TransFLP - طريقة لتعديل وراثيا<em&gt; ضمة الكوليرا</em&gt; بناء على التحول الطبيعي وإعادة التركيب، FLP

Summary

وهناك طريقة سريعة لتعديل جينوم V. الكوليرا. وتشمل هذه التعديلات حذف الجينات واحد، مجموعات الجينات والجزر الجيني وكذلك التكامل من متواليات قصيرة (على سبيل المثال عناصر المروج أو تسلسل النسب، علامة). وتستند هذه الطريقة على التحول الطبيعي وإعادة التركيب FLP.

Abstract

تتوفر العديد من الطرق لمعالجة الكروموسومات البكتيرية ^1-3. معظم هذه البروتوكولات تعتمد على إدخال البلازميدات تنسخي مشروط (مثل إيواء replicons البير التي تعتمد على درجة الحرارة أو تراعي ^1،2). يتم دمج هذه البلازميدات البكتيرية في الكروموسومات تقوم على التماثل بوساطة إعادة التركيب. وغالبا ما تكون مثل هذه المسوخ غرزي استخدامها مباشرة في إعدادات التجريبية. وبدلا من ذلك، يمكن إجراء الختان لاختيار البلازميد تليها خسارتها، والتي لالجراثيم سلبية الغرام تعتمد في أغلب الأحيان على انزيم مكافحة اختيار سكراز ليفان المشفرة بواسطة الجينات هيئة تنسيق المعونة ^4. يمكن للالختان إما استعادة النمط الجيني ما قبل الإدراج أو تؤدي إلى تبادل بين كروموسوم ونسخة بلازميد ترميز الجين المعدلة. عيوب هذا الأسلوب هو أنه يستغرق وقتا طويلا. البلازميد لابد من استنساخ الأولى؛ أنه يتطلب نقل الأفقي إلى V. الكوليرا (ن معظم otably من التزاوج مع E. سلالة الإشريكية المانحة) أو التحول الاصطناعي لهذه الأخيرة؛ واستئصال البلازميد هو عشوائي ويمكن إما استعادة النمط الجيني الأولي أو إنشاء التعديل المطلوب إذا لم يمارس اختيار إيجابية. هنا، نقدم طريقة للتلاعب السريع للV. الكوليرا كروموسوم (ق) ⁵ (الشكل 1). ويستند هذا الأسلوب على تحريض TransFLP كيتين بوساطة اكتشفت مؤخرا من الكفاءة الطبيعية في هذا الحي ممثل ⁶ و أخرى من جنس الضمة مثل V. fischeri ^7. الكفاءة الطبيعية يسمح للامتصاص الحمض النووي DNA مجانا بما في ذلك شظايا ولدت PCR. تؤخذ مرة واحدة حتى، ويعيد توحيد DNA مع كروموسوم معين وجود ما لا يقل عن 250-500 من بي بي المرافقة مثلي المنطقة ^8. منها علامة الاختيار في الفترات الفاصلة بين هذه المناطق المحيطة يسمح الكشف سهولة transformants التي تحدث في كثير من الأحيان. ر "> ويمكن استخدام هذه الطريقة لمعالجات وراثية مختلفة من الكوليرا V. وربما غيرها أيضا البكتيريا المختصة بشكل طبيعي. نحن نقدم أمثلة ثلاثة على رواية ما يمكن تحقيقه باستخدام هذا الأسلوب بالإضافة إلى دراستنا المنشورة سابقا على الحذف جين واحد وعلى إضافة علامة تقارب-متواليات ^5. يتم دمج عدة خطوات التحسين بشأن بروتوكول الأولي من الكيتين التي يسببها التحول الطبيعي ⁶ في هذا البروتوكول TransFLP. وتشمل هذه وغيرها استبدال شظايا قذيفة السلطعون من رقائق كيتين المتاحة تجاريا ^8، على التبرع PCR المستمدة من الحمض النووي وتحويل المواد ^9، وإضافة المواقع المستهدفة FLP-إعادة التركيب (FRT) ^5. مواقع FRT يسمح الختان الموقع موجه للعلامة الاختيار بوساطة recombinase FLP ^10.

Protocol

ويتمثل الأسلوب TransFLP (الشكل 1) من ثلاثة مناهج مختلفة: I) حذف اثنين من الجينات المجاورة ترميز المحددات الفوعة من V. الكوليرا (على سبيل المثال، ΔctxAB)؛ II) إزالة جزيرة المرضية (مثل ΔVPI-1)، وIII) إدماج بوليميراز RNA T7 التي تعتمد على تسلسل المروج المنبع من الجينات المصلحة من الذي يسمح له لاحقا اصطناعية التعبير في الخلفية سلالة منها (على سبيل المثال، T7-tfoX) (الشكل 2).

1. إعداد رقائق كيتين

1. الوزن 50-80 ملغ من رقائق كيتين في مستوى 1،5 مل أنبوب بلاستيكي. يمكن إعداد هذه بكميات كبيرة. كيتين رقائق متاحة تجاريا من سيغما (الفئة رقم C9213).
2. الأوتوكلاف رقائق الحفاظ على أغطية من الأنابيب مفتوحة.
3. إغلاق الأغطية على الفور بعد الأوتوكلاف وتبريده.
4. متجر تعقيمها كيتين رقائقفي درجة حرارة الغرفة.

2. اختياري: تحويل الاصطناعي V. الكوليرا مع FLP Recombinase ترميز البلازميد

1. إعداد electrocompetent V. الكوليرا الخلايا باستخدام الطرق القياسية ^11. تخزين مأخوذة من الخلايا المختصة في -80 ° C.
2. إضافة 1-2 ميكرولتر من إعداد مصغرة العادية للبلازميد PBR-FLP ⁵ إلى electrocompetent V. الخلايا الكوليرا ونقل الخليط إلى كوفيت الصعق الكهربائي (0.2 عرض الفجوة سم).
3. تطبيق النبض عند 1.6 كيلو فولت.
4. إضافة 0.9 مل SOC المتوسطة، ونقل بلطف الخلية إلى أنبوب القياسية مل 14. غير احتضان الحركة ل2،5 حتي 3 ساعة عند 30 ° C.
5. لوحة 100 ميكرولتر و 300 ميكرولتر على لوحات تحتوي على 100 ميكروغرام LB / مل الأمبيسلين واحتضان في 30 ° C بين عشية وضحاها.
6. تنقية استنساخ واحدة ومخزن والأسهم الجلسرين للتجارب TransFLP المستقبل.

3. قليل النوكليوتيد تصميم وتفاعل البلمرة سلسلة

1. مطلوب لا يقل عن ستة [أليغنوكليوتيد] لتضخيم المنطقة DNA (ق) من الفائدة وكذلك FRT-يحيط كاسيت المضادات الحيوية عن طريق PCR (الشكل 3). فمن المستحسن أن تدرج أيضا زوج من خارج فتيلة أليغنوكليوتيد] جزء PCR المدرجة. هذا يسمح التحقق من التكامل والختان الصحيح للكاسيت-FRT يحيط المقاومة للمضادات الحيوية (مثل صورت على أنها "CHK إلى أعلى 'والاشعال" CHK إلى أسفل "في أرقام 3 إلى 5).
2. تصميم أليغنوكليوتيد] # 2، # 3، # 4، # 5 وبعناية. ينبغي أن تكون قادرة على يصلب بما فيه الكفاية (على سبيل المثال ~ 28 بي بي) إلى DNA القالب. الحمض النووي القالب الحمض النووي الجيني (gDNA) لالاشعال رقم 2 ورقم 5 و FRT-اساسه-FRT التي تحتوي على الحمض النووي البلازميد مثل pROD17 ¹² و PBR-FRT-KAN FRT-(هذه الدراسة) لالاشعال رقم 3 ورقم 4 ( الرقم 3A).
3. تصميم الاشعال رقم 2 لرقم 5 واسعة تسمح قاعدة الاقتران في نهاية 5'ما بين رقم 2 / رقم 3 ورقم 4 / # 5 على التوالي (الشكل 3A الشكل). جولتين من PCR متابعة.
4. أداء ثلاث تفاعلات PCR مستقلة والجولة 1 ^القديس PCR. وأول واحد تضخيم المنطقة المنبع للجين / DNA المنطقة في المصالح مع المعونة من [أليغنوكليوتيد] رقم 1 ورقم 2. ينبغي أن يؤدي إلى PCR جزء من شركة بريتيش بتروليوم لا يقل عن 500 في الطول للسماح إعادة التركيب مثلي داخل الخلايا. يمكن أقصر شظايا (~ 250 BP) من ⁸ كافية ولكن لا ينصح.
5. بالتوازي أداء PCR الثانية، التي تزيد من الكاسيت FRT-يحيط المضادات الحيوية. لتقديم أمثلة ونحن هنا تستخدم أساسا APH (اساسه ^R). [أليغنوكليوتيد] استخدام رقم 3 ورقم 4 لهذا التفاعل (الشكل 3A).
6. وفي نفس الوقت، تضخيم المنطقة DNA بواسطة PCR المصب (عينة الثالثة). يجب أن يكون جزء PCR أيضا لا يقل عن 500 شركة بريتيش بتروليوم في الطول. أداء PCR مع gDNA كقالب وأليغنوكليوتيد] # 5 و # 6 (الشكل 3A).
7. بعد تنقية جميع PCR 3شظايا، نفذ الجولة ^{الثانية} 2 من PCR. استخدام خليط متساو من ثلاثة اجزاء على جميع الحصول عليها في الجولة الأولى كقالب. يتم تحفيز التضخيم من قبل أليغنوكليوتيد] رقم 1 ورقم 6. جزء PCR الناتجة (الشكل 3B) بمثابة تحويل DNA في التجربة التحول الطبيعي (الشكل 1).

4. كيتين الناجم عن التحول الطبيعي

1. تنمو V. الكوليرا في الخلايا الهوائية المتوسطة الغنية في 30 ° C حتى تصل إلى الكثافة البصرية في 600 نانومتر تقريبا 0.5.
2. حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي. غسل بيليه مرة واحدة في المتوسط ​​اصطناعية محددة (DASW ⁶⁾ قبل resuspending الخلايا في 2 مجلدات من DASW. إضافة 1 مل من ثقافة إلى 50-80 ملغ من رقائق كيتين العقيمة (تحت أوضح نقطة 1). إذا البكتيريا الميناء البلازميد PBR-FLP (اختياري نقطة 2)، إضافة الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل) إلى الثقافة. احتضان في C ° 30 ساعة ل16-24 دون حركة.
3. إضافة & Gه و 200 نانوغرام من جزء ^{الثانية} على مدار PCR المستمدة 2 (شرح تحت النقطة 3). مزيج بعناية دون فصل على نطاق واسع من البكتيريا على أسطح كيتين. احتضان في C ° 30 لمدة 24 ساعة دون حركة.
4. دوامة الثقافة على نطاق واسع ل≥ 30 ثانية. نشر 100-300 ميكرولتر على انتقائية لوحات متوسطة LB (مثل لوحات أو الكاناميسين LB التي تحتوي على جنتاميسين للأمثلة المقدمة هنا). استخدام لوحات مزدوجة انتقائية إذا كان المرفأ البكتيريا البلازميد PBR-FLP بإضافة الأمبيسلين بصورة متزامنة إلى المضادات الحيوية الأخرى. احتضان لوحات في C ° 30 ساعة ل16-24 أو حتى المستعمرات مرئية.
5. عزل واحدة من لوحات transformants انتقائية. وحلت هذه transformants موضع الكروموسومات الأصلي من جزء PCR نتيجة لحدث كروس مزدوجة. ويمكن استخدام هذه السلالات مباشرة لمزيد من التجارب في حالة إزالة كاسيت المضادات الحيوية ليست ضرورية.

5. إزالة راديو كاسيت الانتقائية (ق) من FLPإعادة التركيب،

1. تحويل مصطنع transformants الخاص بك مع البلازميد PBR-FLP كما هو موضح في النقطة 2 إذا لم تفعل قبل الفحص التحول الطبيعي.
2. تنمو هذه البكتيريا على لوحات أجار LB C تحتوي على أمبيسلين في ل16-24 ° 37 ساعة. خيارات: تغيير درجة الحرارة في ما بين ساعة لمدة 2-3 إلى 40 ° C والتعبير عن FLP من البلازميد FLP-PBR ودي في قمع ^5،10 ارتفاع درجات الحرارة؛ البكتيريا نقل لوحات جديدة بعد تقريبا. 8 ساعات من الحضانة.
3. اختبار الحساسية للمضادات الحيوية، (أظهر هنا لالكاناميسين؛ الشكل 1) من restreaking استنساخ بالتوازي على لوحات أجار المضادات الحيوية التي تحتوي على المضادات الحيوية والحرة. عزل المستعمرات الحساسة واحد. تجميد الأمبيسلين مقاومة للاستنساخ كما الجلسرين الأسهم إذا كنت تنوي تعديل المزيد من سلالة أخرى مع حذف / الإدراج باستخدام TransFLP.

6. بلازميد علاج

1. تنمو بين عشية وضحاها الثقافة في الظروف الجوية وفي 30 ° C. استخدام المتوسطة الغنية دون إضافة أي مضاد حيوي.
2. اختياري: نمو ثقافة جديدة للموارد البشرية 3-6 من تمييع 1:100 الثقافة بين عشية وضحاها في وسط المضادات الحيوية خالية الطازجة.
3. لوحة خط أو التخفيف (ق) للثقافة في سهل LB وحة أجار (ق) واحتضان في 30 درجة مئوية لمدة 8-16 ساعة (حتى المستعمرات مرئية).
4. اختبار لالأمبيسلين الحساسية من الحيوانات المستنسخة من restreaking استنساخ بالتوازي على لوحات أجار المضادات الحيوية التي تحتوي على المضادات الحيوية وخالية من (الشكل 1). تجميد الأمبيسلين سلالة حساسة والأسهم الجلسرين.

النتائج

وتظهر نتائج ممثل في الأمثلة الثلاثة أرقام 4 إلى 6. النهج الأول يهدف إلى حذف الجينات المجاورة ctxA وctxB. معا ترميز عامل الفوعة الرئيسية للV. الكوليرا، بكتيريا الكوليرا. قمنا بتصميم [أليغنوكليوتيد] للأسلوب TransFLP كما هو موضح أعلاه وفقا للالشكل 3. سل...

Discussion

وصف طريقة TransFLP أعلاه وغيرها وقد تم على نطاق واسع ⁵ المستخدمة في مختبرنا. هذا النوع من التلاعب الجيني التي هي ممكنة، ضمن جملة أمور: حذف الجينات واحد ومجموعات الجينات، حذف الجزر الجيني (على سبيل المثال، VPI-1)، إدراج تسلسل المنبع من الجين في المصالح (على سبي...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	كتالوج رقم	تعليقات
كيتين رقائق	سيجما	C9213	التعقيم المطلوبة
OPTIONAL: Micropulser (في حال وينبغي رفعه من قبل المضادات الحيوية كاسيت recombinase FLP المشفرة على PBR-FLP)	Biorad	165-2100	أو قابلة للمقارنة electroporators