قياس ضغط البطين الأيسر في وقت متأخر من الفئران الجنينية وحديثي الولادة

Summary

يوصف قياس ضغط البطين الأيسر (LV) في الفئران الجنينية وحديثي الولادة. ويتم قياس الضغط عن طريق إدخال إبرة متصلة بجهاز محول مملوءة بسائل في LV تحت توجيه الموجات فوق الصوتية. يجب توخي الحذر للحفاظ على وظيفة القلب الطبيعي خلال بروتوكول تجريبي.

Abstract

ضغط الدم يزيد بشكل كبير خلال التطور الجنيني وبعد الولادة في الحيوانات الفقارية. في الماوس، وتدفق الدم للكشف الأولى حول يوم الجنينية (E) 8.5 ^1. الانقباضي البطين الأيسر (LV) الضغط هو 2 مم زئبق في E9.5 و 11 مم زئبق في E14.5 ^2. في هذه المراحل منتصف الجنينية، والوقف غير واضحة للعيان من خلال جدار الصدر لقياس ضغط الغازية لأنه لم يتم الأضلاع والجلد وضعت تماما. يجب أن بين E14.5 والولادة (E21 تقريبا) يمكن استخدام أساليب التصوير لعرض LV. بعد الولادة، يعني زيادة الضغط الشرياني 30 حتي 70 مم زئبق من يوم بعد الولادة (P) 2 - 35 ^3. وراء P20، يمكن قياس الضغط الشرياني مع الحالة الصلبة القسطرة (أي ميلر أو Scisense). يجب أن تقاس قبل P20، وهذه القسطرة هي كبيرة جدا لتطوير الشرايين الماوس والضغط الشرياني مع العرف سحب القسطرة من البلاستيك تعلق على محولات ضغط السائل مملوءة ³ أو زجاج ATT بال micropipettesآلم إلى مضاعفات محولات الضغط باطل ^4.

وقد أظهرت عملنا مؤخرا أن أكبر زيادة في ضغط الدم يحدث أثناء الجنينية في وقت متأخر لفترة ما بعد الولادة في وقت مبكر من الفئران ^5-7. قد يكون هذا زيادة كبيرة في ضغط الدم تؤثر على العضلات الملساء الخلية (SMC) النمط الظاهري في الشرايين النامية، وتؤدي إلى أحداث mechanotransduction مهم. في الأمراض التي تصيب البشر، حيث يتم المساس الخواص الميكانيكية للشرايين النامية عن عيوب في البروتينات المصفوفة خارج الخلية (متلازمة أي مارفان ⁽⁸⁾ والتضيق فوق الصمام الأبهري ⁹⁾ يجوز للتغيرات السريعة في ضغط الدم خلال هذه الفترة يسهم في النمط الظاهري المرض وشدة من خلال تعديلات في mechanotransduction الإشارات. ولذلك، فمن المهم أن تكون قادرا على قياس التغيرات في ضغط الدم خلال فترات الجنينية في وقت متأخر وحديثي الولادة في نماذج الماوس من الأمراض التي تصيب البشر.

ونحن تصف طريقة لقياس الضغط المنخفض في أواخرالجنينية (E18) في وقت مبكر وبعد الولادة (P1 - 20) الفئران. يتم إدخال إبرة تعلق على تحويل طاقة الضغط مملوءة بسائل في LV تحت توجيه الموجات فوق الصوتية. والحرص على الحفاظ على وظيفة القلب الطبيعي خلال بروتوكول تجريبي، وخاصة بالنسبة للفئران جنينية. يتم تقديم بيانات تمثيلية وتناقش قيود البروتوكول.

Protocol

1. الموجات فوق الصوتية ونظام الضغط

1. بدء تشغيل نظام الموجات فوق الصوتية وفقا للتعليمات الشركات المصنعة (VEVO 770، Visualsonics). شغل التحقيق المناسب (سن E18 - P7 = نموذج 708، عمر> P7 = نموذج 707B) مع الماء المقطر والاتصال إلى نظام الموجات فوق الصوتية. تضع لجنة التحقيق في موقف قابل للتعديل في اتجاه تقريبي اللازمة للحصول على فترة طويلة محور LV العرض للحصول على الفأر التي شنت على منصة التصوير بحيث يتم أشار قمة LV نحو الذراع حقن.
2. نظام الضغط تتكون من محول الضغط مملوءة بسائل، مكبر للصوت الجسر، وبيانات نظام حيازة وتسجيل البيانات والبرمجيات (LabChart). الاتصالات تتألف من ثلاثة في اتجاه والصمامات والأنابيب، وأقفال luer وانتقادات لاذعة خرطوم. يتم تعبئة حقنة مل 20 مع المالحة heparinized 10٪ للبيغ في نهاية واحدة. على الطرف الآخر يتصل إبرة ويتم تعديل هيئة حقنة 3 مل لاستخدامها في غلاف لعقد أنابيب إبرة حقن في الذراع (الشكل 1).
نظام تحويل طاقة الضغط مع مقياس ضغط الدم.
3. تركيب الانابيب والغلاف إبرة في الذراع حقن للنظام الموجات فوق الصوتية. تضييق على تحويل طاقة الضغط في موقف حلقة في ذروة التقريبي للمنصة التصوير. نعلق إبرة مناسبة لعصر من الفأرة (سن E18 - P3 = 30G، عمر> P3 = 25G) إلى أنابيب إبرة. أصغر الإبر حصول انسداد أسهل، وأكثر صعوبة للمضي قدما من خلال جدار الصدر، ويكون لها الوقت أبطأ استجابة. وبالتالي، يتم استخدام حجم أكبر إبرة التي تناسبها في لمعة LV لكل سن.
4. وضع كومة من هلام الموجات فوق الصوتية على منصة التصوير وصفها بدقة تصل لجنة التحقيق باستخدام موقف قابل للتعديل بحيث يمكن تقدمت إبرة مباشرة في جل تحت مركز التحقيق والتصوير (الشكل 2). يجب أن يكون كافيا إبرة أقل بكثير من التحقيق ليست ثقب غطاء التحقيق، ولكن قريبة بما فيه الكفاية لتكون داخل عمق تحقيق التنسيق. إذا لزم الأمر، قد تكون عازمة الإبرة باليد بحيث يظل في اله طائرة الصحيح طوال رحلتها.
5. الحفاظ على التوافق، التراجع عن إبرة ورفع مسبار التصوير لوضع الماوس على منصة التصوير. مسح إبرة للقضاء على أي هلام يمكن أن تكون قد دخلت طرف.

2. الماوس إعداد

1. وقد تمت الموافقة على جميع الطرق المبينة في هذا البروتوكول من قبل رعاية الحيوانات المؤسسية واللجنة الاستخدام. تخدير الأم الحامل توقيت (E18) أو الماوس حديثي الولادة (P1 - 20) عن طريق الاستنشاق المستمر من 1.5٪ isoflurane. يمكن إدراج الأنابيب في مخروط الأنف القياسية لاستيعاب رأس صغير من الماوس 1 حديثي الولادة في وقت مبكر (P1 - 15).
2. تأمين الماوس إلى منصة التصوير للنظام الموجات فوق الصوتية في وضع استلقاء ظهري مع قمة LV مشيرا نحو الذراع حقن. بالنسبة للأمهات الحوامل، وتطبيق الموجات فوق الصوتية هلام لرصد معدل ضربات القلب مع كاشف ECG المرفقة وإدراج مقياس الحرارة المستقيمي للسيطرة على ردود فعل من درجة حرارة الجسم. الفئران حديثي الولادة هي و صغيرة جداأو للكشف عن هؤلاء، حتى يتم رصد معدل ضربات القلب خلال قياسات الضغط والحفاظ على درجة حرارة الجسم عن طريق مصباح الحرارة الخارجية.
3. إزالة الشعر من بطن الأم الحامل أو الصدر من الفأر الشاب مع كريم مزيل الشعر. الفئران حديثي الولادة (P1 - 10) لا تتطلب أي إزالة الشعر.
4. بالنسبة للأمهات الحوامل، وخفض فتح البطن باستخدام مقص تشريح وملقط المنحني. تخريج قرن واحد الرحم ومكان على شاش مبلل مع محلول ملحي دافئ. تلاعب بعناية الجنين في وضع مناسب للحصول على رأي القص محور طويل من الوقف باستخدام مسبار الموجات فوق الصوتية. قياس الضغط في جميع الأجنة في هذا الجانب قبل خارجيا القرن غيرها من الرحم. منع جميع الأجنة والبطن للأم رطب مع إضافة دورية من المياه المالحة الدافئة.

3. قياس الضغط

1. prewarmed مكان، degassed هلام الموجات فوق الصوتية على الماوس الجنينية أو حديثي الولادة. الوليد الفئران التي لم تكن دوينبغي أن يكون epilated كمية صغيرة من هلام الموجات فوق الصوتية يفرك على صدورهم قبل تطبيق هلام الموجات فوق الصوتية المتبقية لتعزيز الترابط. خفض مسبار التصوير وضبط زاوية التصوير منصة للحصول على أفضل القص LV رأي محور طويل. لا تعديل زاوية من لجنة التحقيق لأن ستفقد محاذاة إبرة.
2. في حين رصد صورة LV على الشاشة الموجات فوق الصوتية، تقدم ببطء والإبر فيه حتى بالقرب من الجزء السفلي من لجنة التحقيق. ضبط موضع إبرة والتحقيق، إذا اقتضت الضرورة، لتصحيح التحولات المحاذاة. مسح برفق مع إبرة المالحة. بدء تسجيل بيانات الضغط وصفر للمحول الضغط مع برنامج LabChart. ومحول الانجرافات مع درجة الحرارة وموقف، لذلك فمن المهم أن الصفر هو فقط قبل قياس الضغط في كل فأر.
3. تقدم ببطء الإبرة حتى يمكن أن ينظر إليه على حافة صورة الموجات فوق الصوتية، ولكن ليس بعد في LV. ضبط موضع الإبرة، وإذا لزم الأمر، للدخول إلى الوقف فيقمة. ضبط موضع التحقيق، إذا اقتضت الضرورة، للحفاظ على صورة واضحة عن إبرة. دفع الإبرة في التجويف LV (الشكل 3)، في حين أن تسجيل بيانات الضغط ورصد موقع إبرة على صورة الموجات فوق الصوتية. بداية التسجيلات نابض من محول الضغط يؤكد موقع داخل التجويف LV (الشكل 4).
4. إذا كانت إبرة ويبدو أن في لمعة والوقف، ولكن تسجيلات الضغط ليست نابض، دافق مع الاستفادة من الضوء على الغواص حقنة، حتى مجرد الكشف عن زيادة الضغط (حوالي 5-10 حجم ميكرولتر). وهذا ينبغي أن مسح أية السدادات التي يمكن أن تحول دون قراءة دقيقة. إذا قراءات ضغط لا تزال غير نابض، قد يكون إبرة فوق أو تحت الطائرة الصحيح وعدم إدراجها في التجويف LV. سحب الإبرة، مع تدفق المياه المالحة، والتقدم مرة أخرى. إذا لا تزال القراءات نابض لم يحصل، والانتقال إلى الماوس المقبل. استخدام إبرة جديدة لكل فأر.
5. ويمكن الحصول على قراءات ضغط ناجح من 75٪ منحاول الفئران الجنينية وحديثي الولادة. وينبغي أن تأخذ قراءات 5 - لا ينبغي أن كل 10 دقيقة والبيانات ضغط للحصول على الفأر أن تدرج إذا كان معدل ضربات القلب تختلف اختلافا كبيرا مما هو متوقع (الشكل 5A). معدل ضربات القلب لديه تأثير كبير على التدابير القلب والأوعية الدموية ومعدل ضربات القلب المتغيرة تدل على ضيق في القلب. الضائقة الجنينية وعادة ما يحدث 1-1،5 بعد ساعات من تخريج الأول من الرحم، وسرعة ذلك أمر مهم لقياس الضغوط في القمامة كله.

4. ممثل النتائج

جميع النتائج المعروضة هي للفئران C57BL6J. صورة عن إبرة في لمعة LV للماوس في P1 هو مبين في الشكل (3). الإبرة من الضروري ثقب جدار الصدر والوصول إلى تجويف LV صغيرة، لكنها تزيد بدرجة كبيرة من زمن الاستجابة للنظام الضغط. عندما يتم تطبيق يدويا بزيادة الخطوة التقريبية في الضغط على النظام، والوقت للوصول إلى 67٪ من الضغط الأقصى هو 0،067 SEج مع الأنابيب فقط (الأكثر دلالة على الأرجح في الوقت الحقيقي لتطبيق خطوة الضغط)، 0.105 ثانية بإبرة G 25 و ثانية 0،529 بإبرة G 30. ويمكن رؤية هذا التأخير في التوصل إلى أقصى قدر من الضغط في اقتفاء أثر الكامل هو مبين في الشكل 4A و 4C. على الرغم من أن وقت الاستجابة أبطأ مع إبرة 30G، يتم التقاط أفضل الموجي في المراحل الجنينية وحديثي الولادة في وقت مبكر، لأنه يزيد من معدل ضربات القلب مع التقدم في السن في الفئران ^5. على الرغم من هذا القيد، يمكن حساب الضغط الانقباضي على افتراض أن الوقف صحيح الانبساطي (الحد الأدنى) الضغط هو صفر، وضغط الدم الانقباضي LV (كحد أقصى) هو ضعفي الضغط المنخفض يعني تحديد من قراءات في حالة مستقرة (الشكل 4B و 4D ) ^6. ويفترض عموما أن LV الانقباضي والضغط الشرياني متساوون. وسيتم عرض قياس معدل ضربات القلب وضغط محسوب LV لمختلف الأعمار بين E18 و P14 في الشكل 5.

الشكل 1. صورة من محول الضغط مع الصمامات الثلاثية المرفقة، الذكور (M) والإناث تأمين اتصالات luer (F)، انتقادات لاذعة خرطوم، أنابيب، والمحاقن والإبر.

الشكل 2. صورة من. تشكيل لمحاذاة الإبرة مع التحقيق والتصوير (A) منصة التصوير هو تناوب بحيث قمة LV من الفأرة يواجه الذراع حقن. هي التي شنت لجنة التحقيق في موقف قابل للتعديل في اتجاه التقريبية اللازمة للحصول على فترة طويلة محور LV صورة. هي التي شنت الغلاف أنابيب إبرة حقن في الذراع. وتقدمت إبرة في كومة من هلام الموجات فوق الصوتية على منصة التصوير لتحديد الزاوية المناسبة وموقف الرأسي والأفقي فيما يتعلق مسبار التصوير (B).

الشكل 3. تقدم صورة من الإبرة (N) من خلال جدار الصدر (CW) وفي التجويف LV في ماوس P1. شريط الحجم = 0.1 ملم.

الشكل 4. قراءات ضغط مثال نابض مثل إبرة يدخل LV من E18 (أ) و P14 (C) الماوس. هناك تأخير في التوصل الى حالة مستقرة بسبب الوقت استجابة النظام مع إبرة المرفقة. وترد وجهات النظر التكبير من القراءات في حالة مستقرة في B و D. لاحظ أن الحد الأدنى E18 الضغوط LV هي قريبة من الصفر، ولكن لا يمكن الموجي كامل من الصفر إلى أقصى قدر من الضغط يتم تسجيلها في ارتفاع معدل ضربات القلب من P14 الفئران. ويتم قياس الضغوط يعني من القراءات حالة مستقرة ويفترض أن LV الضغط الانقباضي = 2 × تقاس يعني الضغط.

الشكل 5 قياس معدل ضربات القلب (A) ومحسوب الانقباضي الضغوط LV (B) لE18 - P14 الفئران. N = 7 لمدة 5، E18 لP1، (22) لP3، 23 و 16 لP7 عن P14 ^5-7.

Discussion

بروتوكول المقدمة هنا يوفر طريقة لقياس الضغط المنخفض في أواخر الجنينية والفئران حديثي الولادة في وقت مبكر. القيد الرئيسي من هذا البروتوكول هو القرار الزمني للنظام الضغط. وثبط إشارة ضغط لأنها تنتقل من الوقف من خلال إبرة في محول، ويعني فقط يمكن تسجيل قيم الضغط. يمكن تصغ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف / معدات	شركة	فهرس العدد	تعليقات
ارتفاع نظام قرار الموجات فوق الصوتية	Visualsonics	VEVO 770	أو غيرها من نظام الموجات فوق الصوتية المناسبة
ارتفاع وتيرة تحقيقات بالموجات فوق الصوتية	Visualsonics	708 و 707B
منصة التصوير وحقن ذراع	Visualsonics	التصوير ستيشن 2	مع تخطيط القلب، والتحكم في درجة الحرارة ردود الفعل من منصة
محول الضغط	م الآلات	MLT 844
جسر مكبر للصوت	م الآلات	ML221
نظام الحصول على البيانات	م الآلات	ML866
بيانات تسجيل البرامج	م الآلات	LabChart
حلقة الوقوف والمشبك	مختلف الموردين		لعقد محول ضغط خلال القياسات
3 في اتجاه والصمامات مع وصلات luer، قفل الذكور	كول Parmer	30600-02
1/16 "أنابيب Tygon معرف	كول Parmer	06408
من الذكور والإناث ورس ث / 1/16 شوكة خرطوم "	كول Parmer	45510-50 45510-00
24 "أنابيب مع luer من الذكور والإناث في كل نهاية	كول Parmer	30600-60
3 و 10 مل الحقن	العلوم البيولوجية دينار بحريني
30 و 25G الإبر	العلوم البيولوجية دينار بحريني		1.5 بوصة في الطول
بيغ بن مقياس ضغط الدم	رايستر	1456-100
ملحي	مختلف الموردين
الهيبارين	مختلف الموردين
الموجات فوق الصوتية هلام	باركر	Aquasonic 100
مزيل الشعر لوسيون	ناير