מדידת לחץ חדרית השמאל עכברים עובריים ילודים המאוחרת

Summary

מדידת לחץ חדר שמאל (LV) בעכברים עובריים בילוד מתואר. הלחץ נמדד על ידי החדרת מחט מחוברת מתמר מלא נוזלים לתוך LV בהנחיית אולטרסאונד. יש להקפיד לשמור על תפקוד הלב תקין במהלך פרוטוקול הניסוי.

Abstract

לחץ הדם עולה באופן משמעותי במהלך ההתפתחות העוברית ואחרי לידה אצל בעלי חיים בעלי חוליות. בשנת העכבר, זרימת הדם ניתן לזהות 1 סביב יום עובריים (E) 8.5 ^1. סיסטולי שמאל (LV) החדר הוא 2 מ"מ כספית על E9.5 ו 11 מ"מ כספית על E14.5 ^2. על אלה באמצע בשלבים עובריים, LV נראה בבירור דרך בית החזה למדידות לחץ פולשניים, כי הצלעות ועור לא מפותחת. בין E14.5 ולידה (כ E21) שיטות הדמיה יש להשתמש כדי להציג LV. לאחר הלידה, כלומר עליית לחץ הדם של 30 - 70 מ"מ כספית מיום הלידה (P) 2-35 ^3. מעבר P20, לחץ הדם ניתן למדוד עם מצב מוצק צנתרים (כלומר מילר או Scisense). לפני P20, צנתרים אלו גדולים מדי לפיתוח עורקי של העכבר או לחץ הדם יש למדוד את משך מותאם אישית קטטר פלסטיק המחוברים מלאות נוזל מתמרים לחץ ³ או זכוכית micropipettes עו"דכאב כדי סרוו מתמרים לחץ ריק ^4.

העבודה האחרונה שלנו הראו כי העלייה הגבוהה ביותר בלחץ הדם מתרחשת במהלך העוברי המאוחרות ועד לתקופה שלאחר הלידה המוקדמת בעכברים ^5-7. זו עלייה גדולה בלחץ הדם עשויה להשפיע על השריר החלק הנייד (SMC) פנוטיפ בעורקים מתפתחות להפעיל אירועים mechanotransduction חשובים. המחלה האנושית, שבו תכונות מכניות של עורקים המתפתחות נמצאים בסכנה בשל פגמים חלבונים תאי מטריקס (תסמונת כלומר של מרפאן ⁸ ו היצרות מסתם אאורטלי Supravalvular ⁹⁾ שינויים מהירים בלחץ הדם בתקופה זו עשויים לתרום פנוטיפ המחלה וחומרת באמצעות שינויים mechanotransduction אותות. לכן, חשוב להיות מסוגל למדוד את לחץ הדם משתנה במהלך עובריים בסוף שנות ותקופות היילודים בעכברי מודל למחלה האנושית.

אנו מתארים שיטה לחץ LV מדידה בסוףהעוברית (E18) ו המוקדמות לאחר הלידה (P1 - 20) עכברים. המחט מחוברת מתמר מלא נוזלים בלחץ מוכנס לתוך LV בהנחיית אולטרסאונד. הטיפול נלקח כדי לשמור על תפקוד הלב תקין במהלך פרוטוקול הניסוי, במיוחד עבור עכברים עובריים. הנתונים מייצגים מוצגים ואת המגבלות של פרוטוקול הם דנו.

Protocol

1. אולטראסאונד מערכת הלחץ

1. להפעיל את מערכת אולטרסאונד על פי הוראות היצרן (770 Vevo, Visualsonics). למלא את החללית המתאימה (גיל E18 - P7 = מודל 708, גיל> = P7 דגם 707B) עם מים מזוקקים להתחבר למערכת אולטרסאונד. מניחים את החללית בדוכן מתכווננת על הכיוון המשוער הדרוש כדי להשיג ראייה ארוכת ציר LV על העכבר רכוב על פלטפורמת הדמיה כך איפקס LV הוא הצביע על הזרוע ההזרקה.
2. מערכת הלחץ מורכב מתמר מלא נוזלים בלחץ, מגבר גשר, מערכת נתונים הרכישה ההקלטה נתונים התוכנה (LabChart). חיבורים אלה כוללים 3-way והברזים למיניהם, צינורות, מנעולים luer ו קרסים צינור. מזרק 20 מ"ל מלא מלוחים heparinized 10% שטיפה בקצה אחד. הקצה השני מתחבר מחט וגוף מזרק 3 מ"ל משתנה לשמש מעטפת להחזיק צינורות המחט בזרוע הזרקה (איור 1).
כיול המערכת מתמר לחץ עם מד לחץ.
3. הר צינורות המחט מעטפת בזרוע הזריקה של מערכת אולטרסאונד. הצמד מתמר הלחץ עמדה טבעת בגובה משוער של פלטפורמת הדמיה. צרף מחט מתאימה לעידן של העכבר (גיל E18 - P3 =, 30G גיל> P3 = 25 גרם) כדי צינורות המחט. מחטים קטנים יותר לקבל סמיך יותר, קשה יותר להתקדם דרך בית החזה, ויש לי זמן תגובה איטי יותר. לפיכך, גודל המחט הגדולה ביותר שמתאים לומן LV משמש בגיל זה.
4. מניחים תלולית של ג'ל אולטרסאונד על פלטפורמת הדמיה בזהירות בשורה בדיקה באמצעות מעמד מתכוונן כך את המחט ניתן מתקדמים ישירות תחת במרכז בדיקה הדמיה (איור 2) לתוך הג'ל. המחט צריכה להיות מספיק רחוק מתחת בדיקה לא לנקב את מכסה בדיקה, אבל מספיק קרוב כדי להיות בתוך עומק בדיקה מרחק. במידת הצורך, המחט עשוי להיות כפוף ביד כך שהוא נשאר הדואר המטוס הנכון לאורך כל הנסיעה שלו.
5. שמירה על יישור, לחזור בו מחט ולהעלות את החללית הדמיה למקם העכבר על פלטפורמת הדמיה. לשטוף את המחט כדי למנוע כל ג'ל שאולי נכנס עצה.

2. עכבר הכנה

1. כל השיטות המוצגות פרוטוקול זה אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדי ועדת שימוש. להרדים בהריון בעיתוי (E18) או עכבר בילוד (P1 - 20) על ידי שאיפה מתמדת של 1.5% isoflurane. צינורות שניתן להוסיף חרוט אף תקן כדי להכיל את ראש קטן של עכבר בילוד מוקדם (P1 - 15).
2. להבטיח את העכבר על פלטפורמת הדמיה של מערכת אולטרסאונד במצב משכוב הגב עם איפקס LV מצביע לעבר הזרוע ההזרקה. עבור נשים הרות, החל ג'ל אולטרסאונד לנטר את קצב הלב עם גלאי אק"ג המצורף ולהכניס את המדחום בפי הטבעת עבור משוב של טמפרטורת הגוף. עכברים היילודים הם F קטן מדיאו גלאים אלו, ולכן קצב הלב מנוטר במהלך מדידות לחץ וטמפרטורה הגוף נשמר עם מנורת חום חיצוני.
3. הסרת שיער מהבטן של האם בהריון או החזה של העכבר צעיר עם קרם מקריח. עכברים היילודים (P1 - 10) לא דורש שום להסרת שיער.
4. עבור נשים הרות, לחתוך לפתוח את הבטן באמצעות מספריים הניתוח, מלקחיים מעוגלים. להחצין קרן אחת במקום הרחם ועל גזה טבולה תמיסת מלח חמים. לתמרן בזהירות עובר למצב הנכון לקבל תצוגה parasternal ציר זמן של LV באמצעות בדיקה אולטרסאונד. למדוד את הלחץ עוברים את כל זה בצד לפני להחצין קרן הרחם השני. הרחק את כל העוברים ואת הבטן של האם לחות בתוספת תקופתית של מי מלח חמימים.

3. מדידת לחץ

1. מקום prewarmed, ג'ל אולטרסאונד degassed על העכבר עובריים או הילוד. עכברים ילודים שלא היו דepilated צריך כמות קטנה של ג'ל אולטרסאונד שפשף על החזה שלהם לפני ג'ל אולטרסאונד שנותר הוא ליישם כדי לשפר את הצימוד. מנמיכים את החללית הדמיה ולהתאים את זווית פלטפורמת הדמיה לקבל תצוגה אופטימלית parasternal LV ציר זמן. לא לשנות את הזווית של החללית כי יישור מחט יאבדו.
2. תוך מעקב אחר תמונה LV על המסך אולטרסאונד, לאט לקדם את המחט עד שהוא קרוב לתחתית של החללית. לשנות את מיקום המחט בדיקה, אם יש צורך בכך, כדי לתקן משמרות יישור. לשטוף בעדינות את המחט עם מי מלח. הפעל לחץ הנתונים הקלטה ואפס מתמר לחץ עם תוכנת LabChart. מתמר נסחף עם טמפרטורה עמדה, ולכן חשוב לאפס אותו לפני מדידת לחץ כל עכבר.
3. לאט לאט לקדם את המחט עד שניתן לראות בקצה התמונה אולטרסאונד, אך עדיין לא LV. לשנות את מיקום המחט, במידת הצורך, כדי להזין את LV באיפקס. לשנות את מיקום החללית, במקרה הצורך, כדי לשמור על תמונה ברורה של המחט. לקדם את המחט לתוך לומן LV (איור 3), בעת הקלטת נתונים בלחץ וניטור מיקום המחט על תמונת אולטרסאונד. תחילת ההקלטות pulsatile מ מתמר לחץ מאשרת את המיקום בתוך לומן LV (איור 4).
4. אם המחט נראה ב לומן LV, אבל הקלטות הלחץ לא pulsatile, סומק עם ברז אור על הבוכנה במזרק, רק עד להגביר את הלחץ מזוהה (כ 5-10 בנפח μL). זה אמור לנקות את כל כפכפים שניתן למנוע קריאה מדויקת. אם קריאות הלחץ עדיין לא pulsatile, המחט עשוי להיות מעל או מתחת למישור הנכון ולא להיות מוכנס לתוך לומן LV. חוזר בי את המחט, לשטוף עם מי מלח, ו מראש שוב. אם קריאות pulsatile עדיין לא השיג, לעבור העכבר הבא. השתמש מחט חדשה כל עכבר.
5. קריאות לחץ מוצלחים ניתן לקבל 75%עכברים עובריים בילוד ניסו. קריאות צריך לקחת 5 - 10 דקות כל אחד והנתונים לחץ על העכבר אין לכלול אם קצב הלב שונים משמעותית מהצפוי (5 א 'איור). קצב לב יש השפעה משמעותית על צעדים לב וכלי דם קצב הלב שינו מעידים על מצוקה של הלב. מצוקה עוברית מתרחשת בדרך כלל 1 - 1.5 שעות לאחר החצנה הראשונה של הרחם, ולכן המהירות חשובה למדידת הלחצים המלטה שלמה.

4. נציג תוצאות

כל התוצאות המוצגות הן עבור עכברים C57BL6J. הדימוי של המחט לומן LV על העכבר P1 ב שמוצג באיור 3. מחט יש צורך לנקב את דופן בית החזה ולהשיג גישה קטן LV לומן, אבל זה מגביר באופן משמעותי את זמן התגובה של המערכת בלחץ. כאשר עלייה לשלב משוער בלחץ מוחל באופן ידני למערכת, זמן להגיע 67% מהלחץ המקסימלי הוא 0.067 SEג עם צינור בלבד (רוב מעיד סביר של זמן אמיתי ליישם את הצעד לחץ), 0.105 שניות עם מחט 25 G ו - 0.529 שניות עם מחט 30 G. עיכוב להגיע הלחץ המרבי ניתן לראות את עקבות שלמים המוצגים 4A הדמות 4C. למרות זמן התגובה הוא איטי יותר עם ​​מחט 30G, צורת הגל נתפס טוב יותר בשלבים עובריים בילוד מוקדם, כי קצב הלב עולה עם הגיל בעכברים ^5. למרות מגבלה זו, לחץ סיסטולי ניתן לחשב בהנחה נכון LV הלחץ הדיאסטולי (מינימום) הוא אפס, ואת הלחץ (מרבי) סיסטולי LV פי שניים בלחץ הממוצע LV נקבע מתוך קריאה על מצב יציב (איור 4 ב ו - 4D ) ^6. מקובל להניח כי LV הסיסטולי ולחצים העורקים שווים. הלחצים נמדד קצב הלב ומחושב LV עבור הגילאים השונים בין E18 ו P14 מוצגות באיור 5.

באיור 1. תמונה של מתמר לחץ עם 3 כיווני והברזים למיניהם מצורפים, זכר (M) ונקבה (ו) חיבורי luer לנעול, קרסים צינור, צינורות, מזרקים, מחטים.

איור 2. תמונה של הקים כדי ליישר את המחט עם בדיקה הדמיה (א '). פלטפורמת הדמיה הוא הסתובב כך איפקס LV של העכבר עומד בפני הזרוע ההזרקה. החללית הוא רכוב על דוכן מתכוונן על הכיוון המשוער הדרוש כדי להשיג תמונה רב ציר LV. מעטפת צינורות מחט הוא רכוב בזרוע הזריקה. מחט הוא התקדם לתוך תלולית של ג'ל אולטרסאונד על פלטפורמת ההדמיה כדי לקבוע את הזווית הנכונה למצב אנכי ואופקי ביחס בדיקה הדמיה (ב ').

איור 3. תמונה של המחט (N) התקדם דרך בית החזה (CW) ולתוך לומן LV ב העכבר P1. סרגל קנה מידה = 0.1 מ"מ.

איור 4. Pulsatile דוגמה לחץ קריאות כמו מחט נכנס LV של E18 (א) ו - P14 (C) העכבר. יש עיכוב להגיע למצב יציב בשל זמן התגובה של המערכת עם המחט מחוברת. צפיות זום של קריאות על מצב יציב מוצגים ב 'הערה ד' כי המינימום E18 לחצים LV הם כמעט לאפס, אבל צורת גל מלא מאפס הלחץ המקסימלי לא ניתן להקליט את קצב הלב גבוה יותר של p14 בעכברים. הלחצים מתכוון נמדדות על פי הקריאות המצב היציב ואת ההנחה היא כי LV הלחץ הסיסטולי = 2 x נמדד הלחץ אומר.

איור 5 קצב הלב נמדד (א) ומחושב סיסטולי לחצים LV (ב) - E18. P14 עכברים. N = 7 עבור E18, 5 עבור P1, P3 על 22, 23 ו 16 של P7 על P14 ^5-7.

Discussion

הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה למדידת לחץ LV ב עובריים בסוף שנות ועכברים בילוד מוקדם. המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה הוא הפתרון הזמני של המערכת לחץ. אותות הלחץ דיכא כפי שהוא נוסע מ LV באמצעות מחט כדי מתמר, ורק אומר ערכי לחץ ניתן להקליט. דעיכת ניתן למזער באמצעות מחט הגדול ב?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב / ציוד	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
ברזולוציה גבוהה אולטרסאונד מערכת	Visualsonics	Vevo 770	או אולטרסאונד אחרת המערכת המתאימה
אולטרסאונד בתדירות גבוהה בדיקות	Visualsonics	708 ו 707B
פלטפורמת הדמיה והזרוע זריקה	Visualsonics	הדמיה תחנה 2	עם אק"ג משוב בקרת טמפרטורה של פלטפורמת
לחץ מתמר	אלצהיימר מכשירים	MLT 844
גשר מגבר	אלצהיימר מכשירים	ML221
נתוני מערכת הרכישה	אלצהיימר מכשירים	ML866
נתונים ההקלטה תוכנה	אלצהיימר מכשירים	LabChart
טבעת לעמוד לצבוט	ספקים שונים		להחזיק מתמר הלחץ במהלך המדידות
3-way והברזים למיניהם עם קשרים luer, נעילת זכר	קול בן הזוג	30600-02
1/16 "ID Tubing Tygon	קול בן הזוג	06408
Luers זכר ונקבה w / 1/16 "ברביטורטים צינור	קול בן הזוג	45510-50 45510-00
24 "עם צינורות luer זכר ונקבה בכל קצה	קול בן הזוג	30600-60
3 ו 10 מ"ל מזרקים	BD Biosciences
30 ו 25 גרם מחטי	BD Biosciences		1.5 ס"מ אורך
ביג בן מנומטר	Riester	1456-100
מלוח	ספקים שונים
הפרין	ספקים שונים
אולטראסאונד ג'ל	פרקר	Aquasonic 100
מסיר שיער קרם	נאיר