Измерение давления в левом желудочке в позднем эмбриональных и новорожденных мышей

Резюме

Измерение давления в левом желудочке (ЛЖ) в эмбриональных и новорожденных мышей описано. Давление измеряется путем введения иглы подключены к заполненной жидкостью датчика в LV под ультразвуковым контролем. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы поддерживать нормальную функцию сердца в протоколе исследования.

Аннотация

Артериальное давление значительно возрастает во время эмбрионального и постнатального развития у позвоночных животных. У мышей, кровоток первая обнаруживаются вокруг эмбриональных день (E) 8.5 ^1. Систолическое левого желудочка (ЛЖ) давление на 2 мм рт.ст. E9.5 и 11 мм рт.ст. в E14.5 ^2. На этих середине эмбриональной стадии, LV отчетливо видна через стенку грудной клетки для инвазивного измерения давления, так как ребра и кожи, не полностью разработана. Между E14.5 и родов (примерно E21) изображения методы должны быть использованы для просмотра LV. После родов, среднее артериальное давление повышается от 30 - 70 мм рт.ст. от послеродовой день (P) 2 - 35 ^3. Помимо P20, артериальное давление может быть измерено с твердотельными катетерами (т.е. Миллар или Scisense). Прежде, чем P20, эти катетеры являются слишком большими для развивающихся мыши артерий и артериальное давление должно быть измерено с помощью пользовательских вытащил пластиковый катетер прилагается к заполненной жидкостью датчики давления ³ или стеклянной микропипетки ATTболели в серво нулевой датчики давления ^4.

Наши последние исследования показали, что наибольшее повышение артериального давления происходит в конце эмбрионального в раннем послеродовом периоде у мышей ^5-7. Это большое повышение артериального давления может влиять на клетки гладкой мускулатуры (SMC) фенотип в развивающихся артерии и вызвать важные события механотрансдукции. У человека болезнь, при которой механические свойства развивающихся артерий скомпрометированы дефектов белки внеклеточного матрикса (синдром т.е. Марфана ⁸ и Supravalvular аортальный стеноз ⁹⁾ быстрые изменения артериального давления в течение этого периода могут способствовать фенотип заболевания и тяжести через изменения в механотрансдукции сигналов. Таким образом, важно иметь возможность оценить изменения артериального давления во время конца эмбрионального и неонатального периода на мышах болезни человека.

Мы опишем метод для измерения давления LV в концеэмбриональные (E18) и раннем послеродовом (P1 - 20) мышей. Игла прикрепляется к заполненной жидкостью датчик давления вставляется в LV под ультразвуковым контролем. Принимаются меры для поддержания нормальной сердечной деятельности во время экспериментального протокола, особенно для эмбриональных мышей. Представитель данные представлены и ограничения протокола обсуждается.

протокол

1. Ультразвук и давление в системе

1. Начать ультразвуковой системы в соответствии с инструкциями производителя (Vevo 770 Visualsonics). Заполните соответствующую зонд (возраст E18 - модель P7 = 708, возраст> = P7 модели 707B) с дистиллированной водой и подключение к ультразвуковой системы. Поместите датчик в регулируемой подставкой на приблизительно ориентации, необходимых для получения Л. длинной оси зрения для мыши установлен на платформу изображения таким образом, что LV вершина указал на введение руки.
2. Давление в системе состоит из заполненных жидкостью датчик давления, мост усилителя, системы сбора данных и записи данных программного обеспечения (LabChart). Соединения состоят из трех направлениях краны, трубы, замки и Luer шланг бородки. 20 мл шприц наполняется на 10% гепаринизированной солевой для промывки на одном конце. На другом конце соединяется с иглы и шприц 3 мл тела модифицированы для использования в качестве корпуса для хранения труб иглу в руку инъекцию (рис. 1).
Калибровка системы датчик давления с помощью манометра.
3. Установите трубку иглы и корпуса в руке инъекции ультразвуковой системы. Закрепите датчик давления в кольцевом стенде на приблизительную высоту изображения платформы. Прикрепить игла подходит для возраста мыши (возраст E18 - P3 = 30G, возраст> Р3 = 25G) с иглой трубки. Меньшие иглы забиваются проще, сложнее продвигать через стенку грудной клетки, а у более медленного времени отклика. Таким образом, крупнейший размер иглы, которая помещается в просвет LV используется для каждого возраста.
4. Поместите курган ультразвука гель на изображение платформы и тщательно выстраивать зонда помощью регулируемой подставкой так, чтобы стрелка могут быть выдвинуты непосредственно в геле по центру изображения зонда (рис. 2). Игла должна быть достаточно далеко ниже зонда, чтобы не проколоть крышку датчика, но достаточно близко, чтобы быть в зонд глубины очага. При необходимости, игла может быть согнуты руки, так что он остается в гоэлектронной правильный самолет на протяжении всей своей поездки.
5. Поддержание выравнивание, убрать иглу и поднять изображений зонда разместить мышь на изображение платформы. Промойте иглу, чтобы устранить любые гель, который может попасть в наконечник.

2. Мышь подготовки

1. Все методы, показанные в этом протоколе были одобрены Уходу за животными и использованию комитета. Обезболить приурочен беременной матери (E18) или новорожденных мышей (P1 - 20) при непрерывном вдыхании в размере 1,5% ИФ. Трубки могут быть вставлены в стандартный конус нос для размещения небольших глава ранней неонатальной мыши (P1 - 15).
2. Закрепите мыши изображение платформы ультразвуковой системы в положение лежа на спине положение LV вершиной, направленной в сторону инъекции руку. Для беременных женщин, применяют ультразвук гель для контроля частоты сердечных сокращений с прилагаемыми детектор ЭКГ и вставьте ректального термометра для управления с обратной связью по температуре тела. Новорожденных мышей слишком малы еили эти детекторы, поэтому сердечный ритм контролируется во время измерения давления и температуры тела поддерживается с внешней лампы тепло.
3. Удаление волос с живота беременной женщины или грудь молодой мышь с депиляции кремом. Новорожденных мышей (P1 - 10) не требуют удаления волос.
4. Для беременных женщин, вспарывали живот использованием рассечение ножницами и изогнутый пинцет. Воплощать один рога матки и место на марлю смоченную теплым физиологическим раствором. Тщательно манипулировать эмбриона в правильное положение для получения парастернальной перспективе оси LV помощью ультразвукового зонда. Измерьте давление во всех эмбрионов на этой стороне до экстернализации другие рога матки. Храните все эмбрионы и живот матери влажный с периодическим добавлением теплого физиологического раствора.

3. Измерение давления

1. Место подогретую, дегазированной гель ультразвука на эмбриональной и неонатальной мыши. Новорожденных мышей, которые не были гepilated должны иметь небольшое количество геля ультразвук потер на груди до оставшихся геля ультразвук применяется для улучшения связи. Опустите изображение зонда и отрегулировать угол изображения платформу для получения оптимального парастернальной LV перспективе оси. Не регулировать угол наклона зонда, так как игла выравнивания будут потеряны.
2. В то время как контроль изображения LV на УЗИ экрана, медленно продвигать иглу, пока он находится недалеко от нижней части зонда. Установите иглу и датчик положения, при необходимости, исправить согласование смены. Аккуратно промойте иглу с физиологическим раствором. Начало записи данных давления и нулю датчик давления с LabChart программного обеспечения. Преобразователь дрейфует с температурой и позиции, поэтому важно к нулю это только перед измерением давления в каждой мыши.
3. Медленно продвигать иглу, пока не видно на краю ультразвуковое изображение, но еще не в LV. Отрегулируйте положение иглы, при необходимости, ввести в LVвершины. Отрегулируйте положение датчика, при необходимости, поддерживать четкое изображение иглы. Продвижение иглы в просвете LV (рис. 3), во время записи данных о давлении и мониторинга иглы место на ультразвуковом изображении. Начало пульсирующий записи из датчика давления подтверждает место внутри полости ЛЖ (рис. 4).
4. Если игла оказывается в просвете LV, но давление записи не пульсирующие, на одном уровне с легким нажатием на поршень шприца, только пока повышение давления обнаружено (около 5 - 10 мкл). Это должно очистить любые сабо, которые могут затруднить точные показания. Если показания давления по-прежнему не пульсирующий, игла может быть выше или ниже плоскости правильный, а не вставляется в полость ЛЖ. Уберите иглу, промыть раствором, и заранее еще раз. Если пульсирующий показания до сих пор не получено, перейти к следующему мыши. Используйте новую иглу для каждой мыши.
5. Успешное чтение давления могут быть получены из 75%эмбриональных и новорожденных мышей пытались. Чтения должны принимать 5 - 10 минут каждый и давлением данных для мыши не должны быть включены, если частота сердечных сокращений существенно отличается от ожидаемого (рис. 5а). Частота сердечных сокращений оказывает существенное влияние на сердечно-сосудистую меры и изменения частоты сердечных сокращений свидетельствует о сердечных страданий. Эмбриональные бедствия обычно происходит 1 - 1,5 часа после первого экстернализации матки, так что скорость важна для измерения давления в весь помет.

4. Представитель Результаты

Все результаты приведены для мышей C57BL6J. Образ иглы в просвете LV для P1 мыши показано на рисунке 3. Иглы необходимо прокол грудной стенки и получить доступ к небольшой LV просвет, но это значительно увеличивает время отклика давления в системе. Когда приблизительно увеличение шаг в давлении вручную применительно к системе, время до 67% от максимального давления 0,067 себес с трубкой только (скорее всего, свидетельствует о реальном времени применять давление шаг), 0,105 сек при 25 G иглу и 0,529 сек при 30 G иглу. Задержка в достижении максимального давления можно увидеть в полном обводка показано на рисунке 4А и 4С. Хотя время отклика медленнее 30G иглу, сигнал лучше, захваченных в эмбриональном и раннем неонатальном этапах, так как частота сердечных сокращений увеличивается с возрастом у мышей ^5. Несмотря на это ограничение, систолическое давление может быть вычислена в предположении, что истинные диастолической (минимальное) давление равно нулю, а систолическое (максимальное) LV давление в два раза превышает среднее давление LV определяется по показаниям в стационарном состоянии (рис. 4В и 4D ) ^6. Принято считать, что систолическое LV и артериального давления равны. Измеренная частота сердечных сокращений и рассчитаны LV давления для разных возрастов между E18 и P14 показано на рисунке 5.

Рисунок 1. Изображение датчика давления с прикрепленными трехходовой краны, мужчина (М) и женские (F) соединения Luer Lock, шланг бородки, трубки, шприцы и иглы.

Рисунок 2. Образ создан, чтобы выровнять иглу с датчиком изображения (A). Визуализации платформа вращается так, что LV вершине мышь перед инъекции руку. Датчик устанавливается в регулируемой подставкой на приблизительно ориентации, необходимых для получения Л. длинной оси изображения. Корпус иглы трубка устанавливается в инъекции руку. Игла продвигается в насыпь ультразвука гель на изображение, чтобы определить платформу под правильным углом и вертикальном и горизонтальном положении по отношению к изображений зонда (B).

Рисунок 3. Изображение иглой (N) прошли через стенку грудной клетки (CW) ив LV просвет в P1 мыши. Шкала бар = 0,1 мм.

Рисунок 4. Пример пульсирующего давления показания, как игла входит в РН E18 (А) и P14 (C) мыши. Существует задержка в достижении устойчивого состояния в связи с временем отклика системы с иглой прилагается. Увеличить просмотра показаний в равновесном состоянии приведены в B и D. Обратите внимание, что минимальный E18 LV давление близко к нулю, но полный сигнал от нуля до максимального давления не могут быть записаны на более высоких темпов сердце P14 мышей. Среднее давление измеряется от постоянного чтения государства и предполагается, что LV систолическое давление = 2 х измеряется среднее давление.

Рисунок 5 измерения частоты сердечных сокращений (A) и рассчитаны систолическое давление ЛЖ (B) для E18 -. P14 мышей. N = 7, E18, 5 P1, P3, 22, 23 и 16 P7 для P14 5-7.

Обсуждение

Протокол, представленные здесь предоставляет метод для измерения давления LV в конце эмбрионального и раннего неонатального мышей. Основным ограничением этого протокола является временным разрешением давления в системе. Давление сигнал затухает по мере продвижения от LV через иглу к ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента / оборудование	Компания	Номер по каталогу	Комментарии
Высокое разрешение ультразвуковая система	Visualsonics	Vevo 770	Или другой соответствующей системы ультразвукового
Высокие частоты ультразвука зондов	Visualsonics	708 и 707B
Платформа изображений и введение руки	Visualsonics	Изображений Station 2	При ЭКГ и температуры обратной связью платформы
Датчик давления	AD инструменты	MLT 844
Мост усилитель	AD инструменты	ML221
Система сбора данных	AD инструменты	ML866
Запись данных программного обеспечения	AD инструменты	LabChart
Кольцо стоять и зажим	Различные поставщики		Для проведения датчик давления при измерении
3-полосная краны с Luer соединениями, мужской замок	Коул Parmer	30600-02
1/16 "ID Tygon труб	Коул Parmer	06408
Мужчина и женщина luers Вт / 1/16 "штуцером для шланга	Коул Parmer	45510-50 45510-00
24 "трубка с мужскими и женскими Luer на каждом конце	Коул Parmer	30600-60
3 и 10 мл шприцев	BD Biosciences
30 и 25G иглы	BD Biosciences		1.5 дюйма в длину
Биг Бен манометр	Riester	1456-100
Солевой	Различные поставщики
Гепарин	Различные поставщики
Ультразвуковой гель	Паркер	Aquasonic 100
Лосьон для удаления волос	Наир