TransFLP - метод генетической модификации<em&gt; Холерный вибрион</em&gt; На основе природных преобразований и FLP-рекомбинации

Melanie Blokesch

doi:10.3791/3761

АВТОРЫ

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

Резюме
Аннотация
протокол
Результаты
Обсуждение
Раскрытие информации
Благодарности
Материалы
Ссылки
Перепечатки и разрешения

Резюме

Быстрый способ изменить геном V. вибрион Описано. Эти модификации включают в себя удаление отдельных генов, генных кластеров и геномные острова, а также интеграции коротких последовательностей (например, промоутер элементов или сродство-теги последовательности). Метод основан на естественной трансформации и FLP-рекомбинации.

Аннотация

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes^1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons^1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene⁴. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)⁵ (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism⁶ and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri⁷. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region⁸. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.

This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences⁵. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation⁶ are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes⁸, the donation of PCR-derived DNA as transforming material⁹, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)⁵. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase¹⁰.

протокол

Метод TransFLP (рис. 1) на примере трех различных подходов: I) удаление двух соседних генов, кодирующих вирулентности детерминанты В. вибрион (например, ΔctxAB); II) удаление островка патогенности (например, ΔVPI-1) и III) интеграция полимеразы T7-зависимой РНК-последовательность промотора перед геном из интереса, который впоследствии позволяет его искусственное выражение в соответствующем фоне деформации (например, T7-tfoX) (рис. 2).

1. Получение хитина хлопья

Вес 50-80 мг хитина хлопья в стандартных 1,5 мл пластиковую трубку. Это могут быть получены в большом объеме. Хитин хлопья являются коммерчески доступными от Sigma (кат. номер C9213).
Автоклав хлопья поддержанию крышки трубы открыты.
Немедленно закройте крышками после автоклав остынет.
Магазин автоклавного хитина хлопьевпри комнатной температуре.

2. Дополнительно: Искусственная трансформация V. вибрион с Flp рекомбиназой кодирования плазмиды

Подготовка электрокомпетентные V. вибрион клеток с использованием стандартных методов ^11. Хранить аликвоты компетентных клеток при -80 ° C.
Добавить 1-2 мкл регулярные мини-подготовка плазмиды PBR-ФЛП ⁵ до электрокомпетентные V. вибрион клеток и передачи смеси в кювете электропорации (0,2 см ширины щели).
Применить импульса на уровне 1,6 кВ.
Добавить 0,9 мл SOC среде, мягко передавать ячейки в стандартном 14 мл трубки. Инкубируйте неподвижные в течение 2,5 до 3 часов при 30 ° C.
Плита 100 мкл и 300 мкл на пластинах LB, содержащей 100 мкг / мл ампициллина и инкубировать при 30 ° C в течение ночи.
Очищают одного клона и магазин как глицерин наличии для будущих экспериментов TransFLP.

3. Олигонуклеотидов Дизайн и полимеразной цепной реакции

По меньшей мере шесть олигонуклеотидов, необходимых для усиления участка ДНК (ы) интерес, а также FRT-окружении антибиотиков кассеты методом ПЦР (рис. 3). Рекомендуется также включать в себя пару грунтовки олигонуклеотидов за пределами вставленного фрагмента ПЦР. Это позволяет проверки интеграции и правильное удаление FRT-окружении антибиотиков кассеты сопротивления (например, изображается как "CHK-вверх" и праймеры "CHK-вниз" на рисунках 3 до 5).
Дизайн олигонуклеотидов, № 2, № 3, № 4 и № 5 с осторожностью. Они должны быть в состоянии в достаточной степени отжига (например, ~ 28 б.п.), в шаблоне ДНК. Шаблона ДНК геномной ДНК (гДНК) для праймеров № 2 и № 5 и FRT-Кан-FRT-содержащие ДНК плазмиды, такие как pROD17 ¹² и СКД-FRT-KAN-FRT (это исследование) для праймеров № 3 и № 4 ( рис. 3а).
Дизайн праймеров № 2 к № 5 позволяет обширная база спаривания на их 5'-конце между # 2 / # 3 и # 4 / # 5, соответственно (рис. 3А вставка). Два раунда ПЦР следовать.
Выполните три независимые реакции ПЦР, как ^1-й раунд ПЦР. Первый из них будет усиливать вверх по течению области гена / ДНК регионе интересов, с помощью олигонуклеотидов № 1 и № 2. ПЦР должно привести фрагмент, по меньшей мере, 500 б.п. в длину, чтобы гомологичной рекомбинации в клетках. Более короткие фрагменты (~ 250 б.п.) может быть достаточным ^8, но не рекомендуется.
Параллельно выполнить второй ПЦР, который усиливает FRT-окружении антибиотиков кассеты. Для примеров, приведенных здесь, мы в основном использовали APH (кан ^R). Использование олигонуклеотидов № 3 и № 4 для этой реакции (рис. 3А).
Одновременно усиливаются вниз по течению области ДНК с помощью ПЦР (третьего образца). ПЦР-фрагмента должна быть не менее 500 б.п. в длину. Выполните ПЦР с гДНК в качестве матрицы и олигонуклеотидов № 5 и № 6 (рис. 3А).
После очистки всех трех PCRфрагментов, выполните ^2-й раунд ПЦР. Используйте равные смесь всех трех фрагментов, полученных в первом туре в качестве шаблона. Усиление катализируется олигонуклеотидов № 1 и № 6. Полученные ПЦР-фрагмента (рис. 3В) служит преобразование ДНК в естественный эксперимент преобразование (рис. 1).

4. Хитин-индуцированной естественное преобразование

Расти V. вибрион клетки аэробно в богатой среде при температуре 30 ° C до достижения оптической плотности при 600 нм примерно 0,5.
Урожай бактерий с помощью центрифугирования. Вымойте гранул один раз в определенный искусственной среде (DASW ⁶⁾ до ресуспендирования клеток в 2 объемов DASW. Добавить 1 мл культуры до 50-80 мг стерильной хитина хлопья (объяснено в пункте 1). Если бактерии гавани плазмиды PBR-ФЛП (дополнительный пункт 2), добавить ампициллин (50 мкг / мл) в культуру. Инкубировать при 30 ° С в течение 16-24 часов без движения.
Добавить & Gе, 200 нг ^2-й круглый ПЦР-фрагмента производных (объясняется в пункте 3). Тщательно перемешать без широкой отсоединения от бактерий хитин поверхности. Инкубировать при температуре 30 ° C в течение 24 часов без движения.
Vortex культуры широко течение ≥ 30 сек. Распространение 100-300 мкл на селективной среде LB пластины (например, канамицин и гентамицин содержащих LB пластины для примеров, приведенных здесь). Используйте двойные селективные пластины, если бактерии питать плазмиды PBR-ФЛП, добавив ампициллина одновременно с другими антибиотиками. Инкубируйте пластины при температуре 30 ° C в течение 16-24 ч или до колонии видны.
Изолировать одного трансформантов с селективным пластин. Такие трансформантов заменили оригинальные хромосомный локус по ПЦР-фрагмента в связи с двойным событием кроссовера. Эти штаммы могут быть непосредственно использованы для дальнейших экспериментов в случае удаления антибиотика кассеты не надо.

5. Удаление Селективный кассеты (ы) FlpРекомбинации

Искусственно превратить ваш трансформантов плазмидной PBR-ФЛП, как описано в пункте 2, если не сделано до того, как природные анализ трансформации.
Рост бактерий на LB агаром, содержащей ампициллин при 37 ° C в течение 16-24 часов. Функции: изменение температуры между течение 2-3 ч до 40 ° C как выражение ФЛП из плазмиды PBR-ФЛП-де-репрессированы при более высоких температурах ^5,10; передача бактерий на свежую пластин прим. 8 ч инкубации.
Тест на чувствительность антибиотиков (продемонстрировано здесь для канамицин, рисунок 1), restreaking клонов параллельно содержащий антибиотик и антибиотиков агаром. Изолировать один чувствительный колонии. Замораживание устойчивых к ампициллину клон как глицерин складе, если вы намерены и в дальнейшем изменять напряжение с другими удаления / вставки использованием TransFLP.

6. Плазмида отверждения

Расти культуры ночи в аэробных условиях ипри 30 ° C. Использование обогащенной среде без добавления любого антибиотика.
Дополнительно: Вырастить свежие культуре в течение 3-6 часов путем разбавления ночь 1:100 культуры в свежую без антибиотиков среды.
Плиты или полосы разбавления (ы) культуры на равнине пластины агара LB (ы) и инкубировать при 30 ° С в течение 8-16 ч (до колонии видны).
Тест на ампициллин-чувствительность клонов restreaking клонов параллельно содержащий антибиотик и антибиотиков агара (рис. 1). Замораживание ампициллин-чувствительного штамма как глицерин акций.