In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

Zusammenfassung

Biolumineszenz-Bildgebung des Hypoxie-induzierbaren Faktors-1α Aktivität wird angewandt, um intrakranielle Tumorhypoxie Entwicklung in einer Brustkrebs Hirnmetastasen Mausmodell zu überwachen.

Zusammenfassung

Es ist allgemein anerkannt, dass Tumor-Hypoxie eine wichtige Rolle bei der Förderung der malignen Progression und beeinflussen therapeutische Reaktion negativ spielt. Es gibt wenig Wissen über in situ, in vivo, Tumor-Hypoxie während intrakranieller Entwicklung von bösartigen Hirntumoren wegen des Mangels an effizienten Mitteln, um es in diesen tief sitzenden Tumoren orthotopen überwachen. Biolumineszenz-Bildgebung (BLI), auf der Detektion von Licht durch lebende Zellen, die ein Luciferase-Gen emittiert basiert, wurde schnell für die Krebsforschung hat, insbesondere, um das Tumorwachstum oder Tumorgröße Veränderungen in Reaktion auf die Behandlung in präklinischen Tierstudien zu bewerten. Darüber hinaus durch die Expression eines Reportergens unter der Kontrolle einer Promotorsequenz kann die Genexpression nicht-invasiv durch BLI überwacht werden. Unter hypoxischen Stress, signalisieren Reaktionen hauptsächlich über die Hypoxie-induzierbaren Faktors-1α (HIF-1α) vermittelt, um die Transkription verschiedener Gene zu fahren. Deshalb haben wir eine HIF-1α Reporter-Konstrukt, 5HRE-ODD-luc, stabil in menschlichen Brustkrebszellen MDA-MB231-Zellen (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In-vitro-HIF-1α Biolumineszenzassay ist durchgeführt transfizierten verwendet Inkubation der transfizierten Zellen in einer hypoxischen Kammer (0,1% O ₂₎ für 24 Stunden vor dem BLI, während die Zellen in Normoxie (21% O ₂₎ als Kontrolle dienen. Deutlich höhere Photonenfluss für die Zellen unter Hypoxie beobachtet schlägt eine erhöhte HIF-1α Bindung an seinen Promotor (HRE Elemente), wie diese in Normoxie verglichen. Die Zellen werden direkt in das Gehirn der Maus injiziert, um eine Brustkrebs Hirnmetastasen Modell zu etablieren. In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamik ausgelöst wird 2 Wochen nach der Implantation und wiederholte einmal pro Woche. BLI zeigt zunehmende Licht Signale aus dem Gehirn, da der Tumor fortschreitet, was darauf hinweist erhöhten intrakraniellen Tumor Hypoxie. Histologische und immunhistochemische Untersuchungen werden verwendet, um die in-vivo-Bildgebung Ergebnisse zu bestätigen. Hier werden wir Ansätze von In-vitro-HIF-1α Biolumineszenzassay, chirurgische Einrichtung einer Brustkrebs Hirnmetastasen in einer Nacktmaus und Anwendung von In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung zur intrakraniellen Tumorhypoxie Monitor vorstellen.

Protokoll

Alle tierischen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss der University of Texas Southwestern Medical Center genehmigt.

1. In-vitro-HIF-1α Biolumineszenzassay

1. Materialien und Methoden:
   • Menschliche metastasierendem Brustkrebs-Zelllinie MDA-MB231 mit einem neuartigen HIF-1-abhängigen Reportergen transfiziert wurde 5HRE-ODD-luc durch Dr. Harada generiert.
   • In hypoxischen Zustand ist die verstärkte Expression von Sauerstoff-abhängigen Abbau Domain (ODD)-Luciferase-Fusionsprotein von 5 Exemplare von Hypoxie-Response-Element (5HRE) angetrieben. Die Anwesenheit von ODD bewirkt, dass der Abbau von ODD-Luc resultierende Protein in extrem niedrigen Hintergrund Luciferaseaktivität in normoxischen Bedingungen. Daher kann dieses neue System verwendet, um hypoxische Regionen eines Tumors durch Echtzeit-Bildgebung zu erkennen. Der Bau dieser 5HRE-ODD-luc Expressionsvektor wurde von Harada et al ^1,2 berichtet worden.
2. Kultur-Zellen unter Normoxie oder Hypoxie:
   • Pflegen Sie die rekombinante MDA-MB231-Zellen in 10% fötalem Rinderserum (FBS)-DMEM-Medium mit 1% Glutamin, Antibiotika von 400 pg / ml G418 und 1% Penicillin / Streptomycin.
   • Für die in vitro HIF-1α Biolumineszenzassay, Platte 3 x 10 ⁵ MDA-MB231-Zellen, die 5HRE-ODD-luc-Vektor in jede Vertiefung von zwei sechs gut Schüssel.
   • Lassen Sie Zellen in die Schale Wand nach Inkubation über Nacht befestigen und dann übertragen ein Gericht in eine Hypoxie Kammer (Billups-Rothenberg, Inc. Del Mar, CA) für Hypoxie-Studien, während die übrigen Gericht unter normoxischen Bedingungen (21% O _2).
   • Montieren Sie die Kammer und Gas der Kammer mit 0,1% O _2, indem Sie den Einlass-Schlauch mit einer Gasflasche.
     Hinweis: Sowohl Ein-und Auslass-Anschluss Klemmen muss während dieser Verhandlung zu eröffnen.
   • Trennen Gasquelle nach Kammer wurde gespült und Dichtungsraum durch Schließen Kunststoffklammern.
   • Setzen Sie die Kammer in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO _2.
     Hinweis: Die Kammer muss befeuchtet werden, um übermäßige Verdunstung der Kulturen zu verhindern. 20 ml steriles Wasser in die Kammer - Dies kann, indem 10 erreicht werden.
3. Biolumineszenz-Assay:
   • Nach 24 Stunden Inkubationszeit, entfernen Sie das Medium und die Zellen schnell mit eiskaltem PBS (2X).
   • 1 ml kaltem PBS mit 100 ul Luciferin (Gold Biotechnologie, St Louis, MO).
   • Erwerben BL-Tomographie (IVIS Spectrum System Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) mit verschiedenen Belichtungszeiten (1, 30, 60, 180 s).
   • Messen Sie die Lichtintensität in jedem gut mit dem Leben Image Software (Caliper Life Sciences).

2. Einrichtung einer Brustkrebs Hirnmetastasen Modell

1. Vorbereitung der MDA-MB231/5HRE-ODD-luc Zellen
   • Abrufen und Kultur der MDA-MB231/5HRE-ODD-luc Zellen in DEME-Medium mit 10% FBS, 1% Glutamin und 1% Penicillin / Streptomycin.
   • Ersetzen Medium alle 2-3 Tage. Tripsinize und waschen Sie die Zellen, wenn sie 80% Konfluenz erreichen.
   • Graf entsprechende Anzahl von Zellen und resuspendieren sie in serumfreien Medium DEME mit 25% Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) mit einer Endkonzentration von 10 ⁵ Zellen in 4 ul Volumen.
   • Legen Zellen auf Eis vor intrakranielle Injektion.
2. Chirurgische Implantation
   • Weiblicher Akt Mäusen (BALB / c nu / nu; National Cancer Institute, Bethesda, MD) bei 4-6 Wochen alt sind in dieser Studie verwendet.
   • Anesthetize (3% Isofluran / O2 in einer Induktion Kammer; Isofluran von Baxter International Inc., Deerfield, IL, USA) und pflegen die Tiere mit Isofluran (1%) in Sauerstoff (1 dm ³ / min) während des chirurgischen Verfahren ^3.
   • Die rechte parietal Haut sollte mit betadine und dann 70% igem Alkohol vor Einschnitt vorbereitet werden.
   • Mit einem High-Speed-Bohrer, Fräse ein 1 mm Loch in der rechten Hemisphäre des Schädels, 1mm anterior der Kranznaht und 2 mm lateral saggital Naht.
   • Draw 4 ul Zellgemisch (10 ⁵ Zellen) mit einem 10 ul Hamilton-Spritze (Hamilton Company, Reno, NV). Spritzen Sie die Zellen direkt in die rechte kaudale Zwischenhirn, 1,5 mm unter der Dura mater mit einem maßgeschneiderten 32G Hamilton Nadel. Halten Sie die Nadel in Platz für ca. 30 s vor dem Rückzug. Die Nutzung eines 32G feinen Nadel minimiert Gewebeschäden.
   • Füllen Sie das Bohrloch mit Knochenwachs und in der Nähe der Kopfhaut mit resorbierbaren Fäden.
   • Bereiten Sie den Schnitt Region mit 70% Alkohol.
   • Bewerben Buprenorphin Analgesie alle 12 Stunden für zwei Tage.

3. In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamik bei Brustkrebs Hirnmetastasen

• Initiieren Längs-Biolumineszenz-Bildgebung (IVIS Spectrum System) zwei Wochen nach intrakraniellen Implantation und wiederholen Sie einmal in der Woche für 8-10 Wochen.
• Anesthetize drei Mäusen zu einer Zeit (3% Isofluran / O ₂ in einer Induktion Kammer)
• Verwalten einer Lösung von D-Luciferin (120 mg / kg in PBS in einem Gesamtvolumen von 80 ul; Gold-Biotechnologie) subkutan im Halsbereich jeder Maus, wie im Detail beschrieben bisher ^4.

D-Luciferin ist ungiftig und hat sich gezeigt, dass zu durchdringen vermag intakte Blut-Hirn-Schranke (BHS) und Zellmembranen ^3,5.

• Legen Sie die 3 Mäuse in der Imaging-Kammer und gepflegt mit Isofluran (1%) in Sauerstoff (1 dm ³ / min) während der Bildgebung.
• Fünf Minuten nach Injektion Luciferin, erwerben BL Bildgebung mit einer Reihe von verschiedenen Belichtungszeiten (1, 30, 60, 180 s).

Unsere Beobachtungen zeigen, dass die Peak-Lichtemission ca. 5 Minuten nach subkutaner Verabreichung von Luciferin im Halsbereich ^3,4 ist.

• Analysieren von Daten mit dem lebendigen Imaging-Software (Caliper Life Sciences), indem Sie absolute Photonen (Photonen / s) in einer Region of Interest (ROI), manuell gezogen, um die BLI-Signal des Gehirns zu skizzieren.
• Plot Zeitverlauf Kurve der Photonen, um anzuzeigen, Tumorhypoxie Dynamik.
• Unmittelbar nach dem letzten BLI, verwalten pimonidazole, die Hypoxie-Marker und 1 Stunde später, opfern die Mäuse und sezieren die Gehirne. Embed das ganze Gehirn in Optimal Cutting Temperature (OCT) mittel-und frieren in -80 ° C Gefrierschrank. Nachfolgende histologische Kresylviolett-Färbung und die immunhistochemische Färbung gegen Luciferase, Hypoxie-Marker pimonidazole und HIF-1α durchgeführt, um Imaging-Beobachtungen bestätigen.

4. Repräsentative Ergebnisse:

Wie in Abb. 1 dargestellt, war signifikant höher BLI-Signal nach der transfizierten Zellen in der hypoxischen Kammer (1% O ₂₎ für 24 Stunden inkubiert beobachtet. Schwache Lichtemission aus dem Kontroll-Zellen unter Normoxie beobachtet. Dies kann aus der überfüllten Zelle Bevölkerung nach 24 Stunden Kultur der 3 x 10 ⁵ Zellen, die einen Stress-Signal zu den Zellen induziert HIF-1α überexprimieren führen. Dennoch wurden in vivo BLI Ergebnisse durch immunhistochemische Färbung zeigt Kolokalisation zwischen Tumor Hypoxie und Luciferaseexpression validiert.

Eine automatisierte Auswahl an Belichtungszeiten ermöglicht eine kontinuierliche Akquisitionen von einer Reihe von Bildern, die Erfassung von einem schwachen Signal erleichtert durch längere Belichtungszeit, und starke Signale mit einer kürzeren Zeit ohne Sättigung des CCD.

Abbildung 1 In-vitro-HIF-1α Biolumineszenzassay Obere Reihe:. 3 x 10 ⁵ MDA-MB231/5HRE-ODD-luc Zellen in jeder Vertiefung einer 6-well-Schale in einer Hypoxie Kammer (0,1% O ₂₎ für 24 inkubiert hr, bevor das Medium entfernt, gewaschen und ersetzt mit 1 ml PBS. Unmittelbar nach 100 ul Luciferin in jedes Well zugegeben wurde BLI mit einer Reihe von Belichtungszeiten (1, 30, 60, 180 s) erworben. Starke Lumineszenz wurde von repräsentativen Brunnen beobachtet Untere Reihe:. Als eine Kontrolle, 3 x 10 ⁵ Zellen unter Normoxie (21% O ₂₎ emittiert schwachem Licht inkubiert.

Abbildung 2 In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamik. A) Eine schwache Lichtsignal von der rechten Maus-Gehirn wurde erstmals visualisiert 5 Wochen nach der intrakraniellen Implantation MDA-MB231/5HRE-ODD-luc Brustkrebszellen. Erhöhte optisches Signal wurde über weitere 6 Wochen beobachtet, was auf erhöhte Tumor-Hypoxie. B) Die Handlung des zeitlichen Verlaufs Kurve quantitative Photonen des Lichts Signal zeigten.

Abbildung 3 Colocaliztion von Luciferase und Hypoxie durch immunhistochemische Färbung nachgewiesen. Eine gefrorene Gehirn der Maus trägt eine Metastase des Brustkrebses MDA-MB231/5HRE-ODD-luc in OCT eingebettet wurde geschnitten. A 10 pm Abschnitt immungefärbt mit hypoxischen Marker, pimonidazole zeigte intratumoralen Heterogenität der Hypoxie, die gefunden räumlich korrelieren mit Luciferase-Expression durch anti-Luciferase Färbung erkannt wurde. Scale-bar, 100 um.

Diskussion

Brustkrebs Hirnmetastasen tritt in 30% der Patientinnen mit Brustkrebs im Stadium IV. Es ist mit hoher Morbidität und Mortalität verbunden und hat eine mediane Überlebenszeit von 13 Monaten ^6. Es besteht ein Bedarf an geeigneten Tiermodellen für diese klinisch verheerenden Krankheit vortäuschen, um unser Verständnis der intrakraniellen Initiation und Progression sowie pathophysiologischen Profilen zu erleichtern. Hier haben wir einen orthotopen Brustkrebs Hirnmetastasen Modell durch die Injektion von me...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
D-Luciferin	Gold-Biotechnologie	L-123	120 mg / kg in PBS in einem Gesamtvolumen von 80 ul in-vivo-Studie
Isofluran	Baxter International Inc.	1001936060
Matrigel	BD Biosciences	354234
Hamilton-Spritze	Hamilton Company	1701
32G Hamilton Nadel	Hamilton Company	7803-04
Hypoxie Kammer	Billups-Rothenberg, Inc.	MIC-101
Biolumineszenz Imaging-System	Caliper Life Sciences	IVIS Spectrum-System
G418	Fisher Scientific	SV3006901