בתחום ההדמיה vivo של פליטת אור Dynamics היפוקסיה גידול של גרורות סרטן השד המוח במודל של עכברים

Summary

הדמיה של פליטת אור ועין מתנהלת פעילות היפוקסיה, גורם 1α מוחל לפקח היפוקסיה תוך גולגולתי התפתחות גידולים של סרטן השד מודל גרורות במוח העכבר.

Abstract

היא מוכרת היטב כי היפוקסיה הגידול ממלא תפקיד חשוב בקידום התקדמות ממאיר ולהשפיע לרעה על תגובה טיפולית. יש ידע מועט על באתרו, ב היפוקסיה, הגידול vivo במהלך הפיתוח תוך גולגולתי של גידולים ממאירים במוח בגלל חוסר אמצעי יעיל לפקח על זה אלה עמוקים גידולים orthotopic. הדמיה פליטת אור (BLI), המבוססת על זיהוי של האור הנפלט ע"י תאים חיים להביע גן בלוציפראז, אומצה במהירות למחקר סרטן, בפרט, על מנת להעריך את צמיחת הגידול או שינוי גודל הגידול בתגובה הטיפול במחקרים בבעלי חיים פרה. יתר על כן, על ידי הבעת גן כתב תחת שליטתה של רצף היזם, בביטוי גנים מסוימים יכול להיות פיקוח הלא פולשני ידי BLI. תחת הלחץ hypoxic, תגובות איתות מתווכות בעיקר באמצעות ועין מתנהלת היפוקסיה, גורם 1α (HIF-1α) לנהוג שעתוק של גנים שונים. לכן, יש לנו השתמשו לבנות HIF-1α הכתב, 5HRE-ODD לוק, transfected ביציבות לתוך סרטן השד אנושי מד"א-MB231 תאים (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). Assay ב-HIF 1α פליטת אור חוץ גופית מבוצעת על ידי דוגרים התאים transfected בתא hypoxic (0.1% O ₂₎ עבור 24 שעות לפני BLI, בעוד התאים normoxia (21% O ₂₎ לשמש כביקורת. השטף הפוטון גבוה משמעותית נצפתה עבור התאים תחת היפוקסיה מציע מחייב גדל HIF-1α אל האמרגן שלה (אלמנטים HRE), בהשוואה לאלה normoxia. התאים מוזרקים ישירות לתוך המוח העכבר להקים סרטן השד גרורות במוח מודל. פליטת אור בתחום ההדמיה vivo של הדינמיקה היפוקסיה הגידול הוא יזם 2 wks לאחר ההשתלה וחזר פעם בשבוע. BLI מגלה הגדלת אותות אור מהמוח עם התקדמות הגידול, המעיד על גידול תוך גולגולתי מוגבר היפוקסיה. מחקרים היסטולוגית ו immunohistochemical משמשים כדי לאשר את בתוצאות vivo הדמיה. כאן, אנו מציגים גישות של assay ב-HIF 1α פליטת אור חוץ גופית, הקמת כירורגית של גרורות סרטן המוח השד עכבר יישום בעירום של פליטת אור בתחום ההדמיה vivo לפקח היפוקסיה גידול תוך גולגולתי.

Protocol

הנהלים כל חיה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש אוניברסיטת טקסס Southwestern Medical Center.

1. Assay HIF-1α פליטת אור חוץ גופית

1. חומרים ושיטות:
   • סרטן שד גרורתי האדם התא קו מד"א-MB231 transfected עם גן HIF-1-תלוי כתב רומן, 5HRE-ODD לוק נוצר על ידי ד"ר Harada.
   • במצב hypoxic, הביטוי מוגברת של חמצן תחום תלויי השפלה (ODD)-בלוציפראז חלבון היתוך הוא מונע על ידי 5 עותקים של אלמנט היפוקסיה תגובה (5HRE). הנוכחות של ODD גורם הפירוק של החלבון ODD לוק וכתוצאה מכך מאוד פעילות בלוציפראז נמוך רקע בתנאים normoxic. לכן, מערכת הרומן הזה יכול לשמש כדי לזהות אזורים hypoxic בגידול ידי הדמיה בזמן אמת. בניית וקטור 5HRE-ODD לוק בביטוי זה דווחה על ידי ^1,2 Harada et al.
2. התרבות תאים תחת normoxia או היפוקסיה:
   • שמירה על רקומביננטי מד"א-MB231 התאים בנסיוב 10% שור העובר (FBS)-DMEM בינוני המכיל 1% גלוטמין, אנטיביוטיקה של 400 מיקרוגרם / מ"ל ​​של G418 ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
   • עבור assay ב-HIF 1α פליטת אור מבחנה, צלחת 3 x 10 ⁵ מד"א-MB231 תאים להביע 5HRE-ODD לוק וקטור היטב כל מנה שש שתיים היטב.
   • אפשר תאים לצרף את קיר צלחת לאחר דגירה לילה ולאחר מכן להעביר צלחת אחת לחדר היפוקסיה (Billups-רוטנברג, Inc Del Mar, CA) ללימודי היפוקסיה, בעוד לשמור את המנה אחרים בתנאי normoxic (21% O _2).
   • מחדש את קאמרית הגזים עם 0.1% O ₂ על ידי חיבור צינור יציאת מפרצון עם בלון גז.
     הערה: גם כניסת ויציאת מלחציים מוצא חייב להיות פתוח במהלך הליך זה.
   • נתק את מקור הגז לאחר קאמרית כבר מטוהר קאמרית חותם על ידי סגירת מהדק פלסטיק.
   • מניחים את קאמרית 37 ° C חממה עם 5% CO _2.
     הערה: החדר חייב להיות humidified כדי למנוע אידוי יתר של תרבויות. ניתן להשיג זאת על ידי הצבת 10-20 מ"ל מים סטריליים בחדר.
3. פליטת אור assay:
   • לאחר דגירה 24 שעות, להסיר את בינוני לשטוף את התאים במהירות עם קרח קר PBS (2X).
   • הוסף 1 מ"ל של PBS קר עם 100 μl של Luciferin (ביוטכנולוגיה זהב, סנט לואיס, מיזורי).
   • רוכשת BL הדמיה (מערכת IVIS ספקטרום, Caliper מדעי החיים, Hopkinton, MA) עם זמני החשיפה השונים (1, 30, 60, 180 S).
   • מדידת עוצמת האור בכל אחד גם בעזרת תמונה Living תוכנה (Caliper מדעי החיים).

2. הקמת מודל סרטן השד גרורות במוח

1. הכנת התאים MDA-MB231/5HRE-ODD-luc
   • אחזר והתרבות התאים MDA-MB231/5HRE-ODD-luc במדיום מדם המכיל 10% FBS, גלוטמין 1% ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין.
   • החלף בינוני כל 2-3 ימים. Tripsinize לשטוף את התאים כאשר הם מגיעים למפגש 80%.
   • ספירת מספר מתאים של תאים resuspend אותם בינוני סרום מדם Matrigel חינם עם 25% (BD Biosciences, בסן חוזה, קליפורניה) עם ריכוז סופי של 10 ⁵ תאים בנפח 4 μl.
   • המקום התאים על הקרח לפני הזרקה תוך גולגולתי.
2. ניתוח ההשתלה
   • עכברים בעירום נקבה (BALB / c נו / נו, המכון הלאומי לסרטן, Bethesda, MD) בשעה 4-6 שבועות המשמשים במחקר זה.
   • הרדימי (3% isoflurane / O2 בתא אינדוקציה; isoflurane מ בקסטר אינטרנשיונל בע"מ, Deerfield, אילינוי, ארה"ב) ולשמור על חיות עם isoflurane (1%) חמצן (1 DM ³ / min) במהלך ההליך הכירורגי ^3.
   • העור הקודקודית הימנית צריכה להיות prepped בבטאדין ואז אלכוהול 70% לפני החתך.
   • בעזרת מקדח במהירות גבוהה, בר חור 1 מ"מ באונה הימנית של הגולגולת, 1mm הקדמי אל תפר העטרה ו 2 מ"מ לרוחב תפר saggital.
   • צייר 4 תערובת תא μl (10 ⁵ תאים) באמצעות מזרק 10 μl המילטון (Hamilton החברה, רינו, NV). להזריק את התאים ישירות ימין הזנב diencephalon, 1.5 מ"מ מתחת מאטר הדורה באמצעות מחט מחוייט 32G המילטון. שמור את המחט מקום של בערך 30 לפני הנסיגה. שימוש של מחט 32G בסדר ממזער נזק לרקמות.
   • ממלאים את החור בר בשעווה עצם לסגור את הקרקפת עם תפרים נספגים.
   • הכינו את אזור החתך עם אלכוהול 70%.
   • החל עצירות כאבים כל 12 שעות למשך יומיים.

3. הדמיה פליטת אור vivo של הדינמיקה היפוקסיה הגידול גרורות סרטן שד במוח

• ליזום הדמיה פליטת אור האורך (מערכת IVIS ספקטרום) שבועיים לאחר ההשתלה לחזור תוך גולגולתי וכן פעם בשבוע במשך 8-10 שבועות.
• הרדימי שלושה עכברים בכל פעם (3% isoflurane / O ₂ בתא אינדוקציה)
• ניהול פתרון של D-luciferin (120 מ"ג / ק"ג ב PBS בהיקף כולל של 80 μl; ביוטכנולוגיה זהב) תת עורית באזור הצוואר של העכבר כל כמתואר בהרחבה בעבר ^4.

D-luciferin הוא רעיל הוכח להיות מסוגל לחדור מחסום שלם הדם למוח (BBB) ​​ואת קרום התא ^3,5.

• מניחים את 3 עכברים בחדר הדמיה ומתוחזק עם isoflurane (1%) חמצן (1 DM ³ / min) במהלך ההדמיה.
• חמש דקות לאחר ההזרקה luciferin, לרכוש BL הדמיה עם מערך של זמן החשיפה השונים (1, 30, 60, 180 S).

התצפיות שלנו מראות כי זמן שיא פליטת האור הוא כ 5 דקות לאחר מתן luciferin תת עורית באזור הצוואר ^3,4.

• ניתוח נתונים עם תוכנת Living דימות (Caliper מדעי החיים) באמצעות ספירת פוטון מוחלט (פוטונים / s) באזור של עניין (ROI), נמשך באופן ידני המתאר את האות BLI של המוח.
• זמן מגרש כמובן עקומה של ספירת פוטון להצביע הדינמיקה היפוקסיה הגידול.
• מיד לאחר BLI האחרון, לנהל pimonidazole, סמן היפוקסיה ו 1 שעות מאוחר יותר, להקריב את העכברים לנתח את המוח. שבץ מוח שלם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) בינוני הקפאת -80 ° C במקפיא. הכתמה לאחר היסטולוגית סגול Cresyl והכתים immunohistochemical נגד בלוציפראז, סמן pimonidazole היפוקסיה, ו-HIF 1α שבוצעו כדי לאמת תצפיות הדמיה.

4. נציג התוצאות:

כפי שמוצג תמונה 1, גבוה באופן משמעותי האות BLI נצפתה לאחר התאים transfected מודגרות בחדר היפוקסי (1% O ₂₎ במשך 24 שעות. פליטת האור חלש נצפתה מתאי השליטה תחת normoxia. הדבר עלול לגרום מהאוכלוסייה תא צפוף אחרי 24 שעות של תרבות 3 x 10 ⁵ תאים, אשר גרמו אות כדי להדגיש את התאים overexpress HIF-1α. עם זאת, התוצאות היו vivo BLI תוקף על ידי immunohistochemical מכתים מראה colocalization בין היפוקסיה הגידול הביטוי בלוציפראז.

מערך אוטומטי של פעמים מאפשרת חשיפה רכישות מתמשך בסדרה של תמונות, המאפשרת לכידה של אות חלש עם זמן חשיפה ארוך יותר, אותות חזקים באמצעות זמן קצר מבלי להרוות-CCD.

איור 1 ב assay HIF-1α פליטת אור במבחנה שורה עליונה:. 3 x 10 ⁵ תאים MDA-MB231/5HRE-ODD-luc מודגרות היטב כל מנה 6-היטב בתא היפוקסיה (0.1% O ₂₎ עבור 24 שעות לפני בינוני הוסר, שטף והוחלפו 1 מ"ל PBS. מיד לאחר 100 luciferin μl נוספה לתוך הבאר כל BLI נרכשה עם מערך של פעמים חשיפה (1, 30, 60, 180 S). הארה חזקה נצפתה מבארות נציג שורה תחתונה:. כביקורת, 3 x 10 ⁵ תאים מודגרות תחת normoxia (21% O ₂₎ נפלט אור חלש.

איור 2 ב הדמיה פליטת אור vivo של הדינמיקה היפוקסיה הגידול.) אות אור חלש מהצד הימני של המוח העכבר היה הראשון דמיינו 5 שבועות לאחר ההשתלה תוך גולגולתי של תאים סרטניים MDA-MB231/5HRE-ODD-luc השד. אותות אופטיים מוגברת נצפתה על 6 שבועות נוספים, המצביעים על גידול היפוקסיה מוגברת. B) העלילה הראתה את מהלך הזמן של עקומת ספירת פוטון כמותית של אות אור.

איור 3 Colocaliztion של בלוציפראז ו היפוקסיה זוהה על ידי מכתים immunohisto כימי. במוח העכבר קפוא ועליו גרורות של סרטן השד MDA-MB231/5HRE-ODD-luc מוטבע אוקטובר נותח. סעיף 10 מיקרומטר immunostained עם סמן hypoxic, pimonidazole, חשף intratumoral ההטרוגניות של היפוקסיה, שנמצא כדי לתאם מרחבית עם הביטוי בלוציפראז זוהה על ידי אנטי מכתים בלוציפראז. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר.

Discussion

סרטן השד גרורות במוח מתרחשת 30% מחולות סרטן השד בשלב הרביעי. היא מזוהה עם תחלואה ותמותה גבוהים ויש לו ההישרדות החציונית של 13 חודשים ^6. יש צורך להיות במודלים של בעלי חיים מתאימים לחקות זו מחלה הרסנית קלינית כדי להקל על ההבנה שלנו של חניכה תוך גולגולתי שלה התקדמות, כ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
D-luciferin	זהב ביוטכנולוגיה	L-123	120 מ"ג / ק"ג ב PBS בהיקף כולל של 80 μl עבור במחקר vivo
Isoflurane	בקסטר אינטרנשיונל בע"מ	1001936060
Matrigel	BD Biosciences	354234
המילטון מזרק	המילטון החברה	1701
המילטון מחט 32G	המילטון החברה	7803-04
היפוקסיה קאמרית	Billups-רוטנברג, Inc	MIC-101
מערכת הדמיה פליטת אור	Caliper מדעי החיים	IVIS מערכת Spectrum
G418	פישר מדעי	SV3006901