Na imagem de bioluminescência vivo Tumor de mama Dynamics Hipóxia metástase do cancro cerebral em um modelo de rato

Resumo

Imagem de bioluminescência de hipóxia induzida a atividade do fator-1α é aplicada para monitorar o desenvolvimento hipóxia intracraniana tumor em um câncer de mama modelo de cérebro de rato metástase.

Resumo

É bem reconhecido que a hipóxia tumor desempenha um papel importante na promoção da progressão maligna e afetando negativamente a resposta terapêutica. Há pouco conhecimento sobre in situ, em hipóxia, vivo tumor intracraniano durante o desenvolvimento de tumores cerebrais malignos por causa da falta de meios eficientes para monitorá-lo nestes tumores profundos ortotópico. Imagem de bioluminescência (BLI), baseado na detecção de luz emitida por células vivas expressando um gene da luciferase, foi rapidamente adotado para a investigação do cancro, em particular, para avaliar o crescimento do tumor ou mudanças tamanho do tumor em resposta ao tratamento em estudos com animais pré-clínicos. Além disso, ao expressar um gene repórter sob o controle de uma seqüência promotora, a expressão de genes específicos podem ser monitorados de forma não invasiva por BLI. Sob estresse hipóxico, as respostas de sinalização são mediadas principalmente através da indução de hipóxia factor-1α (HIF-1α) para dirigir a transcrição de vários genes. Portanto, temos utilizado uma construção repórter HIF-1α, 5HRE-ODD-luc, estavelmente transfectadas em câncer de mama humano MDA-MB231 células (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro ensaio HIF-1α bioluminescência é realizada por incubando as células transfectadas em uma câmara de hipóxia (0,1% O ₂₎ por 24 horas antes de BLI, enquanto as células em normóxia (21% O ₂₎ servir como controle. Significativamente maior fluxo de fótons observados para as células em hipóxia sugere uma ligação de HIF-1α aumentou para seu promotor (elementos HRE), em comparação com aqueles em normóxia. As células são injetadas diretamente no cérebro de camundongo para estabelecer um modelo de câncer de mama metástase cerebral. Na imagem de bioluminescência vivo da dinâmica hipóxia tumor é iniciado 2 semanas após o implante e repetido uma vez por semana. BLI revela aumento sinais de luz a partir do cérebro como o tumor progride, indicando aumento da hipóxia tumor intracraniano. Estudos histológicos e imunohistoquímicos são usados ​​para confirmar a no resultado de imagem in vivo. Aqui, vamos introduzir abordagens de ensaio in vitro HIF-1α bioluminescência, criação cirúrgica de uma metástase cerebral de câncer de mama em camundongos nude e aplicação de imagem de bioluminescência em vivo para monitorar hipóxia tumor intracraniano.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Uso de University of Texas Southwestern Medical Center.

1. In vitro ensaio HIF-1α bioluminescência

1. Materiais e Métodos:
   • Humana de mama metastático linhagem de células MDA-MB231 câncer transfectadas com um gene repórter romance HIF-1-dependente, 5HRE-ODD-luc foi gerado pelo Dr. Harada.
   • Em condições de hipóxia, a expressão aumentada de oxigênio-dependente de domínio degradação (ODD)-luciferase proteína de fusão é impulsionado por 5 cópias de hipóxia-resposta elemento (5HRE). A presença de ODD causas da degradação de ODD-Luc proteína, resultando em muito baixa atividade de fundo luciferase em condições normóxica. Portanto, este novo sistema pode ser usado para detectar regiões hipóxica em um tumor por imagem em tempo real. A construção deste vetor de expressão 5HRE-ODD-luc tem sido relatada por ^1,2 Harada et al.
2. Células de cultura em normóxia ou hipóxia:
   • Manter o MDA-MB231 recombinante células em 10% de soro fetal bovino (FBS), DMEM contendo 1% de glutamina, antibióticos de 400 mcg / ml de G418 e 1% de penicilina / estreptomicina.
   • Para o ensaio in vitro HIF-1α bioluminescência, placa de 3 x 10 ⁵ MDA-MB231 células que expressam 5HRE-ODD-luc vetor em cada poço de dois prato seis também.
   • Permitem que as células para anexar o prato de parede após incubação overnight e depois transferir um prato em uma câmara de hipóxia (Billups-Rothenberg, Inc. Del Mar, CA) para estudos de hipóxia, enquanto que manter o outro prato sob condição normóxica (21% O _2).
   • Remontar a câmara ea câmara de gás com 0,1% do O _2, ligando o tubo porta de entrada com um cilindro de gás.
     Nota: Ambos entrada e abraçadeiras porta de saída devem ser abertas durante este procedimento.
   • Desconecte a fonte de gás após a câmara foi purgado e câmara de vedação, fechando braçadeiras de plástico.
   • Coloque a câmara em uma incubadora de 37 ° C com 5% de CO _2.
     Nota: A câmara deve ser umidificado para evitar a evaporação excessiva de culturas. Isso pode ser feito colocando 10-20 ml de água estéril na câmara.
3. Ensaio de bioluminescência:
   • Depois de 24 hr de incubação, remova o meio e lavar as células rapidamente com gelado PBS (2X).
   • Adicionar 1 ml de PBS frio com 100 l de luciferina (Gold Biotecnologia, St Louis, MO).
   • Adquirir BL imagem (IVIS sistema Spectrum, Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) com vários tempos de exposição (1, 30, 60, 180 s).
   • Medir a intensidade de luz em cada poço usando o software Image Living (Caliper Life Sciences).

2. Estabelecimento de um modelo de metástase de câncer de mama cérebro

1. Preparação das células MDA-MB231/5HRE-ODD-luc
   • Recuperar e cultura as células MDA-MB231/5HRE-ODD-luc em meio DEME contendo 10% FBS, 1 glutamina% e 1% de penicilina / estreptomicina.
   • Substituir média a cada 2-3 dias. Tripsinize e lavar as células quando atingirem confluência de 80%.
   • Contar o número adequado de células e ressuspender-los em meio isento de soro DEME com Matrigel 25% (BD Biosciences, San Jose, CA) com uma concentração final de 10 ⁵ células em 4 mL de volume.
   • Células colocar no gelo antes da injeção intracraniana.
2. Implantação cirúrgica
   • Feminino camundongos nude (BALB / c nu / nu; National Cancer Institute, Bethesda, MD), 4-6 semanas de idade são usadas neste estudo.
   • Anestesiar (3% isoflurano / O2 em uma câmara de indução; isoflurano da Baxter International Inc., Deerfield, IL, EUA) e manter os animais com isoflurano (1%) em oxigênio (1 dm ³ / min) durante o procedimento cirúrgico ^3.
   • A pele parietal direito deve ser preparado com betadine e depois álcool 70% antes da incisão.
   • Utilizando uma broca de alta velocidade, burr um buraco de 1 mm no hemisfério direito do crânio, 1mm anterior à sutura coronal e 2 mm lateral à sutura sagital.
   • Draw 4 mistura de células mL (10 ⁵ células) usando um seringa 10 ml Hamilton (Hamilton Company, Reno, NV). Injetar as células diretamente no direito caudal diencéfalo, 1,5 mm abaixo da dura-máter usando um custom-made agulha 32G Hamilton. Mantenha a agulha no local por cerca de 30 s antes da retirada. Uso de uma agulha fina 32G minimiza dano tecidual.
   • Preencher o buraco com cera de osso rebarbas e fechar o couro cabeludo com suturas absorvíveis.
   • Preparar a região da incisão com álcool a 70%.
   • Aplicar buprenorfina analgesia a cada 12 horas durante dois dias.

3. Na imagem de bioluminescência in vivo de tumor na mama dinâmica hipóxia metástase do câncer de cérebro

• Iniciado imagem de bioluminescência longitudinal (IVIS sistema Spectrum) duas semanas após o implante intracraniana e repetir uma vez por semana durante 8-10 Semanas.
• Anestesiar três ratos em um momento (3% isoflurano / O ₂ em uma câmara de indução)
• Administrar uma solução de D-luciferina (120 mg / kg em PBS em um volume total de 80 mL; Biotecnologia Gold) por via subcutânea na região do pescoço de cada rato, como descrito em detalhes anteriormente ^4.

D-luciferina não é tóxico e tem se mostrado capaz de penetrar barreira hemato-encefálica intacta (BBB) ​​e membranas celulares ^3,5.

• Coloque os 3 ratos na câmara de imagem e mantida com isoflurano (1%) em oxigênio (1 dm ³ / min) durante o exame.
• Cinco minutos após a injeção de luciferina, adquirir BL imagem com uma matriz de tempo de exposição diversas (1, 30, 60, 180 s).

Nossas observações mostram que o tempo de emissão de pico de luz é de cerca de 5 minutos após a administração subcutânea de luciferina na região do pescoço ^3,4.

• Analisar os dados com o software de imagem Living (Caliper Life Sciences) usando contagem absoluta de fótons (fótons / s) em uma região de interesse (ROI), manualmente desenhados para traçar o sinal BLI do cérebro.
• Plot curva curso de tempo de contagem de fótons para indicar a dinâmica hipóxia tumor.
• Imediatamente após a última BLI, administrar pimonidazole, o marcador de hipóxia e 1 hr depois, o sacrifício dos camundongos e dissecar o cérebro. Incorporar o cérebro inteiro na temperatura ideal de corte (OCT) de médio e congelar em freezer -80 ° C. Coloração violeta cresil histológicas subseqüentes e coloração imuno-histoquímica contra a luciferase, hipóxia marcador pimonidazole e HIF-1α realizada para validar observações de imagem.

4. Resultados representativos:

Como mostrado na Fig.1, significativamente maior sinal de BLI foi observada após as células transfectadas incubados na câmara hipóxica (1% O ₂₎ durante 24 horas. Emissão de luz fraca foi observada a partir de células controle sob normóxia. Isto pode resultar da população cela superlotada após 24 h de cultura 3 x 10 ⁵ células, o que induziu um sinal de estresse para as células a HIF-1α superexpressam. No entanto, os resultados in vivo BLI foram validados por coloração imuno-histoquímica mostrando co-localização entre hipóxia tumor e expressão luciferase.

Um array automatizada de tempos de exposição permite aquisições contínua de uma série de imagens, o que facilita a captura de um sinal fraco, com maior tempo de exposição, e sinais de forte usando um tempo mais curto sem saturar o CCD.

Figura 1 ensaio in vitro HIF-1α bioluminescência linha Top:. 3 x 10 ⁵ células MDA-MB231/5HRE-ODD-luc incubadas em cada poço de uma 6-bem-prato em uma câmara de hipóxia (0,1% O ₂₎ para 24 hr antes do meio foi retirado, lavado, substituído com 1 ml de PBS. Imediatamente após 100 mL luciferina foi adicionado em cada poço, BLI foi adquirido com uma série de tempos de exposição (1, 30, 60, 180 s). Luminescência forte foi observada a partir de poços representante Linha inferior:. Como controle, 3 x 10 ⁵ células incubados em normóxia (21% O ₂₎ a luz emitida fraco.

Figura 2 Na imagem de bioluminescência vivo da dinâmica hipóxia tumor. A) Um sinal de luz fraca do lado direito do cérebro do rato foi visualizada 5 semanas após o implante de células de câncer intracraniano MDA-MB231/5HRE-ODD-luc mama. Aumento do sinal óptico foi observada ao longo de seis semanas adicionais, indicando hipóxia tumor aumentou. B) O enredo mostrou a curva de evolução no tempo da contagem quantitativa fóton de sinal luminoso.

Colocaliztion figura 3 do luciferase e hipóxia detectados pela imuno-químico de coloração. Um cérebro de camundongo congelado tendo uma metástase de câncer de mama MDA-MB231/5HRE-ODD-luc embutidos em outubro foi seccionado. Uma seção de 10 mM imunocoradas com encefalopatia hipóxico marcador, pimonidazole, revelou heterogeneidade intratumoral de hipóxia, que foi encontrado para correlacionar espacialmente com expressão luciferase detectado pelo anti-luciferase coloração. Barra de escala, 100 mm.

Discussão

De mama câncer de metástase cerebral ocorre em 30% dos pacientes com câncer de mama no estágio IV. Ela está associada com alta morbidade e mortalidade, com sobrevida mediana de 13 meses ^6. Há uma necessidade de ter modelos animais apropriados para imitar esta doença clinicamente devastadora, a fim de facilitar a nossa compreensão da sua iniciação intracraniana e progressão, bem como perfis fisiopatológicos. Aqui, temos desenvolvido um modelo ortotópico de câncer de mama metástase cerebral atrav...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários (opcional)
D-luciferina	Biotecnologia ouro	L-123	120 mg / kg em PBS em um volume total de 80 mL para estudo in vivo
Isoflurano	Baxter International Inc.	1001936060
Matrigel	BD Biosciences	354234
Hamilton seringa	Empresa Hamilton	1701
Hamilton 32G agulha	Empresa Hamilton	7803-04
Câmara de hipóxia	Billups-Rothenberg, Inc.	MIC-101
Sistema de imagem de bioluminescência	Caliper Life Sciences	IVIS sistema Spectrum
G418	Fisher científica	SV3006901