Method Article
Bu makale, olgun oligodendrosit (EKK) üretmek için ayırt primer kültür fare oligodendrosit öncü hücreler (OPC) zenginleştirilmiş nüfus, elde etmek için yöntemler anlatılmaktadır. Buna ek olarak, bu rapor üretmek için teknikler açıklar fare fare dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) neurite yatağa fare OPC ekim ortak kültürler myelinating.
OL geliştirme altında yatan moleküler mekanizmaları belirleme OL biyoloji bilgimizi ilerletmek için yalnızca kritik değil, Multipl Skleroz (MS) gibi demiyelinizan hastalıkların patogenezinde anlamak için de etkileri vardır. Hücresel gelişimi sık primer hücre kültür modelleri ile çalışılmaktadır. Primer hücre kültürü, in vivo olarak bulunan gereksiz değişkenlerin kontrollü bir ortam sağlayarak, belirli bir hücre tipi değerlendirilmesi kolaylaştırır . Sıçanlarda türetilen OL kültürler OL biyoloji içgörü büyük bir miktar olsa da, fareler OL kültürler kurmayı benzer çabalar büyük engellerden ile karşılandı. Transgenik fare hatları yararlanmak amacıyla kültür fare primer OLS için yöntemler geliştirmek zorunludur.
Neurosphere türev, diferansiyel yapışma arıtma ve 1-3 immunopurification arasında değişen, kemirgen dokusundan OPC çıkarılması için birden çok yöntem tarif edilmiştir. Pek çok yöntem başarı sunarken, en kapsamlı kültür ve / veya pahalı ekipman / reaktifler gerektirir. Bunu aşmak için, başlangıçta McCarthy & de Vellis 2 tarafından açıklanan yöntemi bir adaptasyon fare doku OPC arındırıcı tercih edilir. Bu yöntem, fiziksel neonatal kemirgen korteks türetilen karışık bir glial kültüründen ayıran OPC içerir. Sonuç, bir saflaştırılmış OPC nüfusu OL-zenginleştirilmiş kültür ayrılabilir. Bu yaklaşım, görece kısa bir kültür zaman ve büyüme faktörleri veya immunopanning antikorlar için gereksiz gereksinimi nedeniyle itiraz ediyor.
, Saflaştırılmış bir kültür OL gelişme mekanizmaları keşfetmek bilgilendirici olmasına rağmen, miyelin kılıf oluşumu değerlendiren için en önemli fizyolojik bir ortam sağlamaz. Co-kültür OLS nöron aksonları OL-aracılı miyelinasyonun düzenleyen moleküler temellerinin içgörü ödünç. / OL nöron ko-kültür çalışmaları birçok insan için, dorsal kök ganglion nöronlar (DRGNs) seçim nöron türü olduğu kanıtlanmış. Ekstraksiyon, kirlenmesine neden olan hücreler az miktarda ve yoğun neurite yatak oluşumu kolaylığı nedeniyle OLS ile ko-kültür için idealdir. 4-6 xenocultures myelinating sıçan / fare kullanarak çalışmalar yayınlanmış olsa da, böyle derivasyon için bir yöntem DRGN / OL post-natal fare doku ortak kültürler myelinating tanımlanmıştır değil. Burada etkili beklenen sonuçlar örnekleri ile birlikte, bu tür kültür üretmek için nasıl ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Bu yöntemler OL geliştirme / myelinating fonksiyonu ile ilgili sorulara yanıt için yararlı ve faydalı araçlar sinirbilim alanında.
Etik Beyanı
Bu çalışmada kullanılan fareler, Kanada Hayvan Bakım Konseyi (CCAC) yönergeleri doğrultusunda bakım. Ottawa Hayvan Bakımı Komitesi Üniversitesi OGH-119 protokol numarası altında yapılan deneyler için etik kurul onayı alınmıştır.
1. Diseksiyon - OPC ekstraksiyonu için yenidoğan fare korteks
2. Karma glial kültürlerin neonatal korteks ve bakım Fototerapisi
Not: baloncuklar hücre süspansiyonu içine giriş aşağıdaki adımları sırasında kaçınılmalıdır.
Not: Under-öğütme, aşırı-öğütme hücre canlılığı üzerindeki olumsuz etkisi ise doku yoksul disosiyasyon neden olacaktır. Bu hücre canlılığı ciddi bir etkisi olarak, çözüm kabarcıkları tanıtmak için çok önemlidir.
3. DRGN izolasyon
Not: ortak kültürler DRGNs / OL DRGNs karışık glial kültür nesilden gün kurulmuş olmalıdır üretmek için kullanılır. Her iki kültür tipleri bağımsız olarak büyüdü ve 9-10 gün sonra birleştirilir.
Not: Birçok kirlenmesine neden olan hücreleri güçlü, böylece DRGNs hücre süspansiyonu zenginleştirici, Petri kabı yapıştırılır olacak.
4. OL-zenginleştirilmiş kültür veya DRGN / OL ortak kültürler kurulması için karışık glial kültürlerden gelen OPC saflaştırılması
5. Immünofloresan mikroskopi için kültürler İşleme
6. OL-zenginleştirilmiş kültürlerden gelen tüm hücre proteini çıkarma
7. Zenginleştirilmiş-OL kültür protein SDS-PAGE analizi
8. Temsilcisi Sonuçlar:
Bu protokol, OPC astrosit karışık bir glial kültürü içinde bir tek tabaka genişletilmiştir. Bu karışık glial kültür P0-P2 yenidoğan fare korteks türetilmiştir. In vitro (div1) 1. gün, karışık glial kültürü, faz kontrast mikroskobu (Şekil 2a) görüldüğü gibi değişik morfolojileri ile hücreler içerir . DIV3, balonun tabanındaki bir astrosit tek tabaka oluşturacak şekilde başlar ve DIV8 az OPC tek tabaka yüzeyinde açıkça gözlenebilir. DIV9, prolifere OPC gecede yüksek hızda orbital sallayarak arındırılmalıdır yeterli yoğunluk ulaşmıştır. Arınma süreci tamamlandıktan sonra, sonuç bir OPC-zenginleştirilmiş hücre popülasyonu. Div1 sonrası arıtma, OPC birkaç süreçler (Şekil 2b) uzanan, basit morfoloji var. DIV3 yazılan arıtma, hücreler olgunlaşmamış EKK'nın anımsatan süreçlerin karmaşık bir ağda, genişletmiştir. DIV6 yazılan arıtma, arıtılmış OLS basık ve broşür gibi membran yapılar yansıtılan var. Bu morfolojik gelişimi EKK'nın in vitro olgunlaşma tipik .
İmmünofloresan mikroskopi saflaştırılmış hücreleri OL-soyundan (Şekil 3a) gösterir. Tohumlu başlangıçta ifade kondroitin sülfat proteoglikan (NG2) OPC, üç gün tohumlama (Şekil 3b) içinde myelin ilişkili glikoprotein (MAG) pozitif olgunlaşmamış OLS dönüşebilir. DIV6 anda birçok OLS ifade miyelin bazik protein (MBP) ve sahip tipik olgun OL morfolojisi. Yüzde OL-lineage hücreleri OL zenginleştirilmiş kültürleri (Şekil 3c) saflığını belirlemek için farklı zaman noktalarında ölçüldü. Div1 yazılan arıtma, kültürler 50 ±% 14 NG2 + ve OPC, hiçbir MAG + ve veya MBP + Ve OLS. Bu saflaştırılmış OL-lineage hücreleri farklılaşmış OLS ihmal numaraları ile, ekim zamanında habercisi aşamasında gösterir. DIV3 bazı habercisi fenotip korumak ve NG2 kalırken, birçok OLS MAG + Ve hücreleri (24 ±% 5.9) ayrılabilir + (13 ±% 8.0). DIV3, MAG + Ve hücreleri (3.2% 1.2) küçük bir oranda da MBP ifade. DIV6, EKK'nın 20 ±% 5.9 MAG + 12 ±% 7.3 NG2 + ve OPC olarak devam Ve iken. Buna ek olarak, kültür hücreleri içinde 21 ±% 9.3 MBP + Ve bu kez noktada OLS. SDS-PAGE analizi, daha ölümcül (Şekil 3d olgun OLS ayırt etmek için kültürü içinde OPC yeteneğini gösteren 2'3'-siklik nükleotidin 3'-fosfodiesteraz (CNP) ve 6 günlük kültür dönemi boyunca MBP aşamalı ifade .) Olursak, bu veriler OPC OL olgunlaşma çalışma için uygun bir OL-zenginleştirilmiş kültür sistemi üreten bir araç olarak bu yöntem kurar.
Bu protokol, fare sadece doku kaynakları kullanarak DRGN / OL ortak kültürler kurmak için yöntemler de açıklamaktadır. Ancak, ortak kültür üretmek amacıyla, DRGNs ilk kez tek başına yeterli bir neurite ağ oluşturmak için kültür olmalıdır. Bu post-natal fare nöron kültürleri kirlenmesine neden olan fibroblastlar ve gl yayılması önlemek için 10 mcM FuDR takviyesi ile düşük serum medyada 9 gün için yetiştirilen ial hücreleri. In vitro 9 gün boyunca yoğun bir neurite yatak (Şekil 4a), izole DRGNs üretir. Bu neurite yatak nöronal belirteçlerinin nörofilaman 200 (NF) ve Tuj1 (Şekil 4b) immünopozitif. Bu noktada, saflaştırılmış OPC neurite yatak eklenebilir ve ortak kültürler myelinating üretmek için ek bir 6 gün kültüre.
Ko-kültür DRGN / OL, birçok MBP + Ve OLS NF + ve DRGN neurites (Şekil 5a) arasında gözlenen olabilir DIV6 anda. Daha yakından bir inceleme üzerine, EKK, onları sık sık bir MBP + ve membran (Şekil 5b, c) ensheathing, çok sayıda DRGN neurites ile temas kurmaya kanıtlandığı.
Şekil 1. Yenidoğan fare korteks ve DRG izolasyon belirli yönlerini Diseksiyon mikroskobu görüntüleri. (A) taze çıkarılan yenidoğan fare beyin Dorsal görünümü. Noktalı çizgiler kesiler meningeal tabakasının kaldırılmasını kolaylaştırmak için yapılmış olmalıdır alanı belirtir, (b) Ventral görüntüsü, beynin korteks ventral diensefalon karşılayan noktalı çizgiler alanı belirtir . Korteks izolasyonu yardım etmek için noktalı çizgiler boyunca derin kesiler yapılabilir gerekir. Beynin geri kalanı uzak korteks gözetlemek nasıl Görsel tasviri (c-c ') (d) taze izole P5-P10 fare omurga aşırı kas ve kemik (d) kırparak önce omuriliğe içinde DRG'ler (e) Yer ve (f) bir fare izole edilmelidir DRG'ler yaklaşık sayısı (g) DRG gerektiren uzun köklere sahip enzimatik sindirim önce kırparak. Noktalı çizgi kökler kesilmiş olmalı bölgede gösterir. Yazılan kök kırpma DRG (g ').
Şekil 2. OPC, glial karışık bir kültürün içinde genişletilmiş, saflaştırılmış ve daha sonra bir OL-zenginleştirilmiş kültür olarak farklılaşmış . (A), karışık glial kültürlerin farklı gelişim aşamalarında Faz kontrastlı görüntüler . Div1 birkaç basık hücreleri, hücreler yuvarlak görünür. Karışık glial kültür Tabakalaşma astrositler OPC prolifere edildiği termos, tabanı düzgün bir tek tabaka oluşturur DIV3 başlar. Birçok OPC DIV8 astrosit tek tabaka yüzeyine yapıştırılır (oklar) görülmektedir (b) karışık glial kültürü arınmış, div1 OPC sadece birkaç süreçleri genişletmiştir. DIV3, hücre ara-aşamalı EKK anımsatan birçok süreçleri, genişletmiştir. DIV6, basık OLS (yıldız) (kesikli çizgi) membranöz yaprak görünür. Ölçek barlar, 50 mm.
Şekil 3. OL-zenginleştirilmiş kültür Karakterizasyonu. (A) farklı gelişim aşamalarında izole OLS Konfokal görüntüler. NG2 + MAG + Ve OLS birden fazla arborous süreçleri sahip ise ve OPC, basit morfoloji var . MBP + Ve OLS membranöz miyelin gibi yaprak genişletilmiş. Ölçeği bar, 50 mikron (b) Saf OL-lineage hücreleri OPC olarak köken ve 6 DIV içinde MAG, MBP + ve + Ve OLS farklılaşırlar. Hiçbiri MAG + ve veya MBP + Ve iken div1, tüm OPC, NG2 + ve. DIV3, MAG + ve birkaç MBP + Ve OLS artık ortadadır. EKK'nın çoğunluğu kalan birkaç NG2 + ve OPC ile, MAG ve MBP + ve DIV6. Ölçeği bar, 100 mikron (c) Ortalama değerler ± SD DIV 6 farklı gelişim aşamalarında yüzde OL-lineage hücreleri. Div1, tüm OL-lineage hücreleri NG2 + 50 Ve, muhasebe ±% 14 toplam hücre kültürü içinde. DIV3 ve DIV6, OL-soyundan hücrelerin sırasıyla 36 ± 6.8 ve% 32 ±% 8.4, toplam hücre, NG2 arasında değişen oranlarda oluşan + ve MAG + ve MBP + Ve OLS. (D) SDS-PAGE ile yapıldı 6 SAYI kültür dönemi boyunca kademeli ifade OL-belirteçlerinin CNP ve MBP gösteren zenginleştirilmiş OL kültürler elde edilen protein.
Şekil 4. DRGN kültür öncesi OPC tohumlama Karakterizasyonu. (A) ön-OPC tohumlama 9 SAYI kültür dönemi üzerinde Faz DRGNs kontrastlı görüntüler. DRGNs birkaç süreçleri ile büyük gövdeli hücreleri gibi kaynaklanan ve giderek daha karmaşık neurite ağ üretirler. Ölçek çubuğu, 100 mikron (b), DIV9 (pre-OPC tohumlama) sabit ve nöron spesifik belirteçler Tuj1 ve NF200 lekeli DRGN kültürlerin Konfokal görüntüler . DRGNs OPC DRGN / OL ortak kültürler myelinating numaralı seribaşı olabilir bunun üzerine bir neurite ağ üretmişlerdir. Ölçeği bar, 50 mm.
Bu rapor, kültürleri ya da OL-zenginleştirilmiş DRGN / OL ortak kültürler farklılaşma fare OPC izole etmek için bir yöntem açıklanır. Yalnız kültür, OPC MBP içine ayırt + Ve EKK, miyelin benzeri membranöz levha üretim. Neurite yatak DRGN eklendiği zaman, OLS MBP DRGN neurites sarmak + ve membran. Bu model, OL-aracılı aksonal ensheathment yöneten karmaşık temellerinin araştırılması yarar sağlar.
Büyük bir değer olsa da, bu tür kültürlerin kurulması, teknik olarak çok zordur. Özellikle zorlu yönlerini etkili doku sindirim / disosiasyon, dengeli bir kültür ortamı pH bakım ve DRGN medya değişiklikleri içerir. Sindirim uzunluğu, doku miktarı sindirilir ve öğütme miktarı doku ayrılma etkinliği ve sonuçta etkiler olduğunu göz önünde bulundurmak önemlidir. Ayrışmış sinir sistemi dokularında düşük hücresel verimi elde etmek için deneyimli araştırmacılar için alışılmadık bir durum değildir. Buna ek olarak, fare OPC, özellikle alkali koşullar altında, kültür ortamı pH değişikliklerine duyarlı olma eğilimindedirler. % 8.5 CO 2 kültürlerin bakım OPC temel üzerinde hafif asidik koşullarda daha iyi tolere görünen bu yana, bu önlemek için amaçlamaktadır. Ancak, medya değişiklikleri, beslenme DRGNs ile ilgili olarak, nöronlar ile kurutun olarak hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilir olmalıdır gelişmekte neurite yatak bozmayacak gibi hafif olmalıdır. Ani medya değişiklikleri yüzey neurite yatak, ve lamel tam ayrılma olası sonuç yerinden olabilir.
Bu model sisteminin potansiyel liyakat, teknik açıdan zorlu doğa büyük ölçüde düşer. Bu sistemin bir avantajı, embriyonik doku hasat üreme kadın feda etmeye gerek engellemeyi, hücre kültürü derivasyon için post-natal farelerin kullanılması. Diğer bir avantajı OPC genişlemesi için büyüme faktörleri için gereğinin olmaması (GDS). Karışık glial kültürler astrosit türetilen trofik faktörlerin varlığı nedeniyle muhtemelen OPC yayılmasını destekleyen bir ortam sağlar. Türetme yoluyla neurospheres 7,8 gibi diğer yöntemler, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF), epidermal büyüme faktörü (EGF) ve OPC genişleme için trombosit kökenli büyüme faktörü (PDGF) gibi GF'lerin mitojenik özellikleri güveniyor. Benzer şekilde, postnatal (P5-10) DRGNs için fareler kullanarak, sinir büyüme faktörü (NGF), embriyonik DRGNs 9, 10, in vitro hayatta kalmak için gerekli bir nörotrofik faktör ile kültür ortamı tamamlayan gereği önler . Ilgi DRGNs 4 ile kültüre EKK'nın myelinating kapasitesini olumsuz etkiler olarak NGF kullanmaktan kaçının. Kullanımı kaçınmak GF-desteklenmiş büyük ölçekte kullanılan bu reaktifler pahalı gibi medya da, ekonomik faydaları vardır.
Belki de bu kültürün modelin en önemli yararı, bu nedenle, transgenik fare hatları çok çeşitli OPC ve DRGNs elde etmek için fırsatlar sağlayarak, sadece fare dokuları türevidir. Bu her iki DRGN ve / veya miyelinasyonun yöneten OPC-spesifik özellikleri çalışma için izin verir. Bu aksonlar OL-aracılı miyelinasyonun düzenleyen reseptör / ligand etkileşimleri nedenlerine açıklık için özellikle önemli olacaktır. Bu teknikte, miyelinasyonun altında yatan moleküler ipuçları anlamaya yönelik uygulamaları nedeniyle nörolojik araştırma açısından büyük bir değer taşımaktadır.
Çıkar çatışması ilan etti.
Bu proje, Kanada Multipl Skleroz Derneği RKRWO bir hibe ile finanse edildi Kanada Multipl Skleroz Derneği Bursu bir alıcı. SDR, Kanada ve Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri Multipl Skleroz Derneği Doktora Sonrası Araştırma Bursu bir alıcı.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ürün Adı | Şirket | Ürün Numarası | |
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Medium (DMEM) | Çok hücreli | 319-005-CL | |
Hank Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | |
Minimum Essential Medya (MEM) | Gibco | 12360-038 | |
Fetal sığır serumu (FBS) | Gibco | 10091-148 | |
Penisilin-Streptomisin (Pen / Strep) | Gibco | 15140-122 | |
GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | |
Poli-L-lisin | Sigma-Aldrich | P2636 | |
Sığır Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
İnsan merosin saflaştırılmış protein (LN2) | Millipore | CC085 | |
Rekombinant sıçan siliyer nörotrofik faktör (CNTF) | PeproTech | 450-50 | |
L-tiroksin | BioChemika | 89430 | |
Holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T0665 | |
B27 takviyesi | Gibco | 0080085-SA | |
Sığır insülin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
3,3 ',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | I6634 | |
Progesteron | Sigma-Aldrich | P8783 | |
Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | |
Sodyum Selenit | Sigma-Aldrich | S5261 | |
5-Fluoro-2'-dezoksiuridin (FuDR) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
Papain çözüm | Worthington | LS003126 | |
DNaseI | ROCHE | 1010159001 | |
L-sistein | Sigma-Aldrich | C7352 | |
24-iyi doku kültürü yemekleri | Cellstar | 662-160 | |
Havalandırma kapağı ile T25-doku kültürü şişeleri | Corning | 430639 | |
10 cm doku kültürü yemekleri | Corning | 430167 | |
10 cm'lik petri | Fisher Scientific | 0875713 | |
Kollajenaz A | ROCHE | 103578 | |
CellTrics 50 mikron filtre (opsiyonel) | PARTEC | 04-004-2327 | |
Miyelin Temel Protein (MBP) Antikor | Abd Serotec | MCA409S | |
NG2 antikor | Millipore | AB5320 | |
Miyelin İlişkili Glikoprotein (MAG) antikor | Millipore | MAB1567 | |
2 ', 3'-Siklik nükleotid 3'-fosfodiesteraz (CNP) antikor | Covance | SMI-91R-100 | |
Aktin pan Ab-5 antikor | Fitzgerald | 10R-A106AX | |
Nörofilaman-200 (NF) antikor | Sigma-Aldrich | N4142 | |
Tubulin beta-3 zinciri (Tuj1) antikoru | Millipore | MAB5544 | |
Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG (H + L) sekonder antikoru | Invitrogen | A11008 | |
Alexa Fluor 555 keçi anti-fare IgG (H + L) sekonder antikoru | Invitrogen | A21422 | |
Alexa Fluor 647 keçi anti-sıçan (IgG) (H + L) sekonder antikoru | Invitrogen | A21247 | |
Keçi anti-fare IgG (H + L)-HRP konjuge sekonder antikor | BioRad | 170-6516 | |
Keçi anti-sıçan IgG (H + L)-HRP konjuge sekonder antikor | Santa Cruz Biyoteknoloji | SC-2065 | |
4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 |
Medya Tarifler
OL-100X Ek *
Bileşen | Eklenecek tutar |
DMEM | 100 mL |
BSA | 1.02 g |
Progesteron | 0.6 mg |
Putrescine | 161 mg |
Sodyum Selenit | 0.05 mg |
3,3 ',5-Triiodo-L-thyronine | 4 mg |
* Mağaza -80 ° C 250 mcL alikot
"t> OL medyaBileşen | Eklenecek tutar |
DMEM | 23.75 ml |
100X OL-Ek | 250 mcL |
Sığır insülin (1 mg / ml stok) | 125 mcL |
GlutaMAX | 250 mcL |
Holo-transferrin (33 mg / ml stok) | 37.5 mcL |
B27 Supplement | 500 mcL |
FBS | 125 mcL |
CNTF (50 mcL ng / stok) | 25 mcL |
Karışık glial kültür ortamı (DMEM içinde oluşur)
Bileşen | Final konsantrasyonu |
FBS | % 10 |
Pen / Strep (% 0.33 stok) | 33 adet / ml penisilin ve 33 mg / ml Streptomisin |
GlutaMAX | % 1 |
DRGN medya (DMEM içinde oluşan)
Bileşen | Final konsantrasyonu |
FBS | % 10 |
Pen / Strep (stok% 1) | 100 birim / ml penisilin ve 100 mg / ml Streptomisin |
Sindirim Çözüm Tarifler:
OPC papain solüsyonu (MEM yılında yapılan)
Bileşen | Final konsantrasyonu |
Papain çözüm | 1.54 mg / ml |
L-sistein | 360 mcg / mL |
DNaseI | 60 mcg / mL |
DRG papain solüsyonu (HBSS içinde oluşan)
Bileşen | Final konsantrasyonu |
Papain | 1.54 mg / ml |
L-sistein | 360 mcg / mL |
DRG kollajenaz (HBSS içinde yapılmış bir çözüm)
Bileşen | Final konsantrasyonu |
Kollajenaz A | 4 mg / ml |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır