TransFLP - um método para modificar geneticamente<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Com base Transformação Natural e recombinação FLP-

Resumo

Um método rápido para modificar o genoma de V. cholerae É descrito. Essas modificações incluem a eliminação de genes individuais, grupos de genes e ilhas genômicas, bem como a integração de seqüências curtas (por exemplo, elementos promotor ou afinidade tag-seqüências). O método baseia-se na transformação de recombinação natural e FLP.

Resumo

Vários métodos estão disponíveis para manipular cromossomas bacterianos ^1-3. A maior parte destes protocolos contar com a inserção de plasmídeos replicativos condicionalmente (por exemplo, abrigando replicões pir-dependentes ou sensíveis à temperatura ^1,2). Estes plasmídeos são integrados nos cromossomas bacterianos com base na homologia mediada por recombinação. Esses mutantes de inserção são muitas vezes usado diretamente em ambientes experimentais. Em alternativa, a selecção para a excisão do plasmídeo seguido por sua perda pode ser realizada, que para bactérias gram-negativas depende frequentemente da enzima sucrase contra-seleccionável de levana, codificada pelo gene sacB ^4. A excisão pode restaurar o genótipo de pré-inserção, ou em resultado de uma troca entre o cromossoma e a cópia mediada por plasmídeos do gene modificado. Uma desvantagem desta técnica é que é demorado. O plasmídeo tem que ser clonado primeiro, que exige a transferência horizontal em V. cholerae (mais n otably por acasalamento com um E. coli estirpe dadora) ou transformação artificial deste último, e da excisão do plasmídeo é aleatório e pode restaurar o genótipo inicial ou criar a modificação desejada se nenhuma selecção positiva é exercida. A seguir, apresentamos um processo para a manipulação rápida da V. cholerae cromossoma (s) ⁵ (Figura 1). Este método TransFLP baseia-se na descoberta recentemente indução mediada por quitina de competência natural nesse organismo representativo ⁶ e outros do género, tais como Vibrio V. fischeri ^7. Competência natural permite a captação de ADN livre, incluindo fragmentos de PCR gerados pelo DNA. Uma vez absorvido, o ADN recombina com o cromossoma, dada a presença de um mínimo de 250-500 pb da região flanqueadora homólogo ^8. Incluindo um marcador de selecção de entre estas regiões flanqueadoras permite a fácil detecção de transformantes que ocorrem com frequência. t "> Este método pode ser usado para diferentes manipulações genéticas de V. cholerae e potencialmente também outras bactérias naturalmente competentes. Fornecemos três exemplos novos do que pode ser conseguida por este método, além do nosso estudo publicado anteriormente em deleções de um único gene e do Além da afinidade tag-seqüências ^5. passos de otimização Vários sobre o protocolo inicial de quitina induzida por transformação natural ⁶ são incorporados neste protocolo TransFLP. Estes incluem, entre outros, a substituição de fragmentos de conchas de caranguejos por disponível comercialmente quitina flocos ^8, a doação de PCR locais derivado de ADN como a transformação de material ^9, e a adição de sítios de recombinação FLP-alvo FRT () ^5. DRF permitir a excisão sítio-dirigida do marcador de selecção mediada pela recombinase Flp ^10.

Protocolo

O método TransFLP (Figura 1) é exemplificado por três abordagens diferentes: I) a eliminação de dois genes adjacentes que codificam determinantes de virulência de V. cholerae (por exemplo, ΔctxAB), II) a remoção de uma ilha de patogenicidade (por exemplo, ΔVPI-1), e III) a integração de uma polimerase de RNA dependente de sequência do promotor de T7 a montante de um gene de interesse, o que permite a sua subsequentemente expressão artificial no fundo estirpe respectivo (por exemplo, T7-TFox) (Figura 2).

1. Preparação de Quitina Flakes

1. 50-80 mg de peso de flocos de quitina de um padrão de tubo de plástico de 1,5 ml. Isto pode ser preparado em grandes quantidades. Quitina flocos estão comercialmente disponíveis a partir de Sigma (cat. número C9213).
2. Autoclavar os flocos mantendo as tampas dos tubos aberto.
3. Imediatamente fechar as pálpebras após a autoclave tenha arrefecido.
4. Loja autoclavado quitina flocosà temperatura ambiente.

2. Opcional: Transformação Artificial de V. cholerae com Flp Recombinase-encoding Plasmid

1. Prepare electrocompetentes V. cholerae células utilizando métodos padrão ^11. Armazenar aliquotas de células competentes a -80 ° C.
2. Adicionar 1-2 uL de uma regularidade de mini-preparação de plasmídeo pBR-flp ⁵ ao electrocompetentes V. células cholerae e transferir a mistura para uma cuvete de electroporação (0,2 largura da abertura cm).
3. Aplicar um pulso de 1,6 kV.
4. Adicionar 0,9 ml de meio SOC, gentilmente transferir células de um tubo de ml padrão 14. Incubar sem movimento durante 2,5 a 3 horas a 30 ° C.
5. Ul placa 100 e 300 ul em placas LB contendo 100 ug / ml de ampicilina e incubado a 30 ° C durante a noite.
6. Purificar único clone e armazenar como estoque de glicerol para experimentos TransFLP futuras.

3. Desenho oligonucleótido e Reacção em Cadeia da Polimerase

1. Pelo menos seis oligonucleótidos são necessários para amplificar a região de ADN (s) de interesse, bem como o cassete de FRT-flanqueado antibiótico por PCR (Figura 3). Recomenda-se também incluir um par de oligonucleótidos escorva fora do fragmento de PCR inserido. Isto permite a verificação de integração e a excisão correcta da cassete de resistência FRT-flanqueado antibiótico (por exemplo, descrito como "chk-up" e primers "chk-down" nas Figuras 3 a 5).
2. Projetar os oligonucleótidos # 2, # 3, # 4 e # 5 com cuidado. Eles devem ser suficientemente capazes de hibridar (por exemplo, ~ 28 pb) com o DNA molde. O molde de ADN é ADN genómico (gDNA), para os iniciadores # 2 e # 5, e FRT-Kan-FRT contendo DNA de plasmídeo como pROD17 ¹² e pBR-FRT-KAN-FRT (neste estudo) para os iniciadores # 3 e # 4 ( Figura 3A).
3. Conceber os iniciadores # 2 a # 5 permitindo extensa de emparelhamento de bases na sua extremidade 5 'entre # 2 / # 3 e # 4 / # 5, respectivamente (Figura 3A inset). Duas rodadas de PCR seguir.
4. Realizar três reações independentes de PCR como uma rodada 1 ^º de PCR. A primeira vai amplificar a região a montante do gene / ADN da região-de-interesse com a ajuda de oligonucleótidos # 1 e # 2. A PCR deve resultar num fragmento de pelo menos 500 pb de comprimento que permitem a recombinação homóloga dentro das células. Fragmentos mais curtos (~ 250 pb) pode ser de ⁸ suficiente mas não são recomendados.
5. Em paralelo realizar a segunda PCR, que amplifica a cassete de FRT-flanqueado antibiótico. Para os exemplos fornecidos aqui nós usamos principalmente aph (kan ^R). Oligonucleotídeos uso # 3 e # 4 para essa reação (Figura 3A).
6. Concomitantemente, a amplificação da região de ADN a jusante através de PCR (amostra III). O fragmento de PCR também deve ser de pelo menos 500 pb de comprimento. Realizar a PCR com gDNA como molde e os oligonucleotídeos # 5 e # 6 (Figura 3A).
7. Após a purificação de todos os três PCRfragmentos, realizar a 2 ^ª rodada de PCR. Use uma mistura igual de todos os três fragmentos obtidos no primeiro turno como modelo. A amplificação é catalisada por oligonucleótidos # 1 e # 6. O fragmento de PCR resultante (Figura 3B), que serve como a transformação de ADN na experiência de transformação natural (Figura 1).

4. Quitina induzida Transformação Natural

1. Crescer V. células cholerae aerobicamente em meio rico a 30 ° C até atingirem uma densidade óptica a 600 nm de aproximadamente 0,5.
2. Colheita das bactérias por centrifugação. Lavar pelota uma vez em meio artificial definido (DASW ⁶⁾ antes de ressuspender as células em 2 volumes de DASW. Adicionar 1 ml da cultura para 50-80 mg de estéril quitina flocos (explicado no ponto 1). Se as bactérias porto plasmídeo pBR-flp (opcional ponto 2), adicionar ampicilina (50 ug / ml) à cultura. Incubar a 30 ° C durante 16-24 h sem movimento.
3. Adicionar & ge; 200 ng do fragmento 2 ^ª rodada de PCR-derivada (explicado no ponto 3). Misturar cuidadosamente, sem extensivamente destacando as bactérias da superfície da quitina. Incubar a 30 ° C durante 24 horas sem movimento.
4. Vortex a cultura extensivamente para ≥ 30 seg. Espalhe 100-300 ul em placas LB seletivos médio (por exemplo, kanamicina ou gentamicina placas contendo LB para exemplos fornecidos aqui). Utilizar placas selectivas duas vezes se as bactérias abrigam o plasmídeo pBR-flp adicionando ampicilina concomitantemente com outros antibióticos. Incubar as placas a 30 ° C durante 16-24 horas ou até que as colónias são visíveis.
5. Isolar transformantes individuais de placas selectivas. Tais transformantes ter substituído o locus cromossómico original, pelo fragmento de PCR devido a um evento de crossover duplo. Estas estirpes podem ser directamente utilizados para experiências posteriores, no caso da remoção da cassete de antibiótico não é necessário.

5. Remoção de Cassete Seletivo (s) por FlpA recombinação

1. Artificialmente transformar seus transformantes com plasmídeo pBR flp, conforme descrito no ponto 2 se não for feito antes do ensaio de transformação natural.
2. Crescer as bactérias em placas de agar LB contendo ampicilina a 37 ° C durante 16-24 hr. Opções: mudar a temperatura entre 2-3 horas para a 40 ° C, como expressão de flp de plasmídeo pBR-flp é de-reprimida em ^5,10 altas temperaturas, bactérias transferência para placas frescas após aprox. 8 horas de incubação.
3. Ensaio de sensibilidade aos antibióticos (demonstrado aqui para canamicina; Figura 1) por restreaking os clones em paralelo em placas de agar contendo antibióticos e livre de antibióticos. Isolar o único colônias sensíveis. Congelar ampicilina resistente clone como estoque de glicerol se você pretende modificar ainda mais a tensão com a supressão outro / inserção usando TransFLP.

6. Cura plasmídeo

1. Crescer a cultura durante a noite sob condições aeróbias ea 30 ° C. Use meio rico sem a adição de qualquer antibiótico.
2. Opcional: Crescer cultura fresco por 3-6 horas, diluindo a 1:100 cultura durante a noite em meio livre de antibióticos fresco.
3. Placa raia ou diluição (s) de cultura em placa de ágar LB simples (s) e incubar a 30 ° C durante 8-16 horas (até que as colónias visíveis).
4. Teste para ampicilina sensibilidade dos clones por restreaking os clones em paralelo em placas de ágar contendo antibiótico e antibiótico-livre (Figura 1). Congelar ampicilina cepa sensíveis como o estoque de glicerol.

Resultados

Os resultados representativos das três exemplos são mostrados nas Figuras 4 a 6. A primeira abordagem, que visa suprimir os genes vizinhos ctxA e CtxB. Juntos, eles codificar o principal fator de virulência de V. cholerae, a toxina da cólera. Concebemos oligonucleótidos para o método TransFLP como descrito acima e de acordo com a Figura 3. A estirpe parental, a estirpe portadora do intermediário FRT-flanqueado cassete de resistência a antibióticos no ...

Discussão

O método TransFLP descrito acima e noutros locais ⁵ tem sido extensivamente utilizada no nosso laboratório. O tipo de manipulações genéticas que são viáveis ​​incluem, entre outros: a eliminação de genes individuais e aglomerados de genes, a deleção de ilhas genómicas (por exemplo, VPI-1), a inserção de sequências a montante de um gene de interesse (por exemplo, sequências do promotor) e da inserção sequências na extremidade de um gene específico (por exemplo,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
Quitina flocos	Sigma	C9213	Autoclavagem exigido
OPCIONAL: Micropulser (no caso cassete antibiótico deve ser extirpado por Flp recombinase codificado em pBR-flp)	Biorad	165-2100	Ou electroporators comparáveis