Meme Kanseri Beyin metastaz tümör Hipoksi Dynamics in vivo Biyoparlaklık Görüntüleme Fare Modeli

Özet

Hipoksi indüklenebilir faktör-1α aktivite Biyoparlaklık görüntüleme, bir meme kanseri beyin metastazı fare modeli intrakranial tümör hipoksi gelişimini izlemek için uygulanır.

Özet

Bu tümör hipoksi malign ilerlemesini teşvik ve terapötik yanıt olumsuz etkileyen önemli bir rol oynadığı kabul edilmektedir. Bu, derin yerleşimli ortotopik tümörlerin izlemek için verimli bir anlamı olmaması nedeniyle, kötü huylu beyin tümörleri intrakraniyal gelişimi sırasında in vivo, tümör hipoksi in situ hakkında az bilgi vardır. Lusiferaz gen ifade canlı hücreler tarafından yayılan ışık algılama dayalı Biyoparlaklık görüntüleme (BLI), preklinik hayvan çalışmalarında tedaviye yanıt olarak tümör büyüme ya da tümör boyutu değişiklikleri değerlendirmek için, hızla, özellikle, kanser araştırmaları için kabul edilmiştir. Ayrıca, bir muhabir gen promotor dizisinde kontrol altında ifade ederek, belirli bir gen ekspresyonu BLI tarafından non-invaziv takip edilebilir. Hipoksik stres altında, sinyal yanıtları ağırlıklı olarak hipoksi indüklenebilir faktör 1α (HIF-1α) aracılığıyla çeşitli genlerin transkripsiyon sürücü. Bu nedenle, stably insan meme kanseri MDA-MB231 hücreleri (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc) in vitro HIF-1α biyoparlaklık tahlil yapılır transfekte HIF-1α muhabiri inşa 5HRE-ODD-luc, normoxia hücrelerin (% 21 O ₂₎ bir kontrol olarak hizmet ederken, BLI 24 saat önce hipoksik odası (% 0.1 O ₂₎ transfekte hücreler kuluçka. Hipoksi altında hücreler için gözlenen anlamlı olarak daha yüksek foton akısı, organizatörü normoxia içinde olanlara oranla bir artış HIF-1α bağlanma (HRE elemanları), göstermektedir. Hücreler bir meme kanseri beyin metastazı modeli kurmak için doğrudan fare beyninin içine enjekte edilir, in vivo tümör hipoksi dinamikleri biyoparlaklık görüntüleme implantasyon sonrası 2 hafta başlatılan ve haftada bir kez tekrarlanır . BLI artmış intrakraniyal tümör hipoksi gösteren, beyin tümör ilerledikçe artan ışık sinyalleri ortaya koymaktadır. Histolojik ve immünhistokimyasal çalışmalar in vivo görüntüleme sonuçları onaylamak için kullanılır. Burada, in vitro HIF-1α biyoparlaklık tahlil, intrakranial tümör hipoksi izlemek için in vivo biyoparlaklık görüntülemede bir çıplak fare ve uygulama bir meme kanseri beyin metastazı cerrahi kurulması yaklaşımları tanıtacak.

Protokol

Bütün hayvan prosedürleri Teksas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

1 in vitro HIF-1α biyoparlaklık tahlil

1. Gereç ve Yöntem:
   • İnsan metastatik meme kanserli hücre hattı MDA-MB231, HIF-1-bağımlı bir roman muhabiri geni ile transfekte, 5HRE-ODD-luc Dr. Harada tarafından üretildi.
   • Hipoksik durum, gelişmiş, oksijen bağımlı bozulması etki alanı (ODD) Lusiferaz füzyon proteini ifade hipoksi-yanıt elemanı 5 kopyaya (5HRE) tarafından tahrik edilir. ODD varlığı normoksik koşullarında son derece düşük arka plan luciferase aktivitesi ile sonuçlanan ODD-Luc protein bozulmasına neden olur. Bu nedenle, bu yeni sistem, gerçek zamanlı görüntüleme ile bir tümör hipoksik bölgeleri tespit etmek için kullanılabilir. Harada ve ark ^1,2 ile inşaat 5HRE-ODD-luc ifade vektör bildirilmiştir.
2. Kültür normoxia veya hipoksi altında hücreleri:
   • % 10 fetal sığır serumu (FBS)-DMEM orta% 1 glutamin, 400 mikrogram / ml G418 antibiyotik ve% 1 penisilin / streptomisin içeren rekombinant MDA-MB231 hücreleri koruyun.
   • In vitro HIF-1α biyoparlaklık deneyi, plaka 3 x 10 5HRE-ODD-luc vektör her iki altı iyi yemeğin iyi ifade ⁵ MDA-MB231 hücreleri.
   • Normoksik durum (% 21 O ₂₎ altında diğer çanak tutmak hücreleri, gecelik inkübasyondan sonra çanak duvara takın ve daha sonra hipoksi hipoksi çalışmaları için bir odası (Billups-Rothenberg, Inc. Del Mar, CA) içine bir çanak transferi için izin verin .
   • % 0.1 O ₂ oda ve gaz odasına bir gaz silindiri ile giriş deliği boru bağlayarak monte edin.
     Not: Bu işlem sırasında her ikisi de giriş ve çıkış bağlantı noktası kelepçeler açık olmalıdır.
   • Plastik kelepçeler kapatarak tasfiye kamara ve sızdırmazlık odaları olmuştur sonra gaz kaynağı bağlantısını kesin.
   • % 5 CO ₂ ile 37 ° C inkübatör odasına yerleştirin.
     Not: odasına kültürlerin aşırı buharlaşma önlemek için nemlendirilmiş olmalıdır. - 20 ml steril su odasında 10 yerleştirerek başarılı olabilir.
3. Biyoparlaklık tahlil:
   • 24 saat inkübasyondan sonra, orta çıkarın ve buz PBS (2X) ile hücrelerin hızlı bir şekilde yıkayın.
   • 100 ul luciferase (Altın Biyoteknoloji, St Louis, MO), soğuk PBS 1 ml ekleyin.
   • (1, 30, 60, 180 s) farklı pozlama süreleri ile BL görüntüleme (IVIS Spektrum sistemi, kaliper Yaşam Bilimleri, Hopkinton, MA) edinin.
   • Her Yaşayan Image yazılımı (Kaliper Yaşam Bilimleri) kullanarak ışık yoğunluğunu ölçün.

2. Bir meme kanseri beyin metastazı model oluşturulması

1. MDA-MB231/5HRE-ODD-luc hücrelerin hazırlanması
   • % 10 FBS,% 1 glutamin ve% 1 penisilin / streptomisin içeren Deme orta MDA-MB231/5HRE-ODD-luc hücreleri almak ve kültür.
   • 2-3 günde bir orta değiştirin. Tripsinize ve% 80 izdiham ulaştığınızda hücreleri yıkayın.
   • Uygun sayıda hücre sayımı ve serum serbest Deme orta 4 ul hacmi 10 ⁵ hücre nihai bir konsantrasyon ile% 25 Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) ile tekrar süspansiyon haline getirin.
   • Intrakranial enjeksiyon öncesinde buz üzerine yerleştirin hücreleri.
2. Cerrahi implantasyon
   • Bu çalışmada Bayan çıplak farelerin (BALB / c nu / nu, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda, MD) eski 4-6 hafta kullanılır.
   • Anestezisi (indüksiyon odasında O2 / izofluran% 3, Baxter International Inc, Deerfield, IL, ABD izofluran) ve oksijen (1 dm ³ / dak) izofluran (% 1), cerrahi ^işlem 3 sırasında hayvanları korumak .
   • Sağ parietal cilt betadin ve sonra insizyon öncesi% 70 alkol ile prepped olmalıdır.
   • Yüksek devirli kullanarak, çapak, kafatası, 1mm ön sağ yarımkürede koronal sütür ve saggital dikiş lateral 2 mm 1 mm delik.
   • 4 ul hücre karışımı (10 ⁵ hücreleri) 10 ul Hamilton şırınga (Hamilton Company, Reno, NV) kullanarak çizin. Hücreleri doğrudan sağ kaudal diensefalon, ısmarlama bir 32G Hamilton iğne kullanarak duramater altında 1,5 mm içine enjekte edilir. Çekilme önce yaklaşık 30 iğne tutun. 32G ince iğne kullanımı, doku hasarı en aza indirir.
   • Burr hole kemik balmumu ile doldurun ve kafa derisi emilebilir dikişlerle yakın.
   • % 70 alkol ile kesi bölgesi hazırlayın.
   • Buprenorfin analjezi iki gün boyunca her 12 saat uygulayın.

3, meme kanseri beyin metastazı tümör hipoksi dinamikleri in vivo biyoparlaklık görüntüleme

• 8 haftada bir kez intrakranial implantasyon ve tekrar sonra uzunlamasına biyoparlaklık görüntüleme başlatın (IVIS Spektrum sistemi) iki hafta-10 Hafta.
• Bir seferde üç fareler anestezi (% 3 O ₂ / indüksiyon odasında izofluran)
• Daha önce ⁴ ayrıntılı olarak açıklandığı gibi her bir fare boyun bölgesinde subkutan D-luciferase (Altın Biyoteknoloji 120 mg / kg toplam hacminin 80 ul PBS) Yönetici bir çözüm .

D-luciferase non-toksik ve sağlam kan-beyin bariyeri (KBB) ve hücre zarlarının ^3,5 etme yeteneğine sahip olduğu gösterilmiştir .

• Görüntüleme odasında 3 fareler yerleştirin ve görüntüleme sırasında oksijen (1 dm ³ / dak) izofluran (% 1) ile korunur.
• Beş dakika luciferase enjeksiyon sonra, bir dizi çeşitli pozlama süresi (1, 30, 60, 180 s) BL görüntüleme kazanır.

Gözlemlerimiz tepe ışık yayma süresi boyun bölge ^3,4 luciferase subkutan uygulamadan sonra yaklaşık 5 dakika olduğunu gösteriyor.

• Living Görüntüleme yazılımı (Kaliper Yaşam Bilimleri) ile ilgi bir bölgede mutlak foton sayısı (fotonlar / s) kullanarak verileri analiz (ROI), beyin BLI sinyal anahat elle çizilmiş.
• Foton sayıları Arsa zaman içerisinde eğrisi tümör hipoksi dinamiği göstermek için.
• Son BLI hemen sonra, pimonidazole, hipoksi marker ve daha sonra 1 saat yönetmek fareler kurban ve beyinleri teşrih. Optimal Kesme Sıcaklık (OCT) orta ve donma -80 ° C derin dondurucu bütün beyinleri gömün. Daha sonraki histolojik kresil violet boyama ve lucifeares, hipoksi işaretleyici pimonidazole karşı immünohistokimyasal ve HIF-1α görüntüleme gözlemlerini doğrulamak için yapılır.

4. Temsilcisi sonuçları:

Şekil 1'de gösterildiği gibi, önemli ölçüde daha yüksek BLI sinyal, 24 saat hipoksik odası (% 1 _O 2) inkübe transfekte hücreler sonra gözlenmiştir. Zayıf ışık yayma normoxia altında kontrol hücreleri gözlendi. Bu, hücrelere bir stres sinyali HIF-1α eksprese uyarılan 3 x ⁵ 10 hücreleri, 24 saat kültürden sonra kalabalık hücre popülasyonu sonucu olabilir . Bununla birlikte, in vivo BLI sonuçları immünohistokimyasal boyama ile tümör hipoksi ve lusiferaz ifade arasındaki ko gösteren onaylandı .

Pozlama süreleri otomatik bir dizi uzun pozlama süresi ile zayıf bir sinyal yakalama kolaylaştırır dizi görüntüleri, doyurarak CCD olmadan kısa bir süre kullanarak güçlü sinyaller sürekli alımlar sağlar.

In vitro HIF-1α biyoparlaklık tahlil Şekil 1. sıra: 24 hipoksi bir odasında 6-iyi çanak (% 0.1 O ₂₎ her bir kuyunun içinde inkübe, 3 x ¹⁰ 5 MDA-MB231/5HRE-ODD-luc hücreleri saat orta önce kaldırılır yıkanmış ve 1 ml PBS ile değiştirilir. 100 ul luciferase her kuyuya eklendi hemen sonra, BLI maruz kez bir dizi (1, 30, 60, 180 s) elde edildi. Güçlü lüminesans temsilcisi kuyulardan gözlendi Alt satır: Kontrol olarak, 3 x 10 ⁵ hücre normoxia (% 21 O ₂₎ zayıf ışık yaydığı altında inkübe.

In vivo tümör hipoksi dinamikleri biyoparlaklık görüntüleme Şekil 2 A) fare beynin sağ tarafında zayıf ışık sinyali MDA-MB231/5HRE-ODD-luc meme kanseri hücrelerinin intrakranial implantasyonu ilk görüntülenmiştir 5 hafta sonra. Artan optik sinyal, ek 6 hafta içinde artan tümör hipoksi belirten gözlendi B) arsa, ışık sinyali kantitatif foton sayımı zaman ders eğrisi gösterdi .

Şekil 3 ve immun boyama ile kimyasal boyama tespit hipoksi lusiferaz Colocaliztion OCT gömülü bir metastaz meme kanseri MDA-MB231/5HRE-ODD-luc taşıyan bir donmuş bir farenin beyin kesitli oldu . 10 mikron bölümü, hipoksik işaretleyici, pimonidazole ile boyanmış anti-lusiferaz boyama ile tespit lusiferaz ifade ile mekansal olarak ilişkili bulunmuştur hipoksi intratümöral heterojenite saptandı. Ölçeği bar, 100 mm.

Tartışmalar

Meme kanseri, beyin metastazı Evre IV meme kanseri hastalarının% 30'unda ortaya çıkar. Yüksek morbidite ve mortalite ile ilişkili ve medyan sağkalım 13 ay ⁶ sahiptir. , Intrakranial başlangıcında ve ilerlemesinde gibi patofizyolojik profilleri anlaşılmasını kolaylaştırmak için bu klinik yıkıcı hastalığı taklit etmek için uygun hayvan modelleri için bir ihtiyaç vardır. Burada, insan meme kanseri hücreleri, fare beyninin içine doğrudan enjekte edilerek ortotopik meme kanseri ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
D-luciferase	Altın Biyoteknoloji	L-123	120 in vivo çalışmada toplam hacmi 80 ul PBS mg / kg
İsofluranın	Baxter International Inc.	1001936060
Matrigel	BD Biosciences	354234
Hamilton şırınga	Hamilton Şirket	1701
32G Hamilton iğne	Hamilton Şirket	7803-04
Hipoksi haznesi	Billups-Rothenberg, Inc.	MIC-101
Biyoparlaklık görüntüleme sistemi	Kaliper Yaşam Bilimleri	IVIS Spektrum sistemi
G418	Fisher Scientific	SV3006901