Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

وصفت وهناك تقنية للتحقيق في تقسيم مجموعة كبيرة من البروتينات الشحمية فلوري في الغشاء البلازمي للخلايا الحية. فإنه يستفيد من التفاوت في أوقات نشر من البروتينات الموجودة داخل أو خارج من الطوافات الدهنية. لا يمكن أن يؤديها اكتساب حيوي في ظروف سيطرة أو بعد إدمان المخدرات.

Abstract

في السنوات الخمس عشرة الماضية أصبحت فكرة أن أغشية الخلايا ليست متجانسة والاعتماد على microdomains لممارسة وظائفها بقبول واسع النطاق. الطوافات الدهنية هي microdomains غشاء المخصب في الكولسترول وsphingolipids. انها تلعب دورا في العمليات الفيزيولوجية الخلوية مثل الإشارات، و1،2 الاتجار لكن يعتقد أيضا أن يكون لاعب رئيسي في العديد من الأمراض بما في ذلك العدوى الفيروسية أو البكتيرية وأمراض الاعصاب 3.

بعد وجودها لا يزال مثار جدل 4،5. في الواقع، فقد قدر حجم الدهون طوف أن يكون حوالي 20 نانومتر 6، حتى في إطار الحد الأقصى من قرار المجهري التقليدية (حوالي 200 نانومتر)، مما حال دون التصوير المباشر. حتى الآن، وكانت التقنيات الرئيسية المستخدمة لتقييم قسم من البروتينات ذات الاهتمام داخل الطوافات الدهنية أغشية مقاومة للمنظفات (DRMS) العزلة وشارك في التصحيح، مع الأجسام المضادة. على الرغم من استخدامها على نطاق واسع بيكاوكانت هذه التقنيات استخدام تنفيذها سهل نوعا ما، عرضة لالمصنوعات اليدوية، وانتقد وبالتالي 7،8. وكانت التحسينات التقنية اللازمة لذلك للتغلب على هذه المصنوعات اليدوية، وتكون قادرة على تحقيق دهن الطوافات التقسيم في الخلايا الحية.

هنا نقدم طريقة لتحليل الحساسية من تقسيم الطوافات الدهنية من البروتينات fluorescently الموسومة أو الدهون في الغشاء البلازمي للخلايا الحية. هذا الأسلوب، ووصف الإسفار الارتباط الطيفي (FCS)، تعتمد على تفاوت في الأوقات نشر تحقيقات نيون الواقعة داخل أو خارج من الطوافات الدهنية. في الواقع، كما يتضح في كل من الأغشية الاصطناعية والثقافات الخلية، ونشر تحقيقات أسرع بكثير خارج من داخل الطوافات الدهنية الكثيفة 9،10. لتحديد الأوقات ونشرها، وتقاس التقلبات مضان دقيقة بوصفها وظيفة من الوقت في وحدة التنسيق (ما يقرب من 1 فيمتولتر)، التي تقع في الغشاء البلازمي للخلايا مع المجهر متحد البؤر (الشكل1). ويمكن بعد ذلك منحنيات لصناعة السيارات في ارتباط يمكن استخلاصها من هذه التقلبات ومزودة نماذج ملائمة لنشر الرياضية 11.

ويمكن استخدام FCS لتحديد مجموعة كبيرة من الدهون تقسيم تحقيقات مختلفة، طالما يتم تمييزها fluorescently هم. لا يمكن أن يتحقق عن طريق وضع علامات فلوري التعبير عن البروتينات الانصهار فلوري أو عن طريق الربط من يغاندس فلوري. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام FCS ليس فقط في الأغشية الاصطناعية وخطوط الخلية ولكن أيضا في الثقافات الأولية، كما هو موضح في الآونة الأخيرة 12. ويمكن أيضا استخدامه لمتابعة ديناميكية تقسيم طوف الدهون بعد إضافة عقار أو تغيير تكوين الغشاء الدهني 12.

Protocol

1. معايرة من إعداد FCS

  1. بدء مجهر متحد البؤر، وأشعة الليزر وأجهزة الكمبيوتر وحاضنة لدرجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون سيطرة 2.
  2. تأكد من أن SPAD (واحدة ديود أفالانش فوتون) هو في ومناسب تماما للمرشح مضان داخل SPAD إلى عينتك. تأكد من أن تتم مزامنة SPAD في الوقت المناسب. حذار أن تبدأ بك فقط FCS البرامج مرة واحدة الإعدادات SPAD على استعداد لشراء.
  3. يعد حل جديد من الكوليرا Alexa488-السم المخفف في برنامج تلفزيوني من أجل التوصل إلى تركيز من 1 ميكروغرام / لتر (17.5 مترا).
  4. تحسين التصوير مبائر من الحل باستخدام الكشف الداخلي للمجهر.
  5. التحول إلى النمط يشير المسح واختيار نقطة في العينة حل. تأكد مدة إضاءة الليزر طويلة بما فيه الكفاية لتنفيذ عمليات الاستحواذ الخاص FCS (> 5 دقائق).
  6. التحول إلى كشف خارجي من قبل SPAD والبرامج FCS. رصد إشارة مضان والتأكد من أنها على ما يرام سويتيد لSPAD (إشارة كافية ولكن لا تشبع، 10 000 000 50 اتهاما / ثانية على ما يرام). إذا لزم الأمر، تعديل موقف Z، وزيادة و / أو قوة الليزر لتحقيق إشارة مضان الصحيح.
  7. الحصول على 10 مجموعات من القياسات 30 ثانية. وينبغي أن يكون الأمثل لاكتساب الوقت عينتك (وسطا بين أفضل لأخذ العينات والمشاكل photobleaching).
  8. تحليل البيانات الخاصة بك (راجع الخطوة 4) لضمان أن يكون لديك منحنى لصناعة السيارات في ارتباط المقابلة لنوع واحد فلوري نشرها في حل (المعادلة في الشكل 2)، وذلك في الوقت المناسب تم الحصول عليها بعد نشر هو الصحيح (ما يقرب من 0،2 مللي) (الشكل رقم 3).

2. تلطيخ الخلايا الحية مع ماركر الطوافات الدهن

  1. لوحة HEK293 الخلايا في 8 جيدا Labteks المغلفة مع البولي-L-يسين (1mg/ml) قبل يوم من التصوير للتأكد من أن الالتصاق بهم هو الصحيح. استخدام وسيط وبدون الفينول الحمراء لضمان عدم وجود اضطراب في إشارة مضان.
  2. غسل الخلايا مرتين مع HBSS (محلول هانك في سولت التخزين المؤقت).
  3. إضافة بكتيريا الكوليرا، Alexa488 (1 ميكروغرام / مل) / جيش صرب البوسنة (0،1٪) في 500 HBSS ميكروليتر إلى الخلايا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وبكتيريا الكوليرا ربط GM1 غانغليوزيد، من المعروف أن تقسيم تفضيلي في الطوافات الدهنية.
  4. غسل الخلايا مرتين مع HBSS (محلول هانك في سولت التخزين المؤقت).

3. FCS الحصول على البيانات في الخلايا الحية

  1. وضع الخلايا الملون على المسرح المجهر. جعل درجة الحرارة والتأكد CO 2 الشروط هي المثلى وإلا فإن هذا قد يؤدي إلى القطع الأثرية في أوقات نشر.
  2. تحسين التصوير مبائر خلية ذات الاهتمام باستخدام الكشف الداخلي للمجهر (الشكل 4).
  3. التحول إلى النمط يشير المسح واختيار نقطة في الغشاء البلازمي للخلية من الفائدة. نفذ 1-2 الصور الحية للخلية للتأكد من أن الخلية لا تتحرك خلال اكتساب.
  4. التحول إلى كشف خارجي من قبل SPAD وإلى السفح لينةوير. رصد إشارة مضان، وتأكد من انها مناسبة تماما لSPAD (إشارة كافية ولكن لا تشبع، 10 000 000 50 اتهاما / ثانية على ما يرام). إذا لزم الأمر، تعديل موقف Z، وزيادة و / أو قوة الليزر لتحقيق إشارة مضان الصحيح. إذا كان هذا لا يكفي، قد تفكر في تغيير الظروف تلطيخ.
  5. الحصول على 10 عينات من القياسات 30 ثانية. حيث أن معظم الخلايا لصناعة السيارات في فلوري، قد ترى انخفاضا في مضان خلال عمليات الاستحواذ الأولى، نظرا لصناعة السيارات في مضان يتلاشى.

4. FCS تحليل البيانات

  1. تعيين الفاصل الزمني الارتباط وتولد لصناعة السيارات في ارتباط مع منحنيات البرنامج FCS. والفاصل الزمني للارتباط تتراوح عادة من الفارق الزمني أقصر لحل يصل إلى أطول وقت ممكن (كما إحصائيات وقياس يصبح أكثر وأكثر كفاية عندما أقصى وقت ارتباط يقترب مجموع وقت الشراء، ويقتصر في الوقت تأخر الحد الأقصى إلى 80٪ من الوقت على اكتساب PicoquaNT البرامج).
  2. لكل عينة، تصدير ملفات المقابلة لتقلبات مضان والسيارات ارتباط، بوصفها وظيفة من الزمن.
  3. استخدام تحليل البيانات والبرمجيات تركيب مثل الأصل الموالية لاستيراد ملفات.
  4. لكل عينة، تأكد من عدم وجود photobleaching خلال اكتساب أي مضان تبقى مستقرة خلال 30 ثانية. تجاهل أي تدبير عرض photobleaching، فقد يؤدي هذا الاصطناعي مرات أطول نشر.
  5. التحقق من أن شكل منحنيات FCS المتبقي هو الصحيح (انظر الشكل 5). تحديد منحنى FCS المتوسط.
  6. تناسب منحنى مع نموذج رياضي مناسب (الشكل 2). وهذه مناسبة تعطيك وقت نشر (ق) ونسبة الجزيئات نشرها مع هذا الوقت نشر (جنوب شرقي) (ق).

5. ممثل النتائج

ويرد مثال لمعايرة FCS مع حل توكسين-Alexa488 الكوليرا في الشكل (3) قوي. بعد التحقق من أن التدابير الفردية من مضان بوصفها وظيفة من الوقت لم تظهر أي photobleaching (الشكل 3A)، الفردية ويعني منحنيات FCS حسبت. تم تركيب يعني منحنيات FCS مع المعادلات المقابلة لنشر نماذج مختلفة (الأمثلة في الشكل 2). المعلمة تعتبر تقليديا لتحديد نوعية نوبة هو معامل التحديد R 2. أقرب آر 2 هو 1، وعلى نحو أفضل مناسبا. في هذه الحالة، فإن النموذج الأكثر دقة لتناسب منحنى FCS يعني هو واحد يصف سكان الجزيئات فلوري نشرها بحرية في ثلاثة أبعاد (معادلة 1 في الشكل 2 والشكل 3B). الوقت نشر المستمدة من مناسبة هو 0.32 مللي. بقايا من تركيب منحنى (الشكل 3C) وR 2 عامل (0.99906) اعطاء تقدير نوعية مناسبة.

مثال على تحليل FCS لالملون توكسين-Alexa488 الكوليرا HEK2ويظهر 93 الخلايا في الشكل 5. والمتعدد المراحل منحنى FCS شكل يعني يكشف عن وجود السكان من جزيئات الفلورسنت مع انتشار مختلف الأوقات. الأنسب لهذا المنحنى يتوافق مع نموذج مع ثلاثة من سكان تحقيقات فلوري: اثنان مع نشر أعاقت (نشر في بعدين كما هو الحال في طائرة غشاء) ونشرها بحرية في ثلاثة أبعاد (المعادلة 2 في الشكل 2 والشكل 5) . هذه الفئة من السكان الأخير يتوافق مع جزيئات نيون تتحرك خارج الطائرة غشاء، أي إما ملزمة أو غير ملزمة لأهداف غشاء بهم، والوصول إلى غشاء من خلال مسار إفراز أو إعادة التدوير، أو ترك غشاء بواسطة الإلتقام. وكان العصر نشر اثنين في غشاء، الموافق توكسين الكوليرا بد أن GM1، 2 مللي ثانية (25٪ من الجزيئات)، المقابلة لنشر خارج من الطوافات الدهنية، و 75 مللي ثانية (50٪ من الجزيئات)، المقابلة للنشر في الطوافات الدهنية . يرجى ملاحظة أن أي photobleachوسوف جى خلال اكتساب يؤدي إلى الاصطناعي مرات أطول وبالتالي خلق نشر ربما وجود تحيز نحو توطين GM1 في المجالات طوف الدهون.

figure-protocol-7462
الشكل 1. تمثيل تخطيطي لFCS مجموعة المتابعة (صورة معدلة من Marquer وآخرون. 12)

figure-protocol-7919
الشكل 2. مثال على نماذج الانتشار والمعادلات المناظرة المستخدمة لتناسب منحنيات الارتباط الذاتي. يمكن كتابة المعلمة هيكل S كما = S ض 0 / ث 0 مع ض 0 نصف قطرها التنسيق الفعال على طول المحور البصري في 1/2 ه وكثافة W0 في لوس انجليس فعالتنسيق دائرة نصف قطرها teral في شدة 2 1 / ه. ويمكن استخراج هذه القيم من انتشار نقطة قياس الكلاسيكية (PSF) وظيفة.

figure-protocol-8471
الشكل 3. تقييم من وقت انتشار الكوليرا Alexa488-السم في حل للمعايرة FCS. أ) تقلب الإسفار بوصفها وظيفة من الوقت لمثل ممثل لشراء 30 ثانية. ب) متوسط ​​منحنى الارتباط الذاتي التي تم الحصول عليها من 10 عينات من اكتساب 30 ثانية مزودة معادلة 1 (انظر الشكل 2). C) البواقي من منحنى المناسب.

figure-protocol-8909
الشكل 4. كلوة الجنين البشري-293 خلية ملطخة الكوليرا Alexa488-السم. تم تصوير الخلايا على مجهر متحد البؤر SP5 (لايكا مايكروسيستمز، يتزلا، ألمانيا) مع خط الليزر 488nm الداخلية. وقد تم جمع مضان مع خطة لامزيغ X60 الهدف غمر النفط ما بين 500و 650 نانومتر.

figure-protocol-9313
الشكل 5. تقييم من وقت انتشار بكتيريا الكوليرا، Alexa488 في غشاء البلازما من HEK293 الخلايا. أ) متوسط ​​منحنى الارتباط الذاتي مزودة معادلة 2 (انظر الشكل 2). B) البواقي من منحنى المناسب. (معدلة من Marquer وآخرون. 12)

Discussion

طريقة FCS المقدمة هنا يمكن تحليل الحساسة والسريعة للدهن تقسيم مجموعة من المجسات فلوري من الاهتمام في الخلايا الحية. FCS يجمع بين دقة الترجمة من متحد البؤر المجهري مع حساسية العد فوتون واحد. والفرق الرئيسي بين السفح والتقنيات الحيوية هو معيار أن FCS تمكن من تحديد المطلقة ?...

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل عن طريق منحة من الوكالة الوطنية للبحوث دي لا (ChoAD). ونحن أيضا ممتنون لمؤسسة اي سي ام (معهد دو Cerveau آخرون دي لا Moelle) لما قدموه من دعم مالي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
اسم كاشف شركة فهرس العدد تعليقات
الكوليرا الوحيدات توكسين B-488 اليكسا إينفيتروجن C-34775 MW (مخموس) = 57 كجم / مول
متحد البؤر المجهر لايكا SP5
حاضنة للتحكم في درجة الحرارة وثاني أكسيد الكربون 2 حياة التصوير الخدمات المكعب والمربع
SPAD (واحدة ديود أفالانش فوتون) MPD (مايكرو الأجهزة فوتون) الحركة الشعبية الديمقراطية الدوري الايطالي (100 ميكرون المنطقة الحساسة)
ارتفاع مرور 488 نانومتر فلتر Semrock 488 نانومتر حجب حافة BrightLine طويلة تمر فلتر
جزء #ails.aspx؟ ID = FF01-488/LP-25 "الهدف =" _blank "> FF01-488/LP-25
FCS الكشف عن وحدة Picoquant Picoharp 300 وحدة
اقتناء والبرامج لصناعة السيارات في ارتباط Picoquant SymPhoTime
تركيب البرمجيات OriginLab OriginPro8

References

  1. Brown, D. A., London, E. Functions of lipid rafts in biological membranes. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14, 111-136 (1998).
  2. Simons, K., Gerl, M. J. Revitalizing membrane rafts: new tools and insights. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 688-699 (2010).
  3. Simons, K., Ehehalt, R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J. Clin. Invest. 110, 597-603 (2002).
  4. Munro, S. Lipid rafts: elusive or illusive. Cell. , 115-377 (2003).
  5. Shaw, A. S. Lipid rafts: now you see them, now you don't. Nat. Immunol. 7, 1139-1142 (2006).
  6. Pralle, A., Keller, P., Florin, E. L., Simons, K., Horber, J. K. Sphingolipid-cholesterol rafts diffuse as small entities in the plasma membrane of mammalian cells. J. Cell Biol. 148, 997-1008 (2000).
  7. Brown, D. A., London, E. Structure and function of sphingolipid- and cholesterol-rich membrane rafts. J. Biol Chem. 275, 17221-17224 (2000).
  8. Sharma, P., Sabharanjak, S., Mayor, S. Endocytosis of lipid rafts: an identity crisis. Semin. Cell Dev. Biol. 13, 205-214 (2002).
  9. Kahya, N., Scherfeld, D., Bacia, K., Poolman, B., Schwille, P. Probing lipid mobility of raft-exhibiting model membranes by fluorescence correlation spectroscopy. J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).
  10. Bacia, K., Scherfeld, D., Kahya, N., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy relates rafts in model and native membranes. Biophys J. 87, 1034-1043 (2004).
  11. Kim, S. A., Heinze, K. G., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in living cells. Nat. Methods. 4, 963-973 (2007).
  12. Marquer, C. Local cholesterol increase triggers amyloid precursor protein-Bace1 clustering in lipid rafts and rapid endocytosis. FASEB J. 25, 1295-1305 (2011).
  13. Tian, Y., Martinez, M. M., Pappas, D. Fluorescence correlation spectroscopy: a review of biochemical and microfluidic applications. Appl. Spectrosc. 65, 115A-124A (2011).
  14. Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 36, 151-169 (2007).
  15. Ilien, B. Pirenzepine promotes the dimerization of muscarinic M1 receptors through a three-step binding process. J. Biol. Chem. 284, 19533-19543 (2009).
  16. Lieto, A. M., Cush, R. C., Thompson, N. L. Ligand-receptor kinetics measured by total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Biophys. J. 85, 3294-3302 (2003).
  17. Thompson, N. L., Burghardt, T. P., Axelrod, D. Measuring surface dynamics of biomolecules by total internal reflection fluorescence with photobleaching recovery or correlation spectroscopy. Biophys. J. 33, 435-454 (1981).
  18. Thompson, N. L., Steele, B. L. Total internal reflection with fluorescence correlation spectroscopy. Nat. Protoc. 2, 878-890 (2007).
  19. Eggeling, C. Direct observation of the nanoscale dynamics of membrane lipids in a living cell. Nature. 457, 1159-1162 (2009).
  20. Kolin, D. L., Wiseman, P. W. Advances in image correlation spectroscopy: measuring number densities, aggregation states, and dynamics of fluorescently labeled macromolecules in cells. Cell Biochem. Biophys. 49, 141-164 (2007).
  21. Shvartsman, D. E., Kotler, M., Tall, R. D., Roth, M. G., Henis, Y. I. Differently anchored influenza hemagglutinin mutants display distinct interaction dynamics with mutual rafts. J. Cell Biol. 163, 879-888 (2003).
  22. White, R. Holin triggering in real time. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 798-803 (2011).
  23. Petersen, N. O., Hoddelius, P. L., Wiseman, P. W., Seger, O., Magnusson, K. E. Quantitation of membrane receptor distributions by image correlation spectroscopy: concept and application. Biophys. J. 65, 1135-1146 (1993).
  24. Hebert, B., Costantino, S., Wiseman, P. W. Spatiotemporal image correlation spectroscopy (STICS) theory, verification, and application to protein velocity mapping in living CHO cells. Biophys. J. 88, 3601-3614 (2005).
  25. Digman, M. A. Measuring fast dynamics in solutions and cells with a laser scanning microscope. Biophys. J. 89, 1317-1327 (2005).
  26. Digman, M. A. Fluctuation correlation spectroscopy with a laser-scanning microscope: exploiting the hidden time structure. Biophys. J. 88, L33-L36 (2005).
  27. Nohe, A., Keating, E., Fivaz, M., van der Goot, F. G., Petersen, N. O. Dynamics of GPI-anchored proteins on the surface of living cells. Nanomedicine. 2, 1-7 (2006).
  28. Semrau, S., Schmidt, T. Particle image correlation spectroscopy (PICS): retrieving nanometer-scale correlations from high-density single-molecule position data. Biophys. J. 92, 613-621 (2007).
  29. Bates, I. R. Membrane lateral diffusion and capture of CFTR within transient confinement zones. Biophys. J. 91, 1046-1058 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

62

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved