Method Article
Este artigo descreve métodos para derivar populações enriquecidas de células precursoras de oligodendrócitos murino (OPCs) em cultura primária, que se diferenciam para produzir oligodendrócitos maduros (MQO). Além disso, este relatório descreve as técnicas para produzir murino myelinating co-culturas semeando OPCs do mouse sobre uma cama de neurite do mouse neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRGNs).
Identificar os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento OL não é apenas fundamental para ampliar nosso conhecimento da biologia OL, mas também tem implicações para a compreensão da patogênese de doenças desmielinizantes, como esclerose múltipla (MS). Desenvolvimento celular é comumente estudada com modelos de cultura primária da célula. Cultura de células primárias facilita a avaliação de um tipo de célula dada por fornecer um ambiente controlado, livre das variáveis externas que estão presentes in vivo. Enquanto culturas OL derivados de ratos têm proporcionado uma grande quantidade de insights sobre a biologia OL, esforços semelhantes ao estabelecimento de culturas OL de camundongos, foi recebido com grandes obstáculos. Desenvolvimento de métodos para a cultura murino OLS primário é imperativa, a fim de aproveitar as linhas disponíveis camundongo transgênico.
Vários métodos para a extração de OPCs a partir de tecido de roedores têm sido descritos, variando de derivação neurosphere, purificação de adesão diferencial e immunopurification 1-3. Embora muitos métodos oferecer maior sucesso, requerem tempos de cultivo extensivo e / ou equipamentos de alto custo / reagentes. Para contornar isso, purificando OPCs do tecido murino com uma adaptação do método originalmente descrito por McCarthy & de Vellis 2 é o preferido. Este método envolve fisicamente OPCs separação de uma cultura mista glial derivado de córtices roedores neonatal. O resultado é uma população purificada OPC que podem ser diferenciados em uma cultura OL-enriquecido. Esta abordagem é atraente devido ao seu tempo relativamente curto a cultura ea exigência desnecessária para fatores de crescimento ou anticorpos immunopanning.
Enquanto explora os mecanismos de desenvolvimento OL em uma cultura purificada é informativo, não proporcionar o ambiente mais fisiologicamente relevantes para a avaliação de mielina formação da bainha. Co-cultura de MQO com os neurônios emprestaria visão sobre as bases moleculares que regulam OL-mediada mielinização dos axônios. Para muitos OL / neurônio co-cultura estudos, os neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRGNs) provaram ser o tipo de neurônio de escolha. Eles são ideais para co-cultura com MQO, devido à sua facilidade de extração, quantidade mínima de células contaminantes, e formação de camas neurite denso. Enquanto estudos usando ratos / mouse myelinating xenocultures foram publicados 4-6, um método para a derivação de tais OL / DRGN myelinating co-culturas de pós-natal do tecido murino não tem sido descrita. Aqui apresentamos métodos detalhados sobre a forma de produzir tais culturas, juntamente com exemplos de resultados esperados. Estes métodos são úteis para tratar de questões relevantes para o desenvolvimento OL / função myelinating, e são ferramentas úteis no campo da neurociência.
Declaração de ética
Os ratos utilizados neste trabalho foram tratados de acordo com o Conselho Canadense on Animal Care (CCAC) orientações. Aprovação ética para experimentos realizados foi obtida a partir da Universidade de Ottawa Animal Care Comissão sob o protocolo número OGH-119.
1. Dissecção - córtex do rato neonatal para OPC extração
2. Dissociação dos córtices neonatal e manutenção de culturas mistas glial
Nota: A introdução de bolhas na suspensão de células devem ser evitados durante todas as etapas seguintes.
Nota: De acordo com trituração, resultará em má dissociação do tecido, enquanto que mais de trituração, terá um impacto negativo na viabilidade celular. É importante não introduzir bolhas na solução, pois isso irá afetar seriamente a viabilidade celular.
3. Isolamento DRGN
Nota: Para produzir OL / DRGNs co-culturas, DRGNs deve ser estabelecido o dia após geração cultura mista glial. Ambos os tipos de cultura são cultivadas de forma independente, e combinado após 90-10 dias.
Nota: Muitas células contaminando terá fortemente aderidas à placa de Petri, enriquecendo a sua suspensão de células para DRGNs.
4. Purificação de OPCs de culturas mistas glial para o estabelecimento de OL enriquecido culturas ou OL / DRGN co-culturas
5. Processamento de culturas para a microscopia de imunofluorescência
6. Extração de proteínas de células íntegras de OL enriquecido culturas
7. SDS-PAGE análise sobre enriqueceu-OL proteína cultura
8. Resultados representativos:
Neste protocolo, OPCs são expandidas em uma monocamada astrócitos dentro de uma cultura mista glial. Esta cultura mista glial é derivado de P0-P2 córtex do rato neonatal. No dia 1 in vitro (div1), a cultura mista glial contém células com morfologias diferentes como pode ser visto por microscopia de contraste de fase (Fig. 2a). No Div3, uma monocamada astrócitos começa a se formar na base do frasco, e ao DIV8, OPCs podem ser claramente observados na superfície monocamada. No DIV9, o OPCs proliferando atingiram densidade suficiente para ser purificada pela agitação em alta velocidade durante a noite orbital. Uma vez que o processo de purificação foi concluída, o resultado é uma população de células OPC-enriquecido. No div1 pós-purificação, OPCs têm morfologia simples, estendendo-se alguns processos (Fig. 2b). No Div3 purificação post, as células têm estendido uma malha complexa de processos, uma reminiscência de OLS imaturo. No DIV6 purificação post, o OLS purificada têm achatada e projetada folheto-como estruturas de membrana. Este desenvolvimento morfológico é típico da maturação in vitro de OLS.
Microscopia de imunofluorescência indica as células purificadas são de OL-linhagem (Fig. 3). Semeado OPCs inicialmente expressam sulfato de condroitina proteoglicanos (NG2), e se desenvolvem em mielina associados glicoproteína (MAG) positivo OLS imaturos dentro de três dias após a semeadura (Fig. 3b). No DIV6, muitos OLS expressam a proteína básica de mielina (MBP), e possuem a morfologia típica madura OL. Por cento OL-linhagem de células foram quantificadas em momentos diferentes para determinar a pureza das culturas OL-enriquecido (Fig. 3c). No div1 purificação post, as culturas são 50 ± 14% NG2 OPCs ve +, sem ve + MAG ou MBP + OLS ve. Isso indica que o OL-purificada linhagem de células estão em fase de precursor na época de semeadura, com números insignificantes de OLS diferenciadas. No Div3, OLS muitos diferenciados em células MAG + ve (24 ± 5,9%), enquanto alguns mantêm o fenótipo precursor, e permanecem NG2 + (13 ± 8,0%). No Div3, uma pequena proporção de células MAG + ve (3,2% 1.2) são também expressando MBP. No DIV6, 20 ± 5,9% do OLS são MAG + ve enquanto 12 ± 7,3% persistem como NG2 + OPCs ve. Além disso, 21 ± 9,3% de células dentro da cultura são MBP + OLS ve neste momento do tempo. SDS-PAGE análise mostra a expressão classificados de 2'3'-cíclica de nucleotídeo 3'-fosfodiesterase (CNP) e PAM durante o período de seis dias de cultura, demonstrando a capacidade de OPCs em cultura para se diferenciar em terminais OLS maduros (Fig. 3d ). Coletivamente, estes dados estabelece este método como um meio de produzir um sistema de cultura OL enriquecido adequado para o estudo da maturação de OPCs OL.
Este protocolo também descreve métodos para estabelecer OL / DRGN co-culturas que utilizam fontes de murino apenas o tecido. No entanto, a fim de produzir a co-cultura, DRGNs primeiro deve ser cultivado sozinho para produzir uma rede de neurite adequada. Estes pós-natal culturas de neurônios de camundongos são cultivadas por 9 dias em baixa media de soro com 10 mM FuDR suplementação para evitar a proliferação de fibroblastos e contaminando gl células ial. Ao longo de nove dias in vitro, DRGNs isolados produzem uma cama de neurite densa (Fig. 4). Esta cama é neurite imunopositivas para o neurofilamento marcadores neuronais 200 (NF) e Tuj1 (Fig. 4b). Neste ponto, OPCs purificada pode ser adicionado à cama neurite, e cultivadas por um período adicional de seis dias para produzir myelinating co-culturas.
No DIV6 de OL / DRGN co-cultura, MBP muitos + ve OLS pode ser observado entre as neurites NF + ve DRGN (Fig. 5). Após um exame mais detalhado, OLS são evidenciados para fazer contato com neurites DRGN numerosos, muitas vezes ensheathing-los com um MBP + ve membrana (Fig. 5b, c).
Figura 1. Dissecção imagens de microscópio de aspectos específicos do córtex do rato neonatal e isolamento DRG. (A) Vista dorsal de um cérebro de camundongo recém-extraídos neonatal. As linhas pontilhadas indicam a área onde as incisões devem ser feitas para facilitar a remoção da camada meníngea. (B) vista ventral do cérebro, linhas pontilhadas indicam a área onde o córtex encontra o diencéfalo ventral. Incisões profundas devem ser feitas ao longo das linhas pontilhadas para ajudar no isolamento do córtex. (C-c ') representação visual de como erguer o córtex longe do restante do cérebro. (D) Um recém-isoladas P5-P10 espinha do rato antes de aparar afastado muscular em excesso e osso (d '). (e) Localização de DRGs dentro da coluna vertebral. (f) O número aproximado de DRGs que deve ser isolado de um mouse. (g) A DRG com raízes longas que exigem corte antes da digestão enzimática. A linha pontilhada indica a região onde as raízes devem ser aparadas. (G ') DRG pós-raiz de corte.
Figura 2. OPCs são expandidas dentro de uma cultura mista glial, purificada e, posteriormente, como uma cultura diferenciada OL-enriquecido. (A) Fase imagens de contraste de culturas mista glial em diferentes estágios de desenvolvimento. No div1, as células aparecem rodada com poucas células achatadas. Estratificação da cultura mista glial começa em Div3, onde astrócitos formam uma monocamada uniforme na base do frasco, sobre a qual OPCs proliferar. OPCs muitos são vistos em DIV8 (setas) aderidos à superfície da monocamada de astrócitos. (B) Uma vez purificada a partir da cultura mista glial, div1 OPCs ter estendido apenas alguns processos. No Div3, as células têm estendido muitos processos, uma reminiscência de estágio intermediário OLS. No DIV6, OLS achatada (asterisco) parecem ter produzido folhas membranosas (linha pontilhada). Barras de escala, 50 mm.
Figura 3. Caracterização de OL enriquecido cultura. (A) imagens Confocal de OLS isoladas em diferentes estágios de desenvolvimento. NG2 + OPCs ve ter morfologia simples, enquanto OLS + ve MAG possuem vários processos arborizada. MBP + OLS ve ter estendido membranosa mielina como folhas. Barra de escala, 50 mm. (B) OL-purificada linhagem de células originam como OPCs e diferenciar em MAG + ve, MBP OLS + ve mais de 6 DIV. No div1, todos são OPCs NG2 + ve, enquanto nenhum é MAG ve + ou MBP + ve. No Div3, MAG + ve e MBP poucos OLS + ve são agora evidentes. A maioria dos MQO são MAG e MBP ve + na DIV6, com poucos remanescentes NG2 + OPCs ve. Barra de escala, 100 mm. (C) Os valores médios ± DP do percentual OL-linhagem de células em diferentes estágios de desenvolvimento mais de 6 DIV. No div1, todas as células OL-linhagem são NG2 + ve de contabilidade, por 50 ± 14% do total de células na cultura. No Div3 e DIV6, OL-linhagem de células, respectivamente responsáveis por 36 ± 6,8% e 32 ± 8,4% do total de células, que consiste em proporções variáveis de NG2 + ve, MAG + ve e MBP + OLS ve. (D) SDS-PAGE realizadas em proteínas derivadas de enriquecimento OL-culturas demonstrando a expressão classificados de OL-marcadores CNP e MBP durante o período de 6 a cultura DIV.
Figura 4. Caracterização da semeadura da cultura DRGN pré-OPC. (A) Fase imagens de contraste de DRGNs durante o período de 9 a cultura DIV pré-OPC semeadura. DRGNs originam como de grande porte células com poucos processos, e produzir uma rede de neurite cada vez mais complexas. Barra de escala, 100 mm. (B) imagens Confocal de culturas DRGN fixado em DIV9 (pré-semeadura OPC) e coradas para neurônio-específica e marcadores Tuj1 NF200. DRGNs produziram uma rede de neuritos em que OPCs podem ser semeados para produzir OL / DRGN myelinating co-culturas. Barra de escala, 50 mm.
Este relatório descreve um método para isolar OPCs murino para a diferenciação em culturas OL-enriquecido ou OL / DRGN co-culturas. Quando cultivadas por si só, o OPCs diferenciar em MBP + ve OLS, produzindo mielina como folhas membranosas. Quando adicionado ao DRGN camas neurite, OLS envolver o neurites DRGN com MBP + membrana ve. Este modelo beneficia a investigação dos fundamentos complexos que regem OL-mediada ensheathment axonal.
Embora de grande valor, o estabelecimento de tais culturas é um desafio técnico. Em particular, os aspectos exigentes incluem a digestão do tecido eficiente / dissociação, manutenção de pH equilibrado meios de cultura, e as mudanças DRGN mídia. É importante considerar que o comprimento da digestão, a quantidade de tecido a ser digerida e da quantidade de trituração afeta o resultado final da eficácia e da dissociação do tecido. Não é incomum para investigadores experientes para obter baixos rendimentos a partir de celulares dissociados tecidos do sistema nervoso. Além disso, OPCs murino tendem a ser sensíveis às mudanças no pH do meio de cultura, especialmente sob condições alcalinas. A manutenção de culturas em 8,5% CO 2 visa evitar isso, desde OPCs parecem tolerar melhor as condições mais básicas ligeiramente ácido. Com relação ao DRGNs alimentação, alterações de mídia deve ser realizada rapidamente para não desidratar os neurônios, no entanto, deve ser suave para não perturbar a cama neurite em desenvolvimento. Mudanças bruscas de mídia pode desalojar a cama neurite do substrato, e que resultam em sua dissociação completa da lamela.
O mérito potencial deste sistema modelo muito ofusca sua natureza tecnicamente exigente. Uma vantagem deste sistema é a utilização de ratos pós-natal para derivação de cultura de células, evitando a necessidade de sacrifício fêmeas reprodutoras para a colheita de tecido embrionário. Outra vantagem é a falta de exigência de fatores de crescimento (GFs) para a expansão da OPCs. Mistas culturas gliais proporcionar um ambiente que suporta a propagação de OPCs, provavelmente devido à presença de fatores de astrócitos derivados trófica. Outros métodos, como a derivação via neurospheres 7,8, invocar as propriedades mitogênica da FG, como fator básico de crescimento de fibroblastos (bFGF), fator de crescimento epidérmico (EGF) e das plaquetas fator de crescimento derivado (PDGF) para expansão da OPC. Da mesma forma, usando pós-natal (P5-10) para ratos DRGNs evita a necessidade de complementar os meios de cultura com fator de crescimento neural (NGF), um fator neurotrófico necessários para a sobrevivência in vitro de embriões DRGNs 9, 10. É de interesse para evitar o uso de NGF, uma vez que influencia negativamente a capacidade myelinating de OLS quando cultivadas com DRGNs 4. Evitando o uso de GF-suplementado mídia também tem benefícios econômicos, uma vez que estes reagentes tornar-se caro quando usado em larga escala.
Talvez o benefício mais importante deste modelo de cultura é sua derivação do rato-somente tecidos, proporcionando assim as oportunidades para derivar tanto OPCs e DRGNs da grande variedade de linhas de ratinhos transgénicos. Isto permite o estudo de ambos e DRGN / ou OPC propriedades específicas que regem a mielinização. Isto será especialmente importante para a elucidação das interações receptor / ligante regulação OL-mediada mielinização dos axônios. Ao todo, esta técnica é de grande valor com relação à pesquisa em neurociência, devido à suas aplicações para a compreensão dos sinais moleculares subjacentes mielinização.
Não há conflitos de interesse declarados.
Este projeto foi financiado por uma doação da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá para RKRWO é um receptor de um Studentship da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá. SDR é um receptor de Bolsas de Pós-Doutorado da Sociedade de Esclerose Múltipla do Canadá e Canadian Institutes of Health Research.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nome do produto | Companhia | Número de produtos | |
Modificado Dulbecco Eagle Medium (DMEM) | Multicélulas | 319-005-CL | |
Solução salina balanceada de Hank (HBSS) | Invitrogen | 14170-112 | |
Mínimo Essential Media (MEM) | GIBCO | 12360-038 | |
De soro fetal bovino (FBS) | GIBCO | 10091-148 | |
Penicilina-estreptomicina (Pen / Strep) | GIBCO | 15140-122 | |
Glutamax | Invitrogen | 35050-061 | |
Poli-l-lisina | Sigma-Aldrich | P2636 | |
Albumina de soro bovino (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503 | |
Humana merosina proteína purificada (LN2) | Millipore | CC085 | |
Recombinante rato fator neurotrófico ciliar (CNTF) | PeproTech | 450-50 | |
L-tiroxina | Biochemika | 89430 | |
Holo-transferrina | Sigma-Aldrich | T0665 | |
B27 suplemento | GIBCO | 0080085-SA | |
Insulina bovina | Sigma-Aldrich | I6634 | |
3,3 ',5-Triiodo-L-thyronine | Sigma-Aldrich | I6634 | |
Progesterona | Sigma-Aldrich | P8783 | |
Putrescina | Sigma-Aldrich | P7505 | |
Selenito de sódio | Sigma-Aldrich | S5261 | |
5-fluoro-2'-deoxiuridina (FuDR) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
Solução de papaína | Worthington | LS003126 | |
DNaseI | ROCHE | 1010159001 | |
L-cisteína | Sigma-Aldrich | C7352 | |
24 pratos bem a cultura de tecidos | Cellstar | 662-160 | |
Frascos T25 tecido-cultura com tampa da abertura | Corning | 430639 | |
10 centímetros cultura pratos tecido | Corning | 430167 | |
10 centímetros placa de Petri | Fisher Scientific | 0875713 | |
A colagenase | ROCHE | 103578 | |
CellTrics 50 mm filtro (opcional) | PARTEC | 04-004-2327 | |
Mielina Básico Protein (MBP) Antibody | AbD Serotec | MCA409S | |
NG2 anticorpos | Millipore | AB5320 | |
Mielina Associated Glicoproteína anticorpos (MAG) | Millipore | MAB1567 | |
2 ', 3'-cíclico-fosfodiesterase nucleotídeo 3'-anticorpos (CNP) | Covance | SMI-91R-100 | |
Actina pan-5 Ab de anticorpos | Fitzgerald | 10R-A106AX | |
Neurofilamento-200 de anticorpo (NF) | Sigma-Aldrich | N4142 | |
Beta-3 tubulina cadeia (Tuj1) de anticorpos | Millipore | MAB5544 | |
Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de coelho (H + L) anticorpo secundário | Invitrogen | A11008 | |
Alexa Fluor 555 cabra anti-camundongo IgG (H + L) anticorpo secundário | Invitrogen | A21422 | |
Alexa Fluor 647 cabra anti-rato (IgG) (H + L) anticorpo secundário | Invitrogen | A21247 | |
Cabra anti-camundongo IgG (H + L)-HRP conjugado anticorpo secundário | BioRad | 170-6516 | |
Cabra anti-IgG de rato (H + L)-HRP conjugados de anticorpos secundários | Santa Cruz Biotechnology | SC-2065 | |
4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 |
Receitas da mídia
OL-100X Suplemento *
Ingrediente | Quantidade para adicionar |
DMEM | 100 mL |
BSA | 1,02 g |
Progesterona | 0,6 mg |
Putrescina | 161 mg |
Selenito de sódio | 0,05 mg |
3,3 ',5-Triiodo-L-thyronine | 4 mg |
* Conservar a -80 ° C em 250 mL alíquotas
t "> mídias OLIngrediente | Quantidade para adicionar |
DMEM | 23,75 mL |
Suplemento OL-100X | 250 L |
Insulina bovina (de um estoque mg / mL) | 125 mL |
Glutamax | 250 L |
Holo-transferrina (de 33 ações mg / mL) | 37,5 mL |
B27 Suplemento | 500 mL |
FBS | 125 mL |
CNTF (de 50 ações ng / mL) | 25 mL |
Mista glial meios de cultura (confeccionados em DMEM)
Ingrediente | Concentração final |
FBS | 10% |
Pen / Strep (0,33% do estoque) | 33 unidades / ml de penicilina e estreptomicina 33 mg / mL |
Glutamax | 1% |
DRGN media (confeccionados em DMEM)
Ingrediente | Concentração final |
FBS | 10% |
Pen / Strep (1% do estoque) | 100 unidades / ml de penicilina e estreptomicina 100 mg / mL |
Solução Receitas digestão:
OPC papaína solução (composta em MEM)
Ingrediente | Concentração final |
Solução de papaína | 1,54 mg / mL |
L-cisteína | 360 mcg / mL |
DNaseI | 60 mcg / mL |
DRG papaína solução (composta em HBSS)
Ingrediente | Concentração final |
Papaína | 1,54 mg / mL |
L-cisteína | 360 mcg / mL |
DRG colagenase solução A (confeccionados em HBSS)
Ingrediente | Concentração final |
A colagenase | 4 mg / mL |
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