在小鼠模型体内生物发光成像乳腺癌脑转移的肿瘤乏氧动力学

摘要

缺氧诱导因子-1α活动的生物发光成像是用于监测在乳腺癌脑转移瘤小鼠模型的颅内肿瘤缺氧发展。

摘要

众所周知，肿瘤的缺氧起着促进恶性进展和治疗反应产生负面影响重要作用。有一点知识在原地，在体内 ，在缺氧的发展，因为缺乏有效的手段来监测这些深层次的原位肿瘤恶性脑肿瘤的颅内肿瘤，。生物发光成像（劳保局），表达的荧光素酶基因的活细胞所发出的光检测的基础上，已迅速采用为癌症研究，特别是评估肿瘤的生长或应对，在临床前动物研究治疗肿瘤的大小变化。此外，通过一个控制下的一个子序列的记者基因表达，特定的基因表达是可以被监测的非侵入性劳保局。缺氧压力下，主要通过缺氧诱导因子-1α（HIF -1α）介导的信号反应，以驱动各种基因的转录。因此，我们必须使用一个记者HIF -1α建设，5HRE多- LUC，稳定转染人乳腺癌MDA - MB231 细胞在体外HIF -1α的生物发光检测（MDA-MB231/5HRE-ODD-luc）是由孵化在低氧室，24小时前劳保局_（0.1％O 2）转染的细胞，而细胞在常氧_（21％O 2）作为一个控制。显着较高的光子通量细胞缺氧条件下的观察表明其启动的增加HIF -1α结合（HRE元素），比在常氧。细胞是直接注射到老鼠大脑建立一个乳腺癌脑转移瘤模型，在体内的肿瘤乏氧动力学生物发光成像。植入后2周开始，并反复每周一次。劳保局揭示增加脑肿瘤进展的光信号，表明增加了颅内肿瘤缺氧。组织学及免疫组织化学研究，以确认在体内成像结果。在这里，我们将介绍在体外 HIF -1α的生物发光检测，乳腺癌裸鼠和应用，在体内的生物发光成像技术来监测颅内肿瘤缺氧的脑转移瘤的手术建立的方法。

研究方案

机构动物护理和使用委员会的得克萨斯大学西南医学中心的所有动物的程序获得批准。

在体外 HIF -1α的生物发光检测1 。

1. 材料和方法:
   • 一种新型的HIF - 1依赖记者基因转染的人类转移性乳腺癌细胞株MDA - MB231，5HRE多 - 吕克博士原田生成。
   • 在缺氧条件下，氧依赖性降解域（ODD）荧光素酶融合蛋白的表达增强是由5份缺氧反应元件（5HRE）。奇的存在，导致奇 - 吕克在极低的背景荧光素酶活性在常氧条件下产生的蛋白质的降解。因此，这种新颖的系统可用于检测实时成像在肿瘤缺氧地区。有报道原田等^1,2本5HRE多- LUC表达载体的建设。
2. 在常氧或缺氧培养细胞:
   • 重组的MDA - MB231细胞保持在10％胎牛血清（FBS），DMEM培养基中含有1％谷氨酰胺，400微克/毫升的G418抗生素和1％青霉素/链霉素。
   • 在体外 HIF -1α的生物发光检测，板3 × ¹⁰ 5 MDA - MB231细胞表达在每两个六以及菜以及5HRE多- LUC载体。
   • 允许附加孵育过夜后的碟壁细胞，然后转移到缺氧的研究低氧室（比卢普斯罗森堡，公司德尔马，加利福尼亚州）一盘，而保持在常氧条件下（21％O _2）下的其他盘。
   • 重组与气瓶连接的进气口管与0.1％O _2的和气体的腔室。
     注:在此过程中，必须打开进气口和出气口夹具。
   • 断开气源后室已被清除和关闭塑料夹具密封腔。
   • 将用5％的CO ₂在37℃培养箱中培养室。
     注:商会必须加湿，以防止水分蒸发过快文化。这可以通过配售10 - 20毫升无菌水在会议厅内。
3. 生物发光检测:
   • 孵育24小时后，取出培养基，用冰冷的PBS（2X）的细胞迅速。
   • 添加1毫升冷PBS 100μL荧光素（金生物技术，圣路易斯，密苏里州）。
   • 获得不同的曝光时间（1，30，60，180秒）BL成像（IVIS频谱系统，卡尺生命科学，霍普金顿马）。
   • 测量光的强度在每口井使用的生活图像软件（卡尺生命科学版）。

2。乳腺癌脑转移瘤模型的建立

1. MDA-MB231/5HRE-ODD-luc细胞的制备
   • 检索和文化DEME培养基中含有10％FBS，1％谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素MDA-MB231/5HRE-ODD-luc细胞。
   • 更换介质每2-3天。 Tripsinize和清洗细胞，当他们达到80％汇合。
   • 计数适当数量的细胞，重悬在无血清DEME介质中，他们与4μL ^体积的10 5细胞终浓度25％的基质胶（BD公司，加利福尼亚州圣何塞）。
   • 细胞颅内注射前置于冰上。
2. 手术植入
   • 在4-6周龄雌性裸鼠（BALB / C NU / NU;，马里兰州贝塞斯达国立癌症研究所）在这项研究中使用。
   • 麻醉（3％异氟醚/感应室中的氧气，异氟醚从巴克斯特国际公司，迪尔菲尔德，IL，USA），并保持与异氟醚^{（1％），}氧（1 DM 3 / ^分 ）在手术过程3中的动物。
   • 右顶叶皮肤应prepped优碘，然后前70％的酒精切口。
   • 使用高速钻，毛刺冠状缝和矢状缝合横向到2毫米的头骨，1毫米前右半球在1毫米的孔。
   • 绘制4μL细胞的混合物^（10 5细胞）使用10μL注射器汉密尔顿（汉密尔顿公司，内华达州里诺市）。权尾椎间脑，硬脑膜下1.5毫米，使用一个特制的32G汉密尔顿针直接注入到细胞。在保持前撤出约30小号针。一个32G的细针的使用，最大限度地减少组织损伤。
   • 用骨蜡填充的毛刺孔和关闭与可吸收缝合线头皮。
   • 准备用70％酒精的切口地区。
   • 应用丁丙诺啡镇痛两天，每12小时。

（3） 在体内的生物发光成像在乳腺癌脑转移的肿瘤缺氧动态

• 8颅内植入和每周一次的重复启动纵向生物发光成像（IVIS频谱系统）两个星期后-10周。
• 一次麻醉三个小鼠（3％异氟醚/ O _2的感应室）
• 管理解决方案的D -荧光素（120毫克/公斤，在80μL总体积的PBS，黄金生物技术），皮下注射，每只小鼠的颈部区域， ^详细介绍了此前4。

D -荧光素是无毒的，并已被证明是能够穿透完整的血脑屏障（BBB）和^细胞膜 3,5 。

• 3小鼠放置在成像室，并保持与异氟醚（1％），氧（1 DM ³ /分）在成像。
• 荧光素注射后5分钟，获得"基本法"的成像阵列与一个不同的曝光时间（1，30，60，180秒）。

我们的观察表明，峰值光发射时间约5分钟后皮下注射的荧光素， ^在颈部3,4。

• 分析与生活成像软件（卡尺生命科学版）数据使用绝对光子计数（光子/秒），在感兴趣的区域（ROI），手工绘制的轮廓的大脑劳保局信号。
• 剧情时间当然光子计数曲线，表明肿瘤缺氧动态。
• 后立即去年劳保局，管理pimonidazole，缺氧标记和1小时后，牺牲小鼠，解剖的大脑。嵌入最佳切削温度（OCT）的中期和冻结在-80 ° C冰箱的整个大脑。随后的病理甲酚紫染色法和对荧光素酶，缺氧标记pimonidazole免疫组织化学染色，与HIF -1α进行验证成像观测。

4。代表性的成果:

如图1所示，劳保局信号显著较高的转染细胞在缺氧（1％O _2）室24小时孵育后观察。常氧条件下的对照组细胞观察到微弱的光发射。这可能会导致拥挤的细胞群从3 × 10 ⁵细胞应力信号，从而诱发细胞过度表达HIF -1α后24小时文化。然而， 在体内劳保局结果进行了验证通过免疫组织化学染色显示肿瘤的缺氧和荧光素酶表达的共定位。

自动化阵列的曝光时间，使连续收购的一系列图像，这有利于用较长的曝光时间捕捉微弱信号和强有力的信号，使用更短的时间内没有饱和的CCD。

图1体外 HIF -1α的生物发光检测的顶行^:3 × 10 5 24 MDA-MB231/5HRE-ODD-luc以及在缺氧室6以及盘_（0.1％O 2）在每个培养细胞中期小时前取出，洗净，用1 ml PBS代替。立即加入到每孔100μL荧光素后，劳保局收购阵列的曝光时间（1，30，60，180秒）。强发光代表井底部行:作为对照，3 × 10 ⁵细胞培养下发出微弱的光常氧（21％O _2）。

A）从鼠脑右侧的微弱的光信号，在体内的肿瘤乏氧动力学生物发光成像图 2。颅内植入第一个可视化的5个星期后的MDA-MB231/5HRE-ODD-luc乳腺癌细胞。观察到的光信号增加额外的6个星期，表明增加肿瘤缺氧B）的情节表明定量光信号的光子计数的时间过程曲线。

图3免疫组织化学染色检测到的荧光素酶和缺氧 Colocaliztion。轴承在OCT包埋的乳腺癌MDA-MB231/5HRE-ODD-luc的转移一个冷冻小鼠大脑切片。一个10微米的部分免疫染色标记，pimonidazole缺氧，发现瘤内的异质性缺氧，该产品被发现与抗荧光素酶染色检测的荧光素酶的表达空间的相关性。比例尺，100微米。

讨论

乳腺癌脑转移发生在IV期乳腺癌患者的30％。这是与高发病率和死亡率，并有一个中位生存期13个月^6。是需要有合适的动物模型，模仿这种破坏性疾病，在临床上为了便于我们了解其颅内的启动和进展，以及病理生理型材。在这里，我们已经开发注入人类乳腺癌细胞，直接进入鼠脑，原位乳腺癌脑转移模型。我们以前的经验表明，一个放射学可视化（MRI）的颅内病变植入约2周后出现。这个...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论（可选）
D -荧光素	黄金生物技术	L - 123	120毫克/公斤的PBS在体内研究的总体积80μL
异氟醚	巴克斯特国际公司	1001936060
基质胶	BD公司	354234
汉密尔顿注射器	汉密尔顿公司	1701
32G汉密尔顿针	汉密尔顿公司	7803-04
低氧室	比卢普斯罗森堡，公司	MIC - 101
生物发光成像系统	卡尺生命科学	IVIS光谱系统
G418	Fisher Scientific则	SV3006901