الاشتقاق الثقافات Oligodendrocyte المخصب وOligodendrocyte نيورون / Myelinating المشارك من الثقافات في مرحلة ما بعد الولادة مناديل الفئران

Summary

توضح هذه المقالة الطرق لاستخلاص اليورانيوم من السكان الفئران الخلايا السليفة oligodendrocyte (OPCs) في الثقافة الأولية ، والتي تفرق لإنتاج oligodendrocytes ناضجة (شريان الحياة). بالإضافة ، فإن هذا التقرير يصف التقنيات لانتاج الفئران myelinating المشترك الثقافات OPCs بذر الماوس على سرير neurite من الخلايا العصبية الظهرية الماوس العقدة الجذر (DRGNs).

Abstract

تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء التنمية رأ ليس فقط ضروري لتعزيز معرفتنا البيولوجيا الرتب الأخرى ، ولكن أيضا لفهم الآثار المرضية للأمراض المزيل مثل التصلب المتعدد (MS). تدرس عادة الخليوي تطوير النماذج الأولية مع ثقافة الخلية. زراعة الخلايا الأولية يسهل تقييم لإعطاء نوع من الخلايا من خلال توفير بيئة تسيطر عليها ، وخالية من المتغيرات الدخيلة التي تكون موجودة في الجسم الحي. في حين أن الثقافات رأ المستمدة من الفئران وفرت كمية هائلة من نظرة ثاقبة البيولوجيا OL ، وقد اجتمعت جهود مماثلة في إرساء ثقافات رأ من الفئران مع العقبات الرئيسية. تطوير أساليب عملية شريان الحياة لثقافة الفئران الأولية لا بد من أجل الاستفادة من خطوط الماوس المعدلة وراثيا المتوفرة.

وقد وصفت وسائل متعددة لاستخراج OPCs من أنسجة القوارض ، بدءا من neurosphere الاشتقاق ، والفرق تنقية التصاق immunopurification ^1-3. بينما تقدم العديد من أساليب النجاح ، والأكثر ثقافة واسعة تتطلب مرات و / أو معدات مكلفة / الكواشف. للتحايل على هذا ، وتنقية OPCs من أنسجة الفئران مع تكييف الطريقة الموصوفة في الأصل من قبل Vellis مكارثي & دي ² هو المفضل. هذا الأسلوب ينطوي على OPCs جسديا فصل من ثقافة الدبقية المختلطة المستمدة من القشور القوارض الولدان. والنتيجة هي مجموعة من السكان OPC المنقى التي يمكن أن تكون متمايزة في ثقافة OL - المخصب. هذا النهج هو جذابة بسبب الوقت القصير نسبيا على ثقافتها وشرط ضروري لعوامل النمو أو الأضداد immunopanning.

في حين استكشاف آليات التنمية رأ في ثقافة المنقى غني بالمعلومات ، فإنه لا يوفر البيئة الأكثر ملاءمة فيزيولوجيا لتقييم المايلين غمد تشكيل. وشارك في زرع شريان الحياة للسودان مع الخلايا العصبية تقديم نظرة ثاقبة على الأسس الجزيئية التي تنظم رأ بوساطة تكون الميالين من المحاور. بالنسبة للعديد من رأ / عصبون شارك في دراسات ثقافة ، وقد أثبتت الخلايا العصبية الظهرية العقدة الجذر (DRGNs) لتكون من نوع الخلايا العصبية في الاختيار. وهي مثالية للثقافة بالتعاون مع عملية شريان الحياة الخاصة بهم نظرا لسهولة استخراج ، كمية ضئيلة من الخلايا الملوثة ، وتشكيل أسرة neurite الكثيفة. بينما تم نشر الدراسات التي تستخدم الفئران / الماوس myelinating xenocultures ^4-6 ، طريقة لاستخلاص هذه رأ / DRGN myelinating شارك في ثقافات ما بعد الولادة من أنسجة الفئران لم يتم وصفها. هنا نقدم طرق تفصيلية بشأن كيفية إنتاج مثل هذه الثقافات على نحو فعال ، جنبا إلى جنب مع أمثلة من النتائج المتوقعة. هذه الطرق مفيدة لمعالجة المسائل ذات الصلة بالتنمية رأ / الوظيفة myelinating ، وأدوات مفيدة في مجال علم الأعصاب.

Protocol

بيان الأخلاق

وقد اهتم الفئران المستخدمة في هذا العمل وفقا للالمجلس الكندي للرعاية الحيوان (CCAC) المبادئ التوجيهية. تم الحصول على الموافقة الأخلاقية للتجارب التي أجريت من جامعة أوتاوا جنة رعاية الحيوان تحت رقم بروتوكول OGH - 119.

1. تشريح -- الولدان الماوس لاستخراج القشرة OPC

1. التضحية P0 - P2 الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
2. تشريح الدماغ ووضع في طبق بتري تحتوي على الجليد الباردة MEM (المضادات الحيوية مجانا).
3. نقل الطبق إلى مجهر تشريح.
4. باستخدام مشرط مع الدماغ الجانب الظهري يصل ، وجعل شق sagittally الضحلة على طول الحافة الإنسية الأكثر من كل القشرة (الشكل 1A). هذا ينبغي أن تمر إلا من خلال شق في طبقة السحائي بغية تسهيل إزالتها.
5. استخدام ملقط غرامة يميل إلى تقشر السحايا بطريقة جانبية. إذا فعلت بعناية ، يمكن إزالة هذه الطبقة في قطعة واحدة. أثناء هذه الخطوة ، إزالة بصيلات الشم.
6. مع الدماغ بطني الجانب المتابعة ، وجعل شق عميق السهمي حيث يلتقي اللحاء المنطقة البطنية من الدماغ البيني (الشكل 1B).
7. مع الجانب الظهري الدماغ المتابعة ، فصل القشور من الدماغ المتوسط ​​عن طريق التحديق في النسيج الإنسي إلى الوحشي أزياء (الشكل 1C ، ج "). إزالة أي السحايا المتبقية في هذه الخطوة.
8. النرد كل القشرة إلى ما يقرب من 4 قطع ونقل بلطف لأنبوب مخروطي 15 مل تحتوي على 350 ميكرولتر من الدماغ MEM الفأر الواحد. إبقاء الأنبوب على الجليد حتى يتم معالجة كافة الفئران.
9. كرر الخطوات من 1،1-1،8 عن الفئران المتبقية.

2. تفكك قشرات الولدان وصيانة ثقافات مختلطة الدبقية

ملاحظة : ينبغي تجنب إدخال فقاعات في الخلية أثناء تعليق كافة الخطوات التالية.

1. إضافة أنبوب 15 مل مخروطي يحتوي على تشريح أدمغة حديثا إلى 37 درجة مئوية لحمام الماء 3 دقائق.
2. نقل العقل لغطاء نسيج الثقافة العقيمة.
3. تمر بلطف قشرات مكعبات خلال قمة ماصة P1000 لتوليد أجزاء أصغر. توقف مرة واحدة pipetting لا توجد قطعة الدماغ كبيرة بما يكفي لعرقلة تدفق سلس للتعليق من خلال التلميح ماصة.
4. إضافة 75 ميكرولتر من محلول غراء OPC في الدماغ في أنبوب مخروطي الشكل. يجب أن يكون الحل غراء OPC مسبقا في درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل الاستخدام.
5. احتضان في حمام الماء ° 37 مئوية لمدة 20 دقيقة. تقريبا كل دقيقة 2 ، عكس بلطف أنبوب لمنع تراكم الأنسجة. خلال هذا الوقت ، وإضافة 5 مل من وسائل الإعلام مختلطة إلى كل ثقافة الدبقية بولي - L - يسين (PLL) مغلفة (1 ملغ / مل) T25 قارورة (واحد لكل قارورة الدماغ الماوس) ، والمكان في 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة 8.5 ٪ CO _2.
6. بعد 20 دقيقة ، مقابل تعليق الأنسجة لغطاء المحرك ومعقمة إضافة 2 مل من وسائل الإعلام مختلطة الثقافة الدبقية في الدماغ إلى الأنبوب. اسمحوا الجلوس لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة للسماح لتعطيل الحل غراء OPC.
7. قسامة تعليق النسيج إلى 5 مل من أنابيب بلاستيكية. يجب أن يكون عدد من الأنابيب مطابقة عدد من العقول تشريح ، مما أدى إلى ما يقرب من 2.5 مل في أنبوب.
8. باستخدام العقيمة اللهب مصقول ماصة باستير الزجاج ، يسحن بلطف الأنسجة في كل أنبوب. متمزج ببطء في البداية ، وزيادة السرعة تدريجيا كقطع فصل. متمزج حوالي 10-15 مرة ، ولكن هذا العدد قد تختلف استنادا إلى كفاءة الهضم.

ملاحظة : وكيل سحن سيؤدي إلى تفكك النسيج الفقراء ، في حين أن الإفراط في سحن سوف تؤثر سلبا على سلامة الخلية. من المهم أن لا يعرض فقاعات في الحل ، لأن هذا سوف يؤثر بشدة بقاء الخلية.

9. مرة واحدة لا توجد كتل الأنسجة المرئية المتبقية في التعليق ، ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل تحتوي على 4 مل من وسائل الإعلام مختلطة في الدماغ الدبقية الثقافة (أي 4 = 16 مل أدمغة مختلطة وسائل الإعلام الثقافة الدبقية).
10. بلطف عكس أنبوب مخروطي 50 مل وكرر لأنابيب المتبقية 5 مل.
11. قسامة تعليق خلية مجمعة في أنابيب مخروطية 15 مل (حوالي 6.5 مل في أنبوب مل 15). يجب أن يكون عدد الأنابيب 15 مل يطابق عدد تشريح أدمغة.
12. أنابيب الطرد المركزي في 1200 دورة في الدقيقة (~ 300 غ) لمدة 5 دقائق.
13. نضح بعناية طاف وإضافة 1 مل من الحارة مختلطة وسائل الإعلام لثقافة الدبقية كل أنبوب 15 مل المخروطية.
14. resuspend ببطء بيليه مع طرف ماصة P1000 ، والحرص على عدم إدخال الفقاعات. إضافة تعليق كل خلية من الأنبوب إلى القارورة قبل معايرتها T25 PLL مغلف بالمطاط ، مما يجعل الحجم الإجمالي للثقافة وسائل الإعلام إلى 6 مل.
15. ضع القوارير في نسيج الثقافة حاضنة لل3-4 ساعات للسماح للخلايا لإرفاق الركيزة PLL. إجراء تغيير وسائل الإعلام الكاملة pipetting من وسائل الإعلام ، وإضافة 6 مل من وسائل الإعلام الجديدة المختلطة للثقافة الدبقية القوارير. هذه الخطوة يزيل الكثير من الحطامبسبب سحن ، ويعزز قابلية الثقافة. إذا المطلوب رأ / DRGN المشترك الثقافات ، تشير إلى المادة 3 من هذا البروتوكول.
16. بعد 3 أيام من الثقافة ، وإجراء تغيير 03/02 وسائل الاعلام عن طريق إزالة 4 مل من وسائل الإعلام ، واستبدالها ب 4 مل من وسائل الاعلام ثقافة جديدة مختلطة الدبقية. عند هذه النقطة ، ينبغي أن يكون أحادي الطبقة نجمية تتشكل على قاعدة قوارير.
17. في يوم 6 ، وأداء وسائط أخرى 03/02 التغيير وتكملة القوارير مع التركيز النهائي للانسولين ميكروغرام / 5 مل. عند هذه النقطة ، ينبغي أن يكون أحادي الطبقة نجمية تكون مرئية بوضوح ، وعلى رأسها OPCs سيتم المتكاثرة.

3. DRGN العزلة

ملاحظة : للإنتاج رأ / DRGNs المشترك الثقافات ، وينبغي وضع DRGNs اليوم بعد جيل ثقافة الدبقية مختلطة. وتزرع هذين النوعين الثقافة بشكل مستقل ، وبعد الجمع بين 90-10 يوما.

1. التضحية P5 - P10 الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
2. استخراج العمود الفقري ، ونقل إلى طبق بيتري نظيفة.
3. تقليم بعيدا كما الكثير من العضلات والعظام والعمود الفقري من قدر الإمكان (الشكل 1D ، 'د) ، وهذا سيخفف من تشريح العقد الجذرية الظهرية (DRGs).
4. نقل العمود الفقري لقطع طبق بيتري بطني جديدة تصل إلى جنب. باستخدام مقص تشريح والبدء caudally ، وقطع إعلامي من خلال العمود الفقري بطريقة طولية.
5. باستخدام اثنين من أزواج من الملقط ، نقب بلطف فتح العمود الفقري لفضح الحبل الشوكي.
6. ويمكن الاطلاع على DRGs تحت والوحشي للنخاع الشوكي. باستخدام الملقط يميل غرامة ، وإزالة بلطف DRGs مع تفادي الأضرار التي لحقت العقد (الشكل 1E).
7. نقل إلى حل DRGs إزالة الجليد الباردة هانك ملح مخزنة (HBSS ، خالية من المضادات الحيوية) في طبق بتري جديدة. ينبغي للمشرح تهدف لاستخراج 40 DRGs في الماوس (الشكل 1F).
8. بمجرد أن يتم استخراج DRGs ، تقليم DRGs أي جذور طويلة بشكل مفرط (الشكل 1G ، 'ز) لتقليل تلوث إدخال الخلايا في الثقافة (الخلايا الدبقية ، الخلايا الليفية).
9. نقل DRGs لأنبوب الطرد المركزي 1.5 مل تحتوي على 500 ميكرولتر من HBSS الجليد الباردة.
10. أجهزة الطرد المركزي في 1200 دورة في الدقيقة (~ 300 غ) لمدة 5 دقائق عند 4 درجة مئوية لبيليه في DRGs.
11. نقل أنابيب الطرد المركزي لغطاء نسيج الثقافة العقيمة وإزالة HBSS من الأنابيب.
12. إضافة 500 ميكرولتر من قبل حرارة (20 دقيقة عند 37 درجة مئوية) حل DRG غراء ، واحتضان الأنابيب في المياه 37 درجة مئوية لمدة الحمام 10 دقيقة. عكس كل الأنابيب 2 دقيقة لمنع تجميع الأنسجة.
13. كرر الخطوة 3.10.
14. إزالة الحل غراء DRG وإضافة 500 ميكرولتر من قبل حرارة (20 دقيقة عند 37 درجة مئوية) كولاجيناز الحل. احتضان في حمام الماء ° 37 مئوية لمدة 10 دقيقة ، عكس كل دقيقة 2.
15. كرر الخطوة 3.10.
16. طاف إزالة وإضافة 1 مل من وسائل الاعلام DRGN. عكس مرات عدة أنبوب.
17. كرر الخطوة 3.10.
18. كرر الخطوة 3.16.
19. معطف العقيمة اللهب الزجاج المصقول ماصة باستور مع ألبومين المصل البقري (BSA) عن طريق pipetting حل جيش صرب البوسنة 0.25 ٪ في عدة مرات HBSS. سيتم طلاء مع حل جيش صرب البوسنة منع DRGs من الانضمام إلى جدران ماصة الزجاج.
20. يسحن في DRGs مع ماصة BSA المغلفة برفق في البداية ، وزيادة كثافة مع بدء الفصل بين كتل أخرى. متمزج حوالي 10-15 مرة ، ولكن هذا الرقم يعتمد على درجة من الهضم ، وعدد DRGs في الأنبوب.
21. متى تم تحقيق الانفصال ، تمرير تعليق من خلال تصفية 50 ميكرومتر في طبق بتري معقمة تحتوي على 7 مل من وسائل الاعلام DRGN. وسوف يقضي على الكثير من الترشيح الانقاض من التعليق الخلية ، على الرغم من أن هذه الخطوة ليست حرجة.
22. احتضان طبق بيتري عند 8.5 ٪ CO ₂ لنحو 1.25 ساعة.
23. معطف عدة coverslips 12 ملم مع LN2 (10 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني) في صحن 24 - جيدا خلال هذه الفترة الحضانة.
24. بمجرد الانتهاء من الحضانة ، ومراقبة طبق بيتري تحت حقل مشرق. ويتم تحديد الخلايا DRGNs كما كبيرة المرحلة جسديا ، والظلام. دوامة طبق بيتري برفق لرفع أي DRGNs الالتزام.

ملاحظة : العديد من الخلايا الملوثة وانضمت بشدة على طبق بيتري ، وبالتالي إثراء التعليق الخاص خلية لDRGNs.

25. تعليق نقل الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الشطف بلطف الطبق مع 4 مل من وسائل الاعلام لجمع أي DRGN DRGNs المتبقية. نقل إضافية 4 مل في أنبوب مخروطي الشكل.
26. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1200 دورة في الدقيقة (~ 300 غ).
27. وطاف نضح resuspend الكرية في 500 ميليلتر من وسائل الإعلام DRGN الطازجة.
28. حساب عدد DRGNs أسفرت باستخدام عدادة الكريات. لا شك أن نعتمد فقط على DRGNs ، وغيرها من أنواع الخلايا لا. ويمكن التعرف من خلال هذه DRGNs كبيرة أجسام الخلايا كروية.
29. البذور 30،000-50،000 DRGNs إلى كل ساترة LN2 المغلفة في 1 مل من وسائل الاعلام DRGN ، والمكان في 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة حاضنة CO ₂ و 8.5 ٪ بين عشية وضحاها.
30. في صباح اليوم التالي ، بإجراء تغيير كامل وسائل الاعلام عن طريق استبدال DRGNوسائل الاعلام مع وسائل الاعلام رأ (ناقص CNTF) مع التركيز النهائي من القلم 1 ٪ / بكتيريا و 10 ميكرومتر FuDR.
31. في أيام 3 و 5 ، تنفيذ تغيير وسائل الإعلام 3 / 4 مع وسائل الإعلام نفسها كما في الخطوة 3.30.
32. في يوم 7 ، إجراء تغيير كامل مع وسائل الاعلام وسائل الاعلام رأ (ناقص CNTF ، القلم / بكتيريا ، FuDR).
33. في يوم 9 ، ينبغي أن يكون تشكيل DRGNs سرير neurite واسعة النطاق ، ونحن الآن على استعداد ليكون التعاون مع OPCs مثقف.

4. تنقية OPCs من ثقافات مختلطة الدبقية لإنشاء OL - المخصب الثقافات أو رأ / DRGN شارك ثقافات

1. في يوم 9 من ثقافة الدبقية المختلطة ، ونقل إلى قوارير شاكر المداري في 5 ٪ CO ₂ نسيج الثقافة الحاضنة. ضع القوارير على رأس القوارير الفارغة T25 لمنع أي الحرارة المتولدة من شاكر المداري من التأثير سلبا على الثقافات المختلطة الدبقية. السماح للثقافات لكي تتوازن هذه حاضنة جديدة لمدة 1 ساعة.
2. مرة واحدة في قوارير ومعايرتها ، يهز القوارير في 50 دورة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة. الغرض من هذا هو اهتزاز لإزالة أي خلايا ملتصقة فضفاضة من تلويث أحادي الطبقة.
3. نقل الخلايا إلى الأنسجة هود ثقافة وإزالة كافة وسائل الإعلام من القوارير. استبدال 4 مل من وسائل الاعلام ثقافة جديدة مختلطة الدبقية تستكمل مع 5 ميكروغرام / مل الانسولين.
4. ضع القوارير ليعيدوه الى شاكر ، والسماح للتوازن لحوالي 3 ساعات.
5. مرة واحدة في قوارير ومعايرتها ، ربط بشكل آمن إلى شاكر المداري ، ويهز قوارير لحوالي 16 ساعة في دورة في الدقيقة 220 (بين عشية وضحاها).
6. في صباح اليوم التالي ، إذا هي عملية شريان الحياة التي يمكن زراعتها في غياب DRGNs (أي OL - أغنت الثقافة) ، ومعطف عدة العقيمة coverslips 12 ملم مع LN2 (10 ميكروغرام / مل في PBS) لمدة 1 ساعة. نقل coverslips إلى 24 الأطباق جيدا ، وتغسل مع PBS يعقبه غسل ​​الإعلام OL. إضافة 1 مل من وسائل الإعلام إلى كل رأ جيدا ويوازن في CO ₂ و 8.5 ٪.
7. CO يوازن 10 سم نسيج ثقافة الأطباق في 5 ₂ ٪ لمدة 30 دقيقة. وسوف تكون هناك حاجة طبق واحد عن كل قارورة 2. وسوف تستخدم هذه لتخصيب اليورانيوم من الالتصاق الفرق OPCs مع وقف التنفيذ.
8. مرة واحدة في موازنة 30 دقيقة قد مرت فترة ، ونقل وسائل الإعلام من قوارير اهتزت إلى الأطباق. يجب على كل صحن استقبال وسائل الاعلام في الفترة من 2 القوارير ، أي ما يعادل حوالي 8 مل من تعليق خلية في صحن 10 سم.
9. احتضان الأطباق في 5 ٪ CO ₂ لمدة 30 دقيقة ، في حين يوفر دفع لطيف عند علامة 15 دقيقة. وهذا يساعد على منع دفع OPCs من الانضمام إلى صحن 10 سم.
10. بمجرد اكتمال الحضانة ، ودراسة ميدانية تحت أطباق مشرق. كما يتم تحديد OPCs كتل زنزانة صغيرة ، وعادة من 3-5 خلايا ولكن في بعض الأحيان شكل مجاميع كبيرة تشبه neurospheres. وينبغي أن العديد من الخلايا النسب غير رأ الالتزام بحزم على قاعدة اللوحة. بلطف دوامة لوحات لفصل أي OPCs انضمت فضفاضة ، ونقل تعليق خلية من كل لوحة في أنبوب 15 مل المخروطية.
11. أجهزة الطرد المركزي في 1200 دورة في الدقيقة (~ 300 غ) لمدة 5 دقائق.
12. Resuspend الكرية في 1 مل من وسائل الاعلام رأ مع طرف ماصة P1000 ، تليها إعادة تعليق مع طرف ماصة P200.
13. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
14. لإثراء - OL الثقافات ، وبذور 25000 -- 50000 OPCs إلى كل ساترة LN2 12 ملم المغلفة في الحجم النهائي من وسائل الإعلام 1 ر مل.
15. لرأ / DRGN المشترك الثقافات ، وأداء وسائل الإعلام الكاملة رأ (ناقص CNTF) التغيير على DRGNs من المقطع [3] ، وإضافة بلطف 50000 الخلايا من الخلية OPC تعليق التخصيب. الحرص على عدم تعطيل السرير neurite DRGN خلال إضافة OPCs.
16. مكان الثقافات في الحاضنة 37 درجة مئوية في 8.5 ٪ CO ₂ ، وحتى تجنب إزالة التثبيت. سوف OPCs الفئران حساسة للتغيرات في درجة الحموضة ، والعزل من الحاضنة تغيير درجة الحموضة وسائل الإعلام OL. لاحظ أيضا ، وسوف درهم إضافة إلى ₂ O الآبار الفارغة المحيطة الثقافات الخلية منع التبخر وسائل الإعلام والثقافة ، وبالتالي تقليل التقلبات في تركيزات المواد المذابة في وسائل الاعلام الرتب الأخرى. هذا وسوف توفر بيئة أكثر اتساقا لOPCs.

5. تجهيز الثقافات المناعي للفحص المجهري

1. الإصلاح الثقافات مع الميثانول بنسبة 100 ٪ عند -20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ، أو بارافورمالدهيد 3 ٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
2. Permeabilize coverslips بنسبة 0.1 ٪ تريتون - X - 100 لمدة 10 دقيقة ، مع غسل الفوسفات مخزنة المالحة كتلة (PBS) و لمدة 1 ساعة في مصل الماعز 10 ٪.
3. احتضان coverslips مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
4. غسل coverslips 3 مرات مع برنامج تلفزيوني ، واحتضان مع الأضداد اليكسا - ثر الثانوية مترافق (Invitrogen) المخفف في عرقلة الحل لمدة 45 دقيقة.
5. ملون مباين مع 4 "،6 - diamidino - 2 - phenylindole (دابي) وتغسل coverslips عدة مرات مع برنامج تلفزيوني.
6. جبل في الفلورية coverslips داكو تصاعد المتوسط.
7. تحليل الشرائح عن طريق الفحص المجهري المناعي. في هذا البروتوكول ، وتم تحليل الشرائح مع إما مضان زايس 200M Axiovert المقلوبمجهر أو LSM زايس الليزر META 510 مجهر المسح مبائر.

6. استخراج البروتين كامل الخلية من رأ التخصيب الثقافات

1. إزالة 24 جيد من الثقافات وحاضنة باردة على الجليد لمدة 3 دقائق.
2. إزالة بعناية وسائل الإعلام ، وإضافة 10-20 ميكرولتر من تحلل العازلة (50 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم ، 0.1 ٪ SDS ، 0.5 ٪ deoxycholate الصوديوم ، 1 ٪ تريتون - X - 100 ، مع pepstatin 0.1 ٪ ، أبروتينين ، PMSF ، leupeptin ، orthovanadate الصوديوم) على كل بئر (ويقترح ما لا يقل عن 8 آبار في العينة).
3. كشط الآبار باستخدام مجموعة واسعة من عيار غيض ماصة P1000 ، ونقل إلى lysate مل أنبوب الطرد المركزي 1.5.
4. تمرير lysate خلال حقنة نصف عيار 30 حوالي 15 مرة ، والبرد على الجليد لمدة 30 دقيقة.
5. أنابيب الطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة (~ 20000 ز) لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
6. طاف لنقل أنابيب أجهزة الطرد المركزي الجديدة ، وتخزينها في -80 درجة مئوية.

7. SDS - PAGE تحليل البروتين الثقافة المخصب - OL

1. حل 30 ميكروغرام لكل عينة من البروتين في تقليل العازلة SDS - PAGE على مستوى المواد الهلامية البولي أكريلاميد 12 ٪.
2. نقل المواد الهلامية شبه الجافة على الأغشية PVDF.
3. الأغشية كتلة لمدة 1 ساعة في 5 ٪ مسحوق الحليب الخالي من الدسم في TBST (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0 ، 150 مم كلوريد الصوديوم ، 0.1 ٪ توين - 20).
4. احتضان الأغشية مع الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل لمدة 1 ساعة.
5. غسل الأغشية 3 مرات مع TBST لمدة 10 دقيقة.
6. احتضان الأغشية مع HRP - مترافق الأجسام المضادة الثانوية لمدة 45 دقيقة في عرقلة الحل.
7. غسل الأغشية عدة مرات مع TBST ، واحتضان مع ECL أمرشام بلس الغربية كاشف الكشف النشاف (GE للرعاية الصحية) لمدة 5 دقائق.
8. اكتشاف بروتين مع عصابات معيار الفيلم التصوير العلمي.

8. ممثل النتائج :

في هذا البروتوكول ، ويتم توسيع OPCs على المونولاير نجمية داخل ثقافة الدبقية مختلطة. هذا مستمد من ثقافة مختلطة الدبقية P0 - P2 القشرة الماوس الولدان. في يوم 1 في المختبر (DIV1) ، وثقافة مختلطة تحتوي على خلايا الدبقية مع morphologies متفاوتة من وجهة نظر المجهر النقيض المرحلة (الشكل 2A). في DIV3 ، وهو أحادي الطبقة نجمية يبدأ النموذج على قاعدة القارورة ، وعلى DIV8 ، يمكن بوضوح ملاحظة OPCs على سطح أحادي الطبقة. في DIV9 ، وصلت كثافة انتشار OPCs تكون كافية لتنقية عن طريق هز عالية السرعة بين عشية وضحاها المداري. بمجرد الانتهاء من عملية التنقية ، والنتيجة هي الخلية السكان OPC التخصيب. DIV1 في مرحلة ما بعد تنقيتها ، ومورفولوجيا OPCs بسيطة ، وتوسيع نطاق العمليات قليلة (الشكل 2B). في تنقية DIV3 آخر ، وقد مددت خلايا meshwork معقدة من العمليات ، تذكرنا عملية شريان الحياة غير ناضجة. في تنقية DIV6 آخر ، وسوت عملية شريان الحياة للتنقية والمتوقعة النشرة هياكل شبيهة الغشاء. هذا التطور المورفولوجي هو نموذجي من النضج في المختبر من شريان الحياة.

المجهري يشير المناعي للخلايا وتنقيته من OL - النسب (الشكل 3A). في البداية أعرب المصنف OPCs شوندروتن بروتيوغليكان سلفات (NG2) ، وتتطور إلى الميلين المرتبطة بروتين سكري (MAG) عملية شريان الحياة غير ناضجة إيجابية في غضون ثلاثة أيام بذر آخر (الشكل 3B). في DIV6 ، وكثير من البروتين المايلين عن عملية شريان الحياة الأساسية (MBP) ، وتمتلك نموذجية مورفولوجيا رأ ناضجة. وكميا في المئة OL - نسب الخلايا في نقاط زمنية مختلفة لتحديد نقاء الثقافات OL - المخصب (الشكل 3C). في آخر لتنقية DIV1 والثقافات هي 50 ± 14 ٪ NG2 OPCs ^{هاء +} ، مع عدم وجود ^{هاء + +} MBP MAG أو عملية شريان الحياة ^هاء. هذا يدل على تنقية OL - نسب الخلايا في مرحلة تمهيدية في وقت البذر ، مع أعداد ضئيلة من عملية شريان الحياة المتباينة. في DIV3 ، شريان الحياة في العديد من الخلايا المتمايزة MAG ^{هاء +} (24 ± 5.9 ٪) في حين أن بعض الإبقاء على النمط الظاهري السلائف ، وتبقى NG2 + (13 ± 8.0 ٪). في DIV3 ، وهي نسبة صغيرة من الخلايا MAG ^{هاء +} (3.2 1.2 ٪) هي أيضا تعبير عن MBP. في DIV6 ، 20 ± 5.9 ٪ من المجموعة الاستشارية للألغام وعملية شريان الحياة ⁺ في حين ^قمت 12 ± 7.3 ٪ كما تستمر NG2 ⁺ OPCs ^هاء. بالإضافة إلى ذلك ، 21 ± 9.3 ٪ من الخلايا داخل الثقافة هي شريان الحياة MBP ^{+ هاء} في هذه النقطة الزمنية. SDS - PAGE يبين التحليل التعبير متدرجة من 3' - فسفودايستراز 2'3' - دوري - النوكليوتيدات (CNP) MBP والثقافة خلال فترة 6 أيام ، مما يدل على زيادة قدرة OPCs في الثقافة التفريق عضال في عملية شريان الحياة الناضجة (الشكل 3D ). بشكل جماعي ، وهذه البيانات تضع هذا الأسلوب كوسيلة لانتاج نظام الثقافة OL - المخصب المناسب للدراسة من النضج رأ OPCs.

هذا البروتوكول أيضا وصف أساليب لإنشاء رأ / DRGN المشترك الثقافات باستخدام مصادر الأنسجة الفئران فقط. ومع ذلك ، من أجل إنتاج المشارك الثقافة ، لا بد أولا أن يكون المثقف DRGNs وحده لانتاج شبكة neurite كافية. وتزرع هذه الثقافات ما بعد الولادة الخلايا العصبية الفئران لمدة 9 أيام في وسائل الاعلام المصل منخفضة ب 10 ميكرومتر مكملات FuDR لمنع انتشار الخلايا الليفية وتلويث GL الاتحاد العالمي للتعليم الخلايا. على مدى 9 أيام في المختبر ، DRGNs معزولة انتاج سرير neurite الكثيفة (الشكل رقم 4A). هذا السرير هو neurite immunopositive للعلامات العصبية neurofilament 200 (NF) وTuj1 (الشكل رقم 4B). عند هذه النقطة ، يمكن إضافة OPCs المنقى إلى أسرة neurite ، ومثقف ل6 أيام إضافية لإنتاج myelinating المشترك الثقافات.

في DIV6 من رأ / DRGN المشترك والثقافة ، والعديد من MBP ^{+ لقد} لاحظ عملية شريان الحياة يمكن ان يكون من بين neurites NF DRGN ^{+ هاء} (الشكل 5A). بناء على فحص دقيق ، وتدل عملية شريان الحياة لاجراء اتصالات مع العديد من neurites DRGN ، مغمد في كثير من الأحيان مع MBP ⁺ غشاء ^هاء (الشكل 5B ، ج).

الشكل 1. الصور مجهر تشريح جوانب معينة من القشرة الماوس الولدان والعزلة DRG. (أ) عرض الظهرية من مخ الفأر الولدان المستخرج حديثا. الخطوط المنقطة تشير إلى المنطقة التي يجب أن تكون فتحات لتسهيل إزالة طبقة السحائي (ب) عرض بطني من الدماغ ، والخطوط المنقطة تشير إلى المنطقة حيث قشرة الدماغ البيني يفي البطني. ولا بد من بذل الشقوق العميقة على طول الخطوط المنقطة للمساعدة في عزل القشور (ج ج ') تصوير مرئي لكيفية ابعاد القشرة بعيدا عن بقية المخ. (د) طازجة معزولة العمود الفقري الماوس P5 - P10 قبل تقليم بعيدا العضلات والعظام الزائدة (د ') (ه) موقع DRGs داخل العمود الفقري (و) العدد التقريبي للDRGs أن تكون معزولة عن بعضها الماوس (ز) DRG مع جذور طويلة والتي تتطلب التشذيب قبل الهضم الأنزيمي. خط منقط يشير إلى المنطقة التي ينبغي أن يقص جذور (ز ') DRG آخر الجذر التشذيب.

الشكل 2. يتم توسيع OPCs ضمن ثقافة الدبقية المختلطة ، وتنقيتها ، ومتمايزة في وقت لاحق بوصفها ثقافة OL - المخصب. (أ) على النقيض من الصور المرحلة الثقافات الدبقية مختلطة في مراحل مختلفة من التنمية. في DIV1 ، تظهر الخلايا مستديرة مع عدد قليل من الخلايا التي سويت بالأرض. التقسيم الطبقي للثقافة الدبقية مختلطة يبدأ في DIV3 ، حيث تشكل الخلايا النجمية المونولاير موحدة على قاعدة القارورة ، التي يعتمد عليها OPCs تتكاثر. وينظر العديد من OPCs في DIV8 (سهام) انضمت إلى سطح المونولاير نجمية (ب) وبمجرد تنقية الثقافة من الدبقية المختلطة ، وقد مددت DIV1 OPCs فقط بعض العمليات. في DIV3 ، فقد مددت خلايا العديد من العمليات ، تذكرنا المرحلة المتوسطة شريان الحياة. في DIV6 ، شريان الحياة بالارض (النجمة) ويبدو أن إنتاج أوراق الغشائي (خط متقطع). أشرطة النطاق ، 50 ميكرومتر.

الشكل 3. توصيف OL - أغنت الثقافة. (أ) الصور متحد البؤر المعزولة من عملية شريان الحياة في مراحل مختلفة من التنمية. NG2 ⁺ لقد ^قمت OPCs مورفولوجيا بسيطة ، في حين أن عملية شريان الحياة ⁺ MAG ^لقد تملك arborous عمليات متعددة. MBP ^{+ لقد} قمنا بمد عملية شريان الحياة الغشائي النخاعين مثل الأوراق. مقياس بار ، و 50 ميكرومتر (ب) تنقية OL - النسب كما تنشأ خلايا OPCs ، والتفريق في ^{+ لقد} MAG ، شريان الحياة MBP ^{+ لقد} أكثر من 6 DIV. في DIV1 ، كل OPCs هي ^{+ لقد} NG2 ، في حين لا يتم MAG ^{+ + هاء} أو MBP ^هاء. في DIV3 ، MAG ^{+ + لقد قمت} وMBP قليلة هي شريان الحياة واضحا الآن. غالبية عملية شريان الحياة وماج وMBP ^{+ اشتركوا} في DIV6 ، مع NG2 القليلة المتبقية ⁺ OPCs ^هاء. مقياس شريط ، و 100 ميكرومتر (ج) متوسط ​​القيم ± SD الخلايا OL - النسب في المئة في مراحل مختلفة من التنمية أكثر من 6 DIV. في DIV1 ، كافة الخلايا OL - النسب هي NG2 ^{+ هاء} ، والمحاسبة لمدة 50 ± 14 ٪ من مجموع خلايا داخل الثقافة. في DIV3 وDIV6 ، OL - النسب حساب الخلايا على التوالي لمدة 36 ± 6.8 ٪ و 32 ± 8.4 ٪ من مجموع الخلايا ، التي تتألف من نسب متفاوتة من NG2 ^{+ هاء} ، MAG ^{+ + لقد} وMBP عملية شريان الحياة ^هاء (د) القيام SDS - PAGE على البروتين المستمدة من الثقافات OL - المخصب مما يدل على التعبير متدرجة من علامات OL - CNP وMBP خلال الفترة DIV الثقافة 6.

الشكل 4. توصيف بذر DRGN قبل OPC الثقافة. (أ) المرحلة على النقيض من الصور من DRGNs خلال الفترة DIV ثقافة ما قبل 9 OPC البذر. DRGNs تنشأ كما كبيرة جسديا الخلايا مع بعض العمليات ، وإنتاج شبكة neurite معقدة على نحو متزايد. مقياس شريط ، و 100 ميكرومتر (ب) الصور متحد البؤر الثقافات DRGN الثابتة في DIV9 (قبل البذر OPC) وملون لخلية عصبية محددة وعلامات Tuj1 NF200. أنتجت DRGNs شبكة neurite التي قد تكون على المصنف OPCs لإنتاج رأ / DRGN myelinating المشترك الثقافات. مقياس بار ، و 50 ميكرومتر.

الأنف والحنجرة ">
الشكل 5. عملية شريان الحياة المشتركة مع المثقفين نتيجة DRGNs في رأ بوساطة التفاف neurites DRGN مع MBP ⁺ غشاء ^هاء. (أ) صورة 4 - مبائر مجال المونتاج لDIV6 رأ / DRGN الثقافة المشتركة. MBP كثيرة يمكن أن ينظر إلى عملية شريان الحياة ^{+ لقد} التفاعل مع سرير الكامنة neurite DRGN. مقياس شريط ، و 100 ميكرومتر (ب) عرض تضخيم مبائر MBP من عملية شريان الحياة ^{+ لقد} التفاف neurites DRGN متعددة. مقياس بار ، و 50 ميكرومتر (ج) التكبير الرقمي في المنطقة تدل في (ب) حيث يتم لف neurite DRGN مع غشاء OL. مقياس بار ، و 25 ميكرومتر.

Discussion

هذا التقرير يصف طريقة لعزل OPCs الفئران عن التمايز في الثقافات OL - OL المخصب أو / DRGN المشترك الثقافات. عند المثقف وحده ، OPCs تفرق في عملية شريان الحياة MBP ^{+ هاء} ، وإنتاج النخاعين مثل أوراق غشائي. عندما تضاف إلى أسرة DRGN neurite ، شريان الحياة في غلف neurites DRGN مع MBP ⁺ غشاء ^هاء. هذا النموذج يفيد التحقيق في الأسس التي تحكم معقدة رأ بوساطة ensheathment محواري.

في حين أن قيمة كبيرة ، وإنشاء مثل هذه الثقافات يشكل تحديا تقنيا. على وجه الخصوص ، وتشمل الجوانب تطالب كفاءة الهضم الأنسجة / التفكك ، والحفاظ على توازن درجة الحموضة ثقافة الإعلام ، والتغيرات DRGN وسائل الإعلام. من المهم أن نرى أن طول الهضم ، ويجري استيعاب كمية الأنسجة وكمية سحن يؤثر على فعالية ونتيجة نهاية تفارق الأنسجة. ليس من غير المألوف بالنسبة للباحثين من ذوي الخبرة للحصول على غلة الخلوية منخفضة من فصل أنسجة الجهاز العصبي. بالإضافة إلى ذلك ، OPCs الفئران تميل إلى أن تكون حساسة للتغيرات في درجة الحموضة وسائل الإعلام والثقافة ، وخاصة في ظل الظروف القلوية. الحفاظ على الثقافات في CO ₂ و 8.5 ٪ يهدف إلى منع حدوث ذلك ، تظهر منذ OPCs على تحمل الظروف الحمضية أفضل بقليل الأساسية. فيما يتعلق DRGNs التغذية ، ويجب إجراء تغييرات وسائل الإعلام بسرعة حتى لا يجفف الخلايا العصبية ، ومع ذلك ، يجب أن يكون لطيف حتى لا تعطل السرير neurite النامية. وسائل الاعلام قد المفاجئ التغييرات طرد من السرير neurite الركيزة ، ويؤدي على الأرجح في التفكك التام من ساترة.

ميزة المحتملة لهذا النظام النموذجي يلقي بظلاله بشكل كبير طبيعته تطالب تقنيا. ميزة واحدة من هذا النظام هو استخدام ما بعد الولادة الفئران لاشتقاق ثقافة الخلية ، ملتفا على ضرورة التضحية تربية الإناث لحصاد الأنسجة الجنينية. ميزة أخرى هي عدم وجود شرط لعوامل النمو (GFS) للتوسع في OPCs. ثقافات مختلطة الدبقية توفير بيئة تدعم نشر OPCs ، ويفترض أن يعود إلى وجود عوامل التغذية نجمية المشتقة. أساليب أخرى ، مثل الاشتقاق عبر neurospheres ^7،8 ، تعتمد على خصائص مولد للتفتل من GFS مثل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) ، عامل نمو البشرة (EGF) وصفائح المستمدة عامل النمو (PDGF) للتوسع OPC. وبالمثل ، وذلك باستخدام ما بعد الولادة (P5 - 10) الفئران ليتجنب DRGNs شرط المكمل لثقافة الإعلام مع عامل نمو الاعصاب (NGF) ، وهو عامل التغذية العصبية اللازمة للبقاء على قيد الحياة في المختبر من DRGNs الجنينية ^{9 و 10.} فمن مصلحة لتجنب استخدام NGF كما أنه يؤثر سلبا على قدرة myelinating عملية شريان الحياة عند المثقف مع DRGNs ^4. تجنب استخدام GF - تستكمل وسائل الإعلام أيضا فوائد اقتصادية ، إذ أن هذه الكواشف تصبح مكلفة عند استخدامها على نطاق واسع.

ولعل أهم فائدة من هذا النموذج هو ثقافة الاشتقاق من الماوس فقط الأنسجة ، وبالتالي توفير الفرص لاستخلاص كل من OPCs وDRGNs من تشكيلة واسعة من خطوط الفأر المعدل وراثيا. وهذا يسمح لدراسة كل من و / أو DRGN OPC محددة الخصائص التي تحكم تكون الميالين. وسوف يكون هذا أهمية خاصة بالنسبة للتوضيح التفاعلات مستقبلات / يجند تنظيم رأ بوساطة تكون الميالين من المحاور. في كل شيء ، هذه التقنية هي ذات قيمة كبيرة بالنسبة للبحوث علم الأعصاب بسبب تطبيقاتها نحو فهم الاشارات الجزيئية الكامنة وراء تكون الميالين.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم المنتج	شركة	رقم المنتج
Dulbecco في التعديل النسر متوسطة (DMEM)	Multicell	319-005 - CL
هانك محلول الملح المتوازن (HBSS)	Invitrogen	14170-112
وسائل الإعلام الأساسية الدنيا (MEM)	GIBCO	12360-038
الجنين مصل البقر (FBS)	GIBCO	10091-148
البنسلين الستبرتوميسين (القلم / بكتيريا)	GIBCO	15140-122
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
بولي - L - يسين	سيغما الدريخ	P2636
الأبقار مصل الزلال (BSA)	سيغما الدريخ	A4503
الإنسان merosin تنقية البروتين (LN2)	ميليبور	CC085
المؤتلف عامل الفئران عصبية الهدبية (CNTF)	PeproTech	450-50
L - هرمون الغدة الدرقية	Biochemika	89430
هولو ، ترانسفيرين	سيغما الدريخ	T0665
B27 تكملة	GIBCO	0080085 - SA
الأنسولين البقري	سيغما الدريخ	I6634
3،3 '،5 - Triiodo - L - ثيرونين	سيغما الدريخ	I6634
البروجسترون	سيغما الدريخ	P8783
بوتريسين	سيغما الدريخ	P7505
الصوديوم زيلونيت	سيغما الدريخ	S5261
5 - الفلورية 2' - deoxyuridine (FuDR)	سيغما الدريخ	F0503
غراء الحل	ورثينجتون	LS003126
DNaseI	ROCHE	1010159001
L - السيستين	سيغما الدريخ	C7352
24 الأطباق جيدا زراعة الأنسجة	Cellstar	662-160
T25 النسيج ثقافة القوارير مع غطاء تنفيس	كورنينج	430639
10 سم أطباق زراعة الأنسجة	كورنينج	430167
10 سم طبق بتري	فيشر العلمية	0875713
كولاجيناز A	ROCHE	103578
CellTrics 50 ميكرون فلتر (اختياري)	PARTEC	04-004-2327
بروتين النخاعين الأساسي (MBP) جسم	عبد Serotec	MCA409S
NG2 الأضداد	ميليبور	AB5320
المايلين المرتبطين جلايكوبروتين (MAG) الأضداد	ميليبور	MAB1567
2 '، 3' - دائرى - النوكليوتيدات 3' - فسفودايستراز (CNP) الأضداد	كوفانس	SMI - 91R - 100
أكتين عموم AB - 5 الأضداد	فيتزجيرالد	10R - A106AX
Neurofilament - 200 (NF) الأضداد	سيغما الدريخ	N4142
بيتا 3 تويولين سلسلة (Tuj1) الأضداد	ميليبور	MAB5544
الكسا فلور 488 الماعز المضادة للأرنب مفتش (H + L) الأجسام المضادة الثانوية	Invitrogen	A11008
الكسا فلور 555 الماعز المضادة للمفتش الماوس (H + L) الأجسام المضادة الثانوية	Invitrogen	A21422
الكسا فلور 647 ماعز مكافحة الجرذان (مفتش) (H + L) الأجسام المضادة الثانوية	Invitrogen	A21247
الماعز المضادة للمفتش الماوس (H + L) - HRP الضد الثانوية مترافق	BioRad	170-6516
الماعز لمكافحة الفئران مفتش (H + L) - HRP الضد الثانوية مترافق	سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية	SC - 2065
4 '،6 - diamidino - 2 - phenylindole (دابي)	سيغما الدريخ	D9542

عنصر	إضافة إلى مبلغ
DMEM	100 مل
BSA	1.02 ز
البروجسترون	0.6 ملغ
بوتريسين	161 ملغ
الصوديوم زيلونيت	0.05 ملغ
3،3 '،5 - Triiodo - L - ثيرونين	4 ملغ

عنصر	إضافة إلى مبلغ
DMEM	23.75 مل
OL - 100X الملحق	250 ميكرولتر
البقري الأنسولين (من المخزون ملغ / مل 1)	125 ميكرولتر
GlutaMAX	250 ميكرولتر
هولو ، ترانسفيرين (من المخزون ملغ / مل 33)	37.5 ميكرولتر
B27 الملحق	500 ميكرولتر
FBS	125 ميكرولتر
CNTF (من المخزون نانوغرام / ميكرولتر 50)	25 ميكرولتر

عنصر	التركيز النهائي
FBS	10 ٪
القلم / بكتيريا (0.33 ٪ من الأسهم)	33 وحدة / مل البنسلين والستربتوميسين 33 ميكروغرام / مل
GlutaMAX	1 ٪

عنصر	التركيز النهائي
FBS	10 ٪
القلم / بكتيريا (1 ٪ من الأسهم)	100 وحدة / مل و 100 البنسلين الستبرتوميسين ميكروغرام / مل

عنصر	التركيز النهائي
غراء الحل	1.54 ملغ / مل
L - السيستين	360 ميكروغرام / مل
DNaseI	60 ميكروغرام / مل

عنصر	التركيز النهائي
غراء	1.54 ملغ / مل
L - السيستين	360 ميكروغرام / مل

عنصر	التركيز النهائي
كولاجيناز A	4 ملغ / مل