵ MDA-MB231/5HRE-ODD-luc 세포 HR은 매체 전에 제거 씻어 1 ML PBS로 대체되었습니다. 100 μl luciferin 각 우물에 추가되었습니다 직후, BLI는 노출 시간의 배열 (1, 30, 60, 180의)로 인수되었다. 강력한 발광은 대표적인 우물에서 관찰되었다 아래 행은 :. 컨트롤로서, 3 × 10 ⁵ 세포는 약한 빛을 방출 normoxia (21 % O _2)에 따라 incubated.

종양 hypoxia 역학의 생체내 bioluminescence 이미징 그림 2. 마우스 두뇌의 오른쪽부터) 약한 빛 신호는 먼저 시각 오주 MDA-MB231/5HRE-ODD-luc 유방암 세포 주입 후 intracranial되었다. 증가 광학 신호가 증가 종양의 hypoxia을 나타내는 추가 6주 동안 관찰했다. B) 줄거리는 빛의 신호의 양적 광자 카운트의 시간 코스 곡선을 보여주었다.

루시페라제 및 immunohisto - 화학 염색법에 의해 감지 hypoxia의 그림 3 Colocaliztion가. OCT에 포함된 유방암 MDA-MB231/5HRE-ODD-luc의 전이를 베어링 냉동 마우스 뇌가 sectioned되었습니다. 10 μm의 섹션, hypoxic 마커, pimonidazole와 immunostained 방지 루시페라제 염색법에 의해 감지 루시페라제 표현과 spatially 연관시키는 것은 발견 hypoxia의 intratumoral 이질을 공개했다. 스케일 바, 100 μm의.

토론

유방암 뇌 전이는 단계 IV에서 유방암 환자의 30 %에서 발생합니다. 이것은 높은 병적 상태와 사망률과 관련하여 13개월 ⁶ 중앙값 생존을 가지고있다. 그 intracranial 개시 및 진행뿐만 아니라 pathophysiological 프로필에 대한 우리의 이해를 촉진하기 위해이 임상적으로 치명적인 질병을 모방하기 위해 적절한 동물 모델을 필요가있다. 여기, 우리는 직접 마우스 두뇌로 인간 유방암 세포를 주사하?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
D - luciferin	골드 생명 공학	L - 123	120 생체내 연구에 80 μl의 총 볼륨의 PBS에서 MG / kg
Isoflurane	벡스터 인터내셔널	1001936060
Matrigel	BD Biosciences	354234
해밀턴 주사기	해밀턴 회사	1701
32G 해밀턴 바늘	해밀턴 회사	7803-04
Hypoxia 챔버	Billups - 로텐버그 주식 회사	MIC - 101
Bioluminescence 이미징 시스템	캘리퍼스 생명 과학	IVIS 스펙트럼 시스템
G418	피셔 과학	SV3006901